Prof A.Bedini - Analisi dei farmaci III e degli alimenti

SPETTROSCOPIA UV-Vis

( UV 200-400 nm Vis 400-800 nm)

Spettroscopia di assorbimento molecolare che promuove

cambiamenti dell’energia elettronica della molecola.

Come ben sappiamo = 200-800 nm. La spettroscopia Uv-Vis è una tecnica di

assorbimento molecolare usata in chimica analita , quando un fotone ultravioletto

o visibile viene assorbito da una molecola, questa passa dal suo stato elettronico

fondamentale ad uno stato elettronico eccitato.

Ricordiamo che l’energia di una molecola è quantizzata. Energia totale è la somma

dell’energia elettronica (UV) + vibrazione (IR) + rotazionale (microonde) +

traslazionale + di spin nucleare (NMR).

Quindi l’interazione con queste radiazioni UV-Vis può provocare la transizione di un

elettrone da un orbitale molecolare di legame o di non legame ad un orbitale di anti

-legame vuoto e quindi il passaggio della molecola ad uno stato eccitato.

In Spettroscopia la TRASMITTANZA è la frazione di luce incidente ad una data

lunghezza d’onda che attraversa un campione .( detto in parole semplici è il

rapporto tra l’intensità della luce P in uscita dalla cuvetta e l’intensità P0 della luce

che entra/incidente) T= P/P0 e varia tra 0 e 1 . (P è il flusso della radiazione

elettromagnetico ossia la densità di corrente termica trasmessa ) . Se voglio

conoscere la trasmittanza in % basta fare T%= 100*T

L’ASSORBANZA invece è la quantità di luce che viene assorbita da un corpo.

A= -log T (base10) e varia da 0 a infinito.

Quindi possiamo dire che sia T che A dipendono da della radiazione impiegata.

Quando parliamo di uno spettro UV-Vis parliamo di un grafico dove si riporta

l’intensità della radiazione assorbita dal campione (A) in funzione della lunghezza

d’onda o frequenza della radiazione stessa. Ovviamente ogni sostanza ha un

particolare spettro di assorbimento, e ciò ci permette di identificare una sostanza

( confrontandola direttamente con campioni noti o con altre banche dati di spettri )

o di controllarne il grado di purezza.

Legge di Lambert-Beer

È una relazione che correla la quantità di luce assorbita da un mezzo alla

concentrazione ed allo spessore del mezzo attraversato. Ossia ci dice che

l’assorbanza dipende dalla concentrazione dell’analita e dalla lunghezza del

cammino ottico.

Ragioniamo : Supponiamo che una luce monocromatica di intensità P0 colpisce

una soluzione che è dentro una cuvetta. Sia l’intensità del raggio che emerge dalla

parte opposta P , noi possiamo dire che P-P0 è la luce assorbita dal campione.

Scriviamo quindi l’assorbanza come A = log P0/P . Cosa ci dice la legge di

Lambert-beer che l’assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione

A = K*b*c K

della soluzione contenuta nella cuvetta quindi dove è il coefficiente di

assorbimento molare/assorbanza specifica , dipende dal tipo di solvente, dalla

b

lunghezza d’onda e dalla specie chimica. è il cammino ottico ossia lo spessore

c

della cuvetta che attraversa la luce (cm) . è la concentrazione della soluzione

contenuta nella cuvetta (mol/L).

Trasmittanza vs concentrazione

La trasmittanza T non è lineare rispetto la concentrazione e

diminuisce in modo esponenziale in rapporto alla concentrazione c

dell’analita ed alla lunghezza del percorso della luce b nel seguente

modo T=10^-kbc.

Assorbanza vs concentrazione

Come abbiamo detto l’assorbanza è direttamente proporzionale

alla concentrazione per cui la retta sarà lineare.

ASSORBANZA SPECIFICA O MOLARE K

A = Kbc

dove c in g/L è K = a (assorbività)

c in % p/v (g/100ml) K = A (1%,1cm) o E (1%,1cm) (assorbanza specifica/

estinzione specifica)

c in M (moli/L) K = (assorbanza molare/estinzione molare)

Queste costanti per specifiche lunghezze d’onda sono caratteristiche del

composto in analisi, si riferiscono ad una cella di lunghezza 1 cm e dipendono

anche dalla natura del solvente e dal pH.

