Prof A.Bedini - Analisi dei farmaci III e degli alimenti

N

di piatti teorici della colonna e suo essere definita

cosi ( formula).

Piatto teorico: essendo la cromatografia un processo

in continuo, si può immaginare che la colonna sia

divisa in N sezioni, in ciascuna viene raggiunto

l’equilibrio tra fase stazionaria e fase mobile. Ognuna

di queste sezioni è un piatto teorico. È una sezione

della colonna che consente di realizzare un equilibrio

reversibile di distribuzione di un componente fra le fasi.

Definisco H o HETP: l’altezza equivalente ad un piatto

teorico.

Se H è piccolo —> le bande sono strette —> migliore

separazione.

HETP dipende dalla dimensione delle particelle della FS, dall’impaccamento della

colonna e dalla velocità della FM.

Tanto maggiore è il numero di piatti teorici, tanto maggiore è l’efficenza della colonna.

L’efficenza di una colonna dipende dal fatto che i picchi siano meno allargati.

Selettivita (fattore di separazione)

La selettività mi esprime la capacita del sistema

cromatografico di eluire in tempi differenziati specie

chimiche diverse o simili .

alfa è sempre maggiore di uno.

Risoluzione

La risoluzione di una colonna cromatografica è la misura

quantitativa della sua efficenza nella separazione degli

analiti (è diversa dalla selettività). Una buona

separazione puo

derivare da una buona efficenza ( picchi stretti e

numero di piatti teorici elevato) e fa una buona

differenziazione del comportamento dei soluti

(selettività).

Solitamente si lavora con una risoluzione >= 2.

Altra formula per

calcolare la Risoluzione : dove k’ è il fattore di ritenzione

della specie che si muove più lentamente .

Parametri per una buona risoluzione : allungare la colonna e ridurre l’HETP; modificare k’

attraverso T in (GC)o la composizione della FM in cromatografia liquida; modificare alfa :

FM,FS,T o usando particolari additivi alla FM.

Asimmetria dei picchi

L’asimmetria dei picchi può essere responsabile di una scarsa risoluzione .

Fronting : è un tracciato che sale lentamente e scende bruscamente

Tailing: tracciato che sale bruscamente e scende lentamente.

Le cause di cio potrebbero derivare dal fatto che l’analita è fortemente adsorbito, subisce

decomposizioni, il carico è troppo eccessivo.

Le soluzioni potrebbero essere aumentare la ritenzione, aggiustare le condizioni

cromatografiche, modificare il sistema cromatografico.

Fattore di simmetria AF= b/a , deve essere compreso tra 0.9 e 1.2

a e b sono larghezze della meta anteriore e posteriore del picco a 10% di altezza.

Eluizione in gradiente

Eluizione a gradiente, metodo nel quale viene utilizzata come fase mobile una

miscela di solventi la cui composizione viene fatta variare in modo continuo durante

il processo di eluizione. Facendo un eluizione a temperatura costante (isoterma) si

ha uno scarso cromatogramma, bisogna quindi trovare un compromesso tra il

solvente e la variazione di temperatura.

Allargamento delle bande cromatografiche

Allargamento delle bande

Molecole di uno stesso composto, pur avendo lo stesso fattore di capacità, impiegano

intervalli di tempo diversi per attraversare la colonna.

H dipende dalla diffusione vorticosa, diffusione longitudinale e trasferimento di massa.

Diffusione vorticosa (A)

Si hanno percorsi più simili se le particelle sono più piccole e regolari, e se si ha un

impaccamento omogeneo.

Diffusione longitudinale (B)

È la conseguenza di un gradiente di concentrazione. Per questo effetto più l’analita

percorre lentamente la colonna maggiore è la diffusione . É importante in GC e

trascurabile in LC.

Trasferimento di massa (C)

L’allargamento della banda in questo caso si verifica poichè il movimento del soluto

all’interno della FM o della FS non è abbastanza veloce da mantenere una distribuzione

all’equilibrio del soluto tra le due fasi.

Una elevata velocità del flusso impedisce il raggiungimento

dell’equilibrio (tempo per raggiungere l’equilibrio).

Se si ha resistenza al trasferimento nella fase mobile si ha una

granulometria irregolare risolvibile con particelle più piccole e

sferiche .

Mentre una resistenza al trasferimento nella fase stazionaria è

dovuto ad una fase stazionaria irregolare.

EQUAZIONE DI VAN DEEMTER ci descrive l’efficenza della cromatografia.

u= velocità lineare media FM

A= coefficente di cammino multiplo

B= Coeff. di diffusione molecolare

longitudinale

C= coefficiente di trasferimento di

massa

H= altezza equivalente del piatto

teorico.

Cromatografia planare

É una tecnica ampiamente riportata

nelle monografie della EP 7.0ed.

Versatile e consente la rivelazione di impurezze anche in tracce. Usata sia in analisi

qualitativa e quantitativa.

Cromatografia su carta

È una tecnica cromatografica di ripartizione liq-liq di semplice realizzazione e

comunemente usata. Impiega una particolare carta da filtro altamente idrofilia come

supporto per la fase stazionaria.

La fase stazionaria è in cellulosa in grado di assorbire umidità dall’atmosfera fino ad un

22%.

La fase mobile sono solventi organici saturi di acqua ( se immiscibili) o che ne contengono

una certa percentuale (se miscibili). Ciò garantisce la saturazione della cellulosa.

