proteine circolanti

Lezione 2- biochimica clinica

Metodi per la misurazione delle proteine sieriche

A) Gel di agarosio (polisaccaride di unità di galattosio): colorazione con blu di

Coomassie e conversione in protidogramma tramite uso del densitometro.

B) Elettroforesi su membrana

C) Elettroforesi capillare (prediletta in caso di scarsa quantità di campione)

Vantaggi dell’elettroforesi capillare:

Non ha bisogno di una colorazione

 Detector con raggi UV attraverso cui viene fatto passare il campione

 (precedentemente sottoposto ad elettroforesi); questo detector identifica le

diverse bande delle proteine che man mano escono dal sistema.

L’elettroforesi capillare è la tecnica utilizzata nei laboratori più avanzati. Come

funziona?

Avviene in fase liquida, avviene all’interno di un capillare molto sottile (diametro

intorno a 20-80 μm) che contiene della silice fusa. All’interno è presente una

soluzione elettrolitica. Questo metodo di analisi è un metodo molto rapido, impiega

infatti circa 5 min, ed è ad alta risoluzione, il che significa che permette di

evidenziare con maggiore precisione le diverse frazioni di un protidogramma (rileva

variazioni anche molto piccole, che non sarebbero evidenziabili tramite elettroforesi

su membrana o su gel di agarosio).

Si serve di un alto voltaggio: 8-15 kV.

Differenze tra elettroforesi su gel di agarosio ed elettroforesi capillare

Elettroforesi su gel di agarosio alimentatore, anodo (polo positivo) e catodo (polo

negativo). La proteine sono cariche negativamente e migrano dunque dal catodo

verso l’anodo.

Elettroforesi capillare alimentatore in cui viene istaurata una differenza di

potenziale, un anodo carico positivamente e un catodo carico negativamente. Un

capillare molto sottile viene introdotto all’interno dei contenitori con all’interno la

soluzione tampone; l’applicazione del campione nel tubicino non viene eseguita

manualmente, ma è tutto automatizzato, c’è un autocampionatore.

La soluzione contenuta all’interno del capillare ad un certo punto passa all’interno di

un rivelatore UV che legge le proteine grazie alla presenza di una sorgente di raggi

UV; queste informazioni vengono poi inviate ad un sistema di acquisizione di dati,

che consente la quantificazione del campione.

Qual è la differenza fondamentale tra elettroforesi su gel di agarosio ed elettroforesi

capillare?

La direzione di migrazione delle proteine. Nel primo caso vanno dal catodo verso

l’anodo, nell’elettroforesi capillare dall’anodo verso il catodo; tutto ciò dipende dalla

composizione interna del capillare.

Se spacchiamo longitudinalmente il capillare vediamo che è rivestito internamen