Proteomica e Metabolomica

HPLC SPETTROMETRO DI MASSA

spettro di massa

Il concetto, la logica è sempre uguale, nel primo caso abbiamo messo tutte le

proteine ed avremo lo spettro di massa delle singole proteine, nel secondo caso

abbiamo messo i peptidi ed avremo lo spettro di massa dei singoli peptidi di

quella proteina.

Però capiamo bene che un peptide è piccolo, quindi è più facile che in questo

caso si faccia la sequenza amminoacidica del peptide, quindi lo spettrometro di

massa ci risale dagli spettri di massa alla sequenza amminoacidica.

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DILUIZIONI

Noi a laboratorio abbiamo del materiale ed il materiale va trattato con dei

tamponi, che mi servono per l’estrazione.

Mi servono due tamponi, T1 e T2.

Il tampone in genere è fatto da componenti che hanno una loro precisa funzione

per l’estrazione.

Se guardiamo il tampone T1, abbiamo:

300 mL

0,4 M sorbitolo

50 mM tricina pH 7,8

5 mM MgCl (soluzione madre 1M)

)

10 mM NaCl (soluzione madre 4M)

PM sorbitolo 182,17

PM tricina 179,17

Il sorbitolo è uno zucchero (polvere); si usa una concentrazione alta di zucchero

perché devo fare uno shock osmotico, perché stiamo parlando di cellule vegetali,

quindi in questo preciso caso serve uno shock osmotico elevato, perché la nostra

cellula non ha soltanto la membrana cellulare ma anche la parete, quindi per

rompere questa parete abbiamo bisogno di creare uno shock osmotico.

La tricina a pH 7,8 serve perché lo zucchero ha un pH acido, quindi dobbiamo

neutralizzare questo acido perché l’interno della cellula ha pH 7, quindi lo

dobbiamo portare allo stesso pH.

Il cloruro di magnesio (*+,- ) è un sale che ci serve perché, quando andiamo a

.

fare l’estrazione delle proteine delle cellule vegetali, dobbiamo “tirare giù” tutti i

metalli e alcune proteine che sono non identificative del cloroplasto, sono

proteine di una speciale struttura che si chiama core del fotosistema.

E l’NaCl ha la stessa funzione dell’MgCl , sono sali che servono per eliminare il

)

materiale che non serve, cioè, per esempio, siccome la cellula vegetale come

compito fondamentale ha quello di produrre amido, sappiamo che c’è il ciclo di

Calvin che serve per produrre zucchero, amido, noi non vogliamo questi

zuccheri, ma dobbiamo estrarre le proteine, quindi li dobbiamo complessare e

precipitare, cioè facciamo due accorgimenti: 1) quello di usare i sali che ci

complessano questi zuccheri e li eliminano dal nostro campione; 2) quello di

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tenere il nostro campione al buio per una notte; perché l’amido è fastidioso,

soprattutto perché è pesante quindi “tira giù” le proteine, quindi l’amido non ce

lo dobbiamo avere.

Quindi utilizzando un lavaggio con il primo campione frullato ottengo i

cloroplasti, dopo varie centrifugazioni.

Le centrifugazioni che vado ad effettuare non sono semplici centrifugazioni che

si fanno nelle centrifughe da banco, ma utilizziamo supercentrifughe, che

hanno un numero di rivoluzioni maggiore rispetto ad una centrifuga da banco.

Quando leggiamo nei testi scientifici G, si parla di gravità e invece RPM sono i

numeri di giri, questi due parametri sono caratteristici di ogni rotore, e questi

due parametri sono interconnessi ad una formula.

Passiamo al tampone 2:

200 mL

50 mM sorbitolo

50 mM tricina pH 7,8

10 mM EDTA pH 8.0 (soluzione madre 1M)

PM sorbitolo 182,17

PM tricina 179,17

siccome dai cloroplasti vogliamo estrarre i tilacoidi perché stiamo facendo le

proteine tilacoidali di tutto il tilacoide, dobbiamo comunque rompere la

membrana cloroplastica, che non ha più la parete e quindi ci serve un tampone

più blando.