Le diverse sostanze si muovono con una velocità che dipende dal loro coefficiente di

ripartizione tra la FM formata dal solvente organico e la FS formata dall’acqua.

Ovviamente i composti più polari sono trattenuti ( instaurando subito legami ad H con

l’acqua). È impiegata sopratutto per sostanze polari in quanto quelle apolari fluiscono

troppo velocemente.

La tecnica monodimensionale ascendente ( capillarità) dove la carta viene posta nella FM

e il liquido sale dal basso verso l’alto , mentre discendente (gravita) dove la carta viene

posta nella FM ma sono le macchie negli ‘spot’ che scendono per gravita separandosi.

Discendente: l’eluizione avviene in tempi più brevi, inoltre si amplifica lo spostamento delle

sostanze meno mobili.

Cromatografia su strato sottile (TLC)

É una tecnica cromatografica di adsorbimento (solido-liquido) comunemente su gel di

silice o allumina.

Si puo anche modificare le fasi stazionarie per esempio viene trattato il gel di silice con

KOH per sostanze basiche salificate, oppure silanizzata oppure keiselguhr come supporto

inerte da impregnare una FS liquida.

SERIE ELUOTROPICA : Più il mio solvente FM è polare più aumenta il potere eluente con

fase stazionarie polari mentre diminuisce il potere con fasi stazionari apolari.

La rivelazione dei composti avviene attraverso UV (254 e 366 nm) non distruttiva.

O attraverso dei reattivi di visualizzazione (KMnO4,ninidrina) ed è distruttiva.

È possibile anche effettuare cromatografie bidimensionali . prima di posiziona il gel di silice

in verticale e si fa eluire verticalmente poi si ruota in orizzontale il gel di silice e si fa eluire

orizzontalmente.

Applicazioni analitiche della TLC in Farmacopea:

Usata in saggi qualitativi di riconoscimento come conferma di identità di una sostanza per

confronto con uno standard, utilizzando opportuni eluenti ed eventualmente reagenti

cromogeni.

Utilizzata per saggi limite per le impurezze dove si imposta negli ‘spot’ l’impurezza a

struttura nota e l’impurezza a struttura incognita. I saggi limite sono procedimenti

semiquantitativi che permettono di determinare se, in un campione, le impurezze sono

presenti in quantità superiore o inferiore ad un limite stabilito.

HPTLC:High Performance TLC

Ci fornisce separazioni migliori utilizzando gel di silice di dimensioni ridotte rispetto alle

TLC standard (2-10micrometri contro i 2-25 micrometri) e quindi di un maggiore numero di

piatti teorici. Molto utilizzata nell’analisi quantitativa e qualitativa di sostanze

farmaceutiche.

Le separazioni cromatografiche TLC e HPTLC vengon frequentemente impiegate per

analizzare intermedi o come test di purezza di sostanze sia nella fase di ricerca che di

sviluppo di un farmaco.

Il saggio limite per le impurezze a struttura nota confronta fra l’area della

macchia di una soluzione concentrata dell’analita con quella di macchie

ottenute da soluzioni diluite di standard a concentrazione nota, seminati

ed fluiti in parallelo al campione. L’analisi ci consente di verificare se

l’impurezza è presente anche oltre un determinato limita. Il test è

superato se la macchia dell’impurezza non ha intensità maggiore di

quella dello standard.

Mentre il saggio limite per le impurezze a struttura incognita si assume che questa

impurezza, a parità di concentrazione, no produce una macchia di intensità simile a quella

della sostanza saggiata ( sostanze correlate) .

Si va a seminare volumi uguali della soluzione a

concentrazione nota de campione da analizzare, e dello stesso a diluizioni note.

Nell’esempio io ho la soluzione della codeina al 4% e difianco la codeina allo 0,04% ossia

diluita di 100 volte e vedo che le impurezze no sono presenti per cui sono impurezze

sicuramente inferiori all’1%.

In alcuni casi la TLC rappresenta un test di purezza supplementare rispetto alla HPLC.

Secondo infatti l’attuale monografia della EP 7.0ed alcune impurità del nandrolone

decanoato devono essere rilevate tramite HPLC, ma tre di esse non mostrano

assorbimento UV, quindi possono solo essere evidenziate per TLC.

TLC quantitativa : fotodensitometri

L’intensita delle macchie è funzione della quantità di prodotto presente.

I fotodensitometri : sono apparecchi che illuminano le singole macchie con un pennello di

luce lungo la direzione di eluizione oppure a zig-zag ed analizzano la quantità di luce

trasmessa ( se la latrina è trasparente) oppure luce riflessa o emessa per fluorescenza.

Possono esserci delle problematiche nella valutazione dell’intensità della macchia, poiche

dall’analisi vengono prodotti picchi cromatografia veri e proprio la cui area è proporzionale

alla concentrazione e quindi costruendo un’opportuna retta di taratura è possibile risalire

alla concentrazione di ogni componente del campione.

Esiste anche dei metodi indiretti per le determinazioni quantitative tramite TLC:

Consiste nell’asportare la macchia, fluirla con un volume noto di solvente ed analizzare la

soluzione risultante con una qualsiasi tecnica convenzionale confrontando il risultato con

quello poi di una macchia derivante dalla eluizione di uno standard che è già noto. ( in

questo caso la TLC serve solo per separare la miscela perché poi l