Conversione con MW noto:

Applicazioni in Farmacopea:

Nei prodotti farmaceutici ,concentrazioni e quantità si esprimono in grammi o

milligrammi piuttosto che in moli e quindi per l’analisi di questi prodotti la A di

Lambert-Beer si scrive A = A (1%,1cm)*b*c

dove A è l’assorbanza misurata, A (1%,1cm) è l’assorbanza di una soluzione all’

1% p/v (1%,1cm) in una cella da 1 cm; b è il percorso ( 1 cm) ; c la concentrazione

g/100ml.

Linearità della legge di Lambert-Beer

La legge di Lambert è valida solo per le soluzioni diluite e per radiazioni

monocromatiche.

Questa legge afferma che ci dovrebbe essere linearità tra la concentrazione e

l’assorbanza come abbiamo visto poichè sono direttamente proporzionali.

Succede pero che in alcuni casi si ha delle deviazione della diretta proporzionalità

tra queste due variabili, deviazioni che risultano tipo in una incurvatura verso l’alto

(deviazione positiva) o verso il basso (deviazione negativa) .

Aumentando la concentrazione, aumentano le forze interioniche e/o intermolecolari

e possono formarsi molecole o aggregati di particelle più complesse, diverse per

struttura da quelle in esame, per cui si potrebbe avere uno spostamento del

massimo di assorbimento. E lo stesso aumentando sempre la concentrazione si ha

un aumento dell’indice di rifrazione e quindi una maggiore dispersione del raggio

nell’attraversare la soluzione stessa.

Rimane lineare fino a circa 1.5/2 unita di A. Non bisogna scendere troppo (0,3-0,4)

perché poi il rumore di fondo diventa consistente.

Le concentrazioni di 1-2mg/100ml sono sufficienti per composti fortemente

assorbenti (A specifica = 1000-200).

Le deviazioni possono essere dovute :

- fattori strumentali come per esempio se si ha luce diffusa (ossia che tipo la

radiazione di lunghezza d’onda che giunge al rivelatore è diversa da quella

selezionata) o la radiazione non è monocromatica

- fattori chimici per esempio se il campione si dissocia o associa in soluzione o se

il campione è fluorescente.

Possibili interferenze ? Bianco.

Oltre che dall’assorbimento la riduzione dell’intensità del raggio incidente può

essere determinata anche da altri effetti che interferiscono nell’analisi , tipo:

- riflessione della radiazione sulla superficie delle pareti della cella

- diffusione per la presenza di microparticelle ( il soluto non è ben sciolto)

-

assorbimento da parte del solvente a basse

Per compensare questi effetti si fa passare la radiazione incidente anche attraverso

il bianco e poi si va a paragonare le due intensità.

Scelta della lunghezza d’onda analitica

Nell’analisi quantitativa è essenziale scegliere bene la lunghezza d’onda .

Si sceglie di solito una che :

- abbia la massima specificità

- l’assorbimento sia massimo : per motivi di sensibilità , se l’assorbimento è

elevato è possibile rilevare variazioni di assorbanza per definite variazioni di

concentrazione dell’analita.

-

sia al centro di un picco largo : per motivi di precisione, piccole variazioni di

portano a minimi errori sulla misurazione dell’assorbanza.

Attraverso questa legge se la linearità è verificata sperimentalmente, si può

determinare la concentrazione di un farmaco in un campione mediante misure di A

di una sua opportuna soluzione.

Retta di calibrazione

Quando si ha una sostanza in esame e non si conosce la relativa assorbanza

specifica si va a costruire una retta di taratura tra assorbanza e concentrazione.. SI

preparano una serie di concentrazioni note della sostanza in analisi pura e disciolta

in un solvente , si fa il bianco con la cuvetta piena solamente di solvente e poi si va

a leggere le varie assordante delle soluzioni a diverse concentrazioni. Per

determinare poi la concentrazione incognita del campione basta diluire la

soluzione , determinare il valore di assorbanza e grazie alla retta creata andare a

cercare il valore di concentrazione corrispondente.

La retta ha un equazione y= a+bx essendo lineare a = 0 si ha

quindi y = bx .

Il coefficiente angolare (pendenza della retta) equivale

all’assorbanza molare se la concentrazione è M alla A

specifica (1%, 1cm) se la concentrazione è % p/v.

Spettroscopia UV-Vis : aspetti pratici e

strumentazione .

Lo spettrofotomero UV-Vis è lo strumento utilizzato per l’analisi spettrofotometrica,

è costituito da :

-una sorgente che fornisce una radiazione continua sulle lunghezze d’onda di

interesse.

-un monocromato che seleziona radiazione di diversa lunghezza d’onda dallo

spettro della sorgente

-rivelatore che converte la radiazione elettromagnetica in energia elettrica (segnale)

L’intensita del raggio uscente P viene letta dal detector , ma quella del raggio

incidente ?

