Analisi dei farmaci III e degli alimenti - Appunti

Principi di separazione in cromatografia

I componenti di una miscela si separano distribuendosi fra due fasi (FM e FS). La migrazione di una sostanza da una fase all'altra è regolata da una serie di interazioni tra una fase mobile (forza motrice) e una fase stazionaria o fissa (forza frenante). Se in fondo alla colonna cromatografica inserisco un sistema di rivelazione (es. UV), l'uscita di ciascun prodotto genererà un segnale cromatogramma che verrà rilevato sotto forma di picco, originando un cromatogramma.

In un cromatogramma viene riportato il segnale in funzione del tempo (ordinate: risposta del rivelatore; ascisse: i tempi di uscita delle varie sostanze).

CLASSIFICAZIONE: 19ffi fiffffi fi A fi fi ffi fi

Meccanismi di separazione (che sfruttano FS diverse in funzione della miscela di analiti da separare):

• Adsorbimento: i soluti vengono adsorbiti sulla superficie della FS (supporto solido);
• Ripartizione: gli analiti si ripartiscono tra due fasi (una FS e una FM) in funzione della loro natura (affinità per le...)

più elevate per funzionare correttamente);- Possedere una distribuzione granulometrica omogenea;- Essere stabile chimicamente e termicamente;- Essere facilmente disponibile e a basso costo;- Essere facilmente manipolabile e con buone proprietà di flusso;- Essere in grado di separare efficacemente i componenti della miscela.La fase mobile può essere un gas o un liquido, a seconda del tipo di cromatografia di adsorbimento utilizzata. La separazione avviene grazie all'interazione tra i componenti della miscela e i siti attivi presenti sulla superficie dei granuli della fase stazionaria. I componenti che interagiscono maggiormente con la fase stazionaria verranno trattenuti più a lungo, mentre quelli che interagiscono meno verranno eluiti più rapidamente. La separazione avviene quindi in base alla polarità delle molecole e alla forza delle interazioni tra i componenti della miscela e la fase stazionaria.maggiori e la FM fatica a spostarsi);- Elevata superficie adsorbente. È necessaria una elevata estensione superficiale che favorisca il rapido instaurarsi dell'equilibrio della sostanza tra la FS e FM. Per raggiungere questo obiettivo si lavora sulla dimensione delle particelle (suddivisione) della FS. Utilizzando una FS molto suddivisa, si ottiene uno spettro con picchi molto stretti. Caratteristiche della FM: - Inerzia chimica nei confronti della FS; - Non deve avere potere solvente nei confronti della FS; - Avere un buon potere di separazione dei componenti della miscela. CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE equilibrio di ripartizione Si basa su un'interazione tra una FS liquida (o semiliquida) e una FM liquida immiscibili. Inizialmente la FS era un liquido che impregnava un solido granulare inerte; attualmente è costituita da gruppi funzionali organici legati chimicamente alla silice (FS semiliquida). Può essere gas-liquido o liquido-liquido a seconda dellanatura della fase mobile. FS inversa (lm liquido di gel di silice legato ad una catena idrofobica: lm semiliquido). In un sistema di questo genere, spesso non è possibile definire in maniera chiara se la separazione degli analiti avvenga in base a un processo di adsorbimento o di ripartizione, ovvero entrambi. Il processo cromatografico viene suddiviso in base alle polarità relativa delle due fasi: - Fase normale (o diretta): la fase liquida legata sul solido di supporto è più polare della fase mobile che è non polare (es: etere, diclorometano). - Fase inversa: la fase liquida legata sul solido di supporto è meno polare (es: catene alifatiche C8 o C18) della fase mobile che è polare (es: acqua, metanolo, acetonitrile). Il fatto che si abbia una fase liquida legata fa sì che in realtà si lavori con un sistema intermedio adsorbimento-ripartizione. Non si utilizza gel di silice perché da interazioni ditipoirreversibileCROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICLa FS è costituita da scambiatori di ioni, cioè resine costituite da una matrice inerte con gruppi funzionali ionizzabili, che scambiano reversibilmente i propri contro-ioni con altri di uguale carica presenti nei componenti della miscela da separare.La fase mobile contiene ioni che competono con quelli legati alla matrice.Resine a scambio cationico trattengono ioni positivamente caricati perché la fase stazionaria ha gruppi funzionali legati carichi negativamente.Resine a scambio anionico trattengono ioni negativamente caricati perché la fase stazionaria ha gruppi funzionali legati carichi positivamente.Le resine sono insolubili nei solventi che contengono la miscela da separare, resistenti ad agenti chimici a T > 100°C. 21fi fi fi E O fi fiIl processo di separazione avviene in più fasi:- Caricamento: il campione deve essere sciolto in un tampone cationico o anionico con un pH e una forza ionica