Sempre un piccolo shock osmotico, però con un sorbitolo di 50 mM, quindi a

concentrazione molto più bassa.

L’EDTA è un chelante dei metalli, perché in realtà quando utilizziamo l’acqua

per fare questi tamponi ci sono dei metalli nell’acqua, che non è mai pura.

Anche qui poi bisogna centrifugare, in questo caso preciso la centrifuga che

viene utilizzata è una supercentrifuga.

È chiaro che se noi, invece, stessimo parlando di cellule animali e volessimo

estrarre i nucleosomi, ad esempio, che sono particelle più piccole useremo

centrifughe a più alti numeri di rivoluzioni, che si chiamano ultracentrifughe.

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Come si fa a preparare i tamponi?

Per fare i tamponi dobbiamo ricordare essenzialmente due formule della

chimica:

Se è polvere:

• 1 ∙456 9:/<=

/= = >? = @ ∙ AB ∙ B

à

78 78

Se è liquido:

•

questa soluzione deve essere più concentrata perché la dobbiamo diluire, quindi

entrano in gioco le formule per le diluizioni:

9:

CDE = F° CDEH = / ∙ I / ∙ I = / ∙ I oppure B ∙ @ = B ∙ @

à à 7 7 ) ) J J K K

<=

perché il numero di moli iniziali deve essere sempre uguale al numero di moli

finali in una reazione chimica.

Quindi se abbiamo una soluzione iniziale ad una certa concentrazione, con un

certo numero di moli, quella soluzione finale, diluendo la prima, deve avere

sempre lo stesso numero di moli.

Prendiamo il tampone T1:

Devo calcolare i grammi di sorbitolo:

§

>? = @ ∙ AB ∙ B

V = 300 mL = 0,3 L

PM = 182,17

M = 0,4 LM = 0,3 ∙ 182,17 ∙ 0,4 = 21,8 LM TH UDMVHWDED

Ora facciamo lo stesso con la tricina:

§

>? = @ ∙ AB ∙ B

V = 300 mL = 0,3 L

PM = 179,17 14

$

M = 50 mM = 50∙ 10 M $

LM = 0,3 ∙ 179,17 ∙ 50 ∙ 10 = 2,7 LM TH WMHZHF[

Ora dobbiamo calcolare il volume iniziale di MgCl :

§ )

B ∙ @ = B ∙ @ quindi siccome dobbiamo trovare @ , faremo:

J J K K K

B ∙@

J J

@ =

K B K $

M = 5 mM = 5 ∙ 10 M

\

V = 300 mL = 0,3 L

_

M = 1 M (soluzione madre)

a $

(5 ∙ 10 ) ∙ 0,3

I = = 0,0015 e = 1,5 Ce TH /LfE

b )

1 /

Ora facciamo la stessa cosa per l’NaCl:

§

B ∙ @ = B ∙ @ quindi siccome dobbiamo trovare @ , faremo:

J J K K K

B ∙@

J J

@ =

K B K $

M = 10 mM = 10 ∙ 10 M

\

V = 300 mL = 0,3 L

_

M = 4 M (soluzione madre)

a $

(10 ∙ 10 ) ∙ 0,3

I = = 0,00075 e = 0,75 Ce = 7,5 ge TH h[fE

b 4 /

Lo stesso procedimento lo facciamo per il tampone T2:

Devo calcolare i grammi di sorbitolo:

§

>? = @ ∙ AB ∙ B 15

V = 200 mL = 0,2 L

PM = 182,17 $

M = 50 mM = 50∙ 10 M $

LM = 0,2 ∙ 182,17 ∙ (50 ∙ 10 ) = 1,82 LM TH UDMVHWDED

Ora facciamo lo stesso con la tricina:

§

>? = @ ∙ AB ∙ B

V = 200 mL = 0,2 L

PM = 179,17 $

M = 50 mM = 50∙ 10 M $

LM = 0,2 ∙ 179,17 ∙ 50 ∙ 10 = 1,79 LM TH WMHZHF[

Ora dobbiamo trovare il volume iniziale di EDTA:

§

B ∙ @ = B ∙ @ quindi siccome dobbiamo trovare @ , faremo:

J J K K K

B ∙@

J J

@ =

K B K $

M = 5 mM = 5 ∙ 10 M

\

V = 200 mL = 0,2 L

_

M = 1 M (soluzione madre)

a $

(5 ∙ 10 ) ∙ 0,2

I = = 0,02 e TH ijkl

b 1 / 16

CONCENTRAZIONE PROTEICA

Per fare la concentrazione proteica ragioniamo in un altro modo, cioè, della

soluzione data dobbiamo fare 4 diluizioni:

1:2 1:5 1:10 1:100

e si può utilizzare sempre questa formula:

B ∙ @ = B ∙ @

J J K K

però è un ragionamento lungo, quindi c’è un procedimento più immediato, anche

se deriva dal precedente, ed è questo:

una volta estratte le proteine, queste vanno quantificate.

Dobbiamo fare la concentrazione proteica.

Su cosa si basa la concentrazione proteica?

Si basa sul fatto che dobbiamo fare una serie scalare di diluizione di una

proteina nota ed andiamo a confrontare le nostre proteine su una curva che si

chiama curva standard di una proteina nota.

Come si fa a fare la curva standard?

Andiamo in laboratorio e prendiamo una proteina, che è la BSA, che ha una

concentrazione iniziale di 1 M, preparata secondo la formula che già sappiamo,

abbiamo pesato dei grammi e ne abbiamo fatta 1 mL (1000 µL), quindi abbiamo

la nostra soluzione madre, che abbiamo preparato pesando i nostri grammi

dell’albumina, di cui conosco il peso molecolare e abbiamo fatto la nostra

soluzione madre.

Stiamo costruendo la curva di taratura o retta di taratura, e quindi risalire alla

concentrazione nei vari punti, dobbiamo fare delle diluizioni.

Questa curva ci serve per conoscere la concentrazione del campione, per fare

questo partiamo da una concentrazione di proteina nota (BSA), che ha

concentrazione 1 M.

Piuttosto che dire 1 M, perché della proteina albumina lo posso dire, ma del

nostro campione non lo possiamo dire, diciamo che abbiamo preso 1 mg e lo

abbiamo sciolto in 1 mL (1mg/1mL), quindi questo è un altro modo di esprimere

la concentrazione, che se andiamo a dividere per il peso molecolare ci viene 1 M.

Quindi dobbiamo fare le diluizioni, siccome dobbiamo fare una retta, dobbiamo

fare minimo 2 diluizione, però in questo caso ne facciamo 4.

Facciamo 4 provette in cui abbiamo fatto 4 diluizioni del nostro campione di

partenza.

È importante conoscere il volume finale, cioè su quale volume finale andiamo a

fare queste diluizioni, e facciamo sempre 1 mL per tutte 4 le diluizioni.

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1) Diluire il campione 1:2, che significa?

Significa che abbiamo il 50% del campione e il 50% del volume finale, cioè

avremo 1+1, una parte di campione e una parte di acqua.

Quindi prendiamo 500 µL di campione e 500 µL di acqua.

Siccome stiamo facendo una curva di taratura, e siccome questa curva di

taratura presuppone una lettura, perché dobbiamo sapere quanta proteina è

presente, quindi qual è la concentrazione dell’albumina.

È vero che è 1:2, ma quantitativamente quanto legge?

Quindi dobbiamo andare ad un densitometro, spettrofotometro in questo caso, e

metterci questa provetta, dobbiamo tramutare questa quantità in lettura

quantitativa.

Per fare questo però, siccome l’albumina è incolore perché è una proteina, tutte

le proteine sono incolori, tranne quelle con il gruppo prostetico che sono

colorate le posso leggere nel visibile, ma tutte le proteine sono incolori,

assorbono nell’UV, allora aggiungiamo al nostro campione un colorante, che si

chiama blu di bromofenolo.

Che cosa andiamo a sottrarre nella nostra provetta per aggiungere il colorante?

Andiamo a sottrarre un certo volume di acqua per aggiungere il colorante, ma il

volume finale deve essere sempre 1 mL.

Quindi nella diluizione 1:2 avrò:

500 µL di campio