Si ipotizza T=1 e P0=P letto contro il bianco ( azzeramento) poiche il bianco è privo

di assorbimento (visto che non ha il soluto), l’intensità della radiazione che lo

attraversa P0 corrisponde all’intensità del raggio di entrambe bianco e non.

Quindi l’intensità del raggio incidente è uguale a quello che si ha avuto

precedentemente quando si è messo il bianco, solo avendo questa volta qualcosa

disciolto nella mia soluzione che assorbe, il raggio in uscita P varia .

Sorgente

Lampada ad incandescenza

Per il visibile la lampada a filamento di tungsteno (350-900nm) dove l’emissione

varia con la temperatura e non emette nella regione ultravioletta .

Lampada a deuterio (190-350nm)

Questa lampada a deuterio o ad idrogeno non emette nel visibile ma si nell’UV. Il

bulbo della lampada è infatti riempito di questo isotopo che viene eccitato tramite

scarica elettrica.

Monocromatore

È costituito da due parti : un elemento disperdente un filtro ottico/banda passante.

Esso riesce a scomporre la radiazione policromatica emessa in bande

monocromatiche. Infatti queste diverse radiazioni policromatiche incidenti vengono

deviate con angoli diversi e una di queste passa attraverso la fenditura.

Mezzo disperdente :

Il prisma è in grado di disperdere le radiazioni con diversa grazie al fenomeno

della rifrazione : quando un raggio di luce passa da un mezzo ad un altro subisce

una deviazione ovviamente radiazioni con diversa hanno diversa deviazione.

I reticoli anche loro svolgono la stessa funzione del prisma, ma il loro

funzionamento é basato sulla riflessione. Sono formati da dei solchi su una

superficie lucida a distanza ravvicinata: il fenomeno è quello che si osserva

guardando per obliquo un CD .

La banda passante e il mezzo disperdente influenzano la monocromatica della

radiazione.

Se la larghezza della fessura è troppo elevata si perde la monocromaticità ( la K è

)

riferita ad una specifica e si perde la struttura fine nello spettro.

Se è troppo stretta si ha una riduzione dell’energia incidente, un più basso

rapporto segnale/rumore e quindi una minor precisione. La farmacopea

2nm

raccomanda .

La cella di lettura ossia la cuvetta

Si usano quelle usa e getta se siamo nel visibile fatte di plastica o vetro mentre ci

sono anche quelle in quarzo . Contiene circa 3 ml di soluzione.

Rivelatore Uv in cromatografia liquida

Ha configurazione a Z per aumentare il cammino ottico e quindi la sensibilita.

Solvente

Un requisito è che sia trasparente alla frequenza

analitica. Per ogni solvente esiste una lunghezza d’onda

minima , al di sotto della quale non può essere usato

perché assorbe troppo. Se possibile meglio usare solventi non polare, in quanto le

interazioni forti fra solventi polari e soluti comportano la perdita della struttura fine

e quindi una perdita di informazioni utili.

Lo strumento puo essere a monoraggio o a doppio raggio.

Quello a monoraggio l’assorbimento è letto solo su una cella ed è necessario il

bianco di riferimento. È usato quando si deve fare una lettura ad una sola

lunghezza d’onda (quantitativa) ma è difficile fare uno spettro.

Mentre per quello a doppio raggio l’assorbimento del bianco viene sottratto

all’assorbimento della cella con il campione . Evita che si debba fare manualmente

il continuo confronto con il bianco e legge continuamente la differenza fra la

radiazione che passa per il campione per il bianco. Le due intensità P e P0

raggiungono il dispositivo di lettura che poi determina il rapporto.

Il moderno strumento a monoraggio da si che il bianco viene registrato e

mantenuto in memoria dalla macchina poi si esegue la lettura della sostanza e

calcola direttamente lui la differenza e mi da direttamente lo spettro. Si può fare sia

una lettura ad una frequenza (quantitativa) che ottenere l’intero spettro (qualitativa).

Il monoraggio a serie di diodi. (DAD 190-800nm)

Legge all’istante tutte le frequenze : ha centinaia di fotodiodi ( che sono rivelatori ,

o meglio, sensori ottici che sfruttano l’effetto fotovoltaico per riconoscere una

lunghezza d’onda incidente e trasformarla in un segnale elettrico)

Il vantaggio di cio è la rapidità e riproducibilità di lettura istantanea di tutto lo

spettro. Importante per le letture all’uscita di una colonna cromatografia dove

queste devono essere effettuare in più fretta possibile.

Lo svantaggio è che si ha minore risoluzione, l’intensità della radiazione può

decomporre la sostanza o dare fluorescenza anche se il tempo di esposizione del

campione alla radiazione UV è comunque ridotto.

Spettroscopia UV-Vis : applicazioni

Aspetti qualitativi

La spettroscopia ci fornisce informazioni sul tipo di cromoforo (sistema di elettroni

pi greco, atomi uniti da legami multipli) ed è un analisi che molto spesso è

prescritta dalla Farmacopea. max, min,

I parametri di uno spettro UV : Amax/Amin.

Schema generale :

Non esistono procedure standardizzate per identificare un cromoforo. In generale

si deve tenere conto sia della complessità dello spettro (numero di bande) sia della

loro intensità (valore di Kmax) . Ricordiamo che :

- un sistema alifatico con coniugazione estesa o un sistema aromatico

policondensato presentano molte bande strette nella regione del visibile .

- un sistema con poche coniugazioni presenta una sola banda (o poche )nel UV

- cromofori semplici (diene coniugato o chetoni alfa-beta insaturi ) hanno valori di

K compresi tra 10 000 e 20 000 .

- Le transizioni n—>* danno valori di K basso (tra 10 e 100 ) nel UV

- I sistemi aromatici danno bande di intensità e posizioni diverse (K tra 1000 e

max

10000, sia nell’UV che nel visibile) in base ai sostituenti presenti

nell’anello.

- Se si osserva uno shift batacromico e ipercromico nello spettro registrato in

soluzione basica rispetto a quello in soluzione acida, si è probabilmente in

presenza di un gruppo acido.

- se, viceversa, si osserva uno shift ipsocromico e ipocromico, si è in presenza di

un gruppo basico.

Effetto del pH

Anche il pH ha effetti nella spettroscopia come possiamo

vedere nello spettro del paracetamolo. Curva A in soluzione

acida, curva B in soluzione basica.

Analisi quantitativa UV-Vis di un principio attivo

Si procede a questa analisi grazie alla legge di Lambert-Beer

in base all’Assorbanza specifica di lettura, in riferimento ad uno standard , dopo

estrazione per eliminare le interferenze e in seguito a derivatizzazione/

complessazione.

Reazioni specifiche e analisi UV-Vis

Si procede a formare dei complessi grazie ai reattivi di shift AlCl3 e AlCl3/HCl.

Un esempio di analisi enzimatica UV-Vis è dell’acido urico dove in questo caso

non è selettiva l’analisi UV ma la trasformazione enzimatica perché l’acido urico in

presenza di urinassi forma allantoina e H2O2, dove H2O2 con etanolo subisce una

catalisi ad acetaldeide. L’acetaldeide viene poi ossidata ad acetato grazie

all’aldeide deidrogenasi liberando NADPH. La velocità di formazione del NADPH ,

misurata a 340nm è proporzionale alla quantità di acido urico presente nel

campione. spettroscopia differenziale

Possiamo oppure avere , es acido acetilsalicilico.

Lo spettro UV del’aspirina presenta due curve quella A con soluzione acida mentre

quella B con soluzione basica.

La spettroscopia UV-Vis è poi anche utilizzata per altre analisi di interesse

farmaceutico come

-la determinazione di pKa di alcuni principi attivi

-coefficienti di ripartizione

-solubilità dei principi attivi

-monitoraggio nel tempo del rilascio di un principio attivo

-cinetica di una reazione

-cinetica di una degradazione di un principio attivo.

La determinazione della pKa si può fare come già sappiamo attraverso

l’equazione di Henderson-Hasselbalch dove pH=pKa + log (A-)/(HA)

Oppure mediante UV-Vis :

Dove questa formula puo essere usata per un acido

( mentre se il blog lo sottrai per una base ) dove un aumento

del pH provoca un effetto batocromico/ipercromico. A è

l’assorbanza misurata in un campo a pH noto alla

lunghezza d’onda scelta per l’analisi. Ai è l’assorbanza della specie

completamente ionizzata e An è l’assorbanza della specie non ionizzata.

Esempio nella fenilefrina :

in soluzione basica si ha = 292

mentre in acido = 273.

Monitoraggio di reazioni chimiche

La spettroscopia UV-Vis puo essere impiegata come metodica di monitoraggio di

reazioni chimiche che coinvolgono parti della molecola che assorbono .

Es : la riduzione di C=O può essere seguita monitorando la graduale scomparsa

della banda relativa del doppio legame C=O.

Alcune reazioni di cicl