Tali da assicurare il legame degli analiti che si desidera separare alla resina.

Eluizione: si effettua prima un lavaggio della FS con lo stesso tampone per eluire i componenti non legati, mentre i componenti legati alla FS vengono eluiti generalmente con un gradiente di forza ionica e/o pH.

CROMATOGRAFIA AD ESCLUSIONE MOLECOLARE

La fase stazionaria è costituita di granuli di gel (composti organici polimerici) con pori di dimensione controllata: le dimensioni dei pori dipendono dal numero di legami trasversali presenti nella matrice di cui è costituito il gel.

GFC: gel filtrazione (eluenti acquosi, sostanze idrosolubili); GPC: gel permeazione (eluenti di tipo organico, sostanze non idrosolubili).

Il gel funge da "setaccio".

I componenti della miscela vengono separati in funzione delle loro dimensioni e forma: le molecole si ripartiscono fra volume del solvente all'interno ed all'esterno dei granuli e vengono ritardate in maniera differente; la migrazione dipende

dalla capacità delle molecole di entrare in un reticolo. Le molecole più grandi sono eluite più rapidamente, mentre le molecole più piccole sono ritardate. Vari tipi di gel: - Al di sotto del limite minimo ogni analita viene trattenuto allo stesso modo. - Impieghi comuni: - Purificazione di macromolecole: proteine, enzimi, ormoni, anticorpi, acidi nucleici, polisaccaridi. - Desalting: allontanamento dei sali, poiché proteine ed altre macromolecole biologiche hanno dimensioni molto più grandi rispetto ai sali. - Determinazione del peso molecolare di proteine. ANALISI DEL PM: Si procede effettuando una cromatografia di calibrazione, costruendo una retta di taratura usando sostanze diverse a peso molecolare noto (log MW vs Volume eluizione). Questa ci consente di determinare il PM di un campione incognito conoscendo il suo volume di eluizione in una colonna specifica. CROMATOGRAFIA DI AFFINITÀ: Separa molecole sfruttando interazioni specifiche tra un ligando.

immobilizzato sulla fase stazionaria e le molecole di interesse (impiego prevalente in ambito biochimico). Un ligando, molecola che si lega con alta specificità alla proteina di interesse, viene legato covalentemente ad una matrice inerte. Il ligando deve avere a nità elevata per catturare la molecola di interesse, ma non così elevata da impedirne il suo distacco senza denaturazione. A causa dell'alta specificità delle interazioni, la selettività della cromatografia per affinità è potenzialmente la più elevata tra i vari tipi di cromatografia, o rendo la possibilità di purificazione step di una molecola specifica da una miscela anche molto complessa. La proteina legata viene eluita mediante aggiunta di substrato o di ligandi per i quali la macromolecola ha una maggiore affinità rispetto a quella del ligando immobilizzato, o mediante soluzioni con pH o forza ionica diversi, che riducono l'affinità tra ligando e componente.

22fi fi ff ff fiffi fi ffi fi ’ fi fi ffi fi fi ff fi ff ffi fi

PARAMETRI CROMATOGRAFICI

Il comportamento di un soluto in un sistema cromatografico deve essere descritto in termini precisi mediante l’uso di opportuni parametri per effettuare confronti obiettivi fra i vari soluti, acquisire elementi utili alla loro identificazione e validare il metodo cromatografico.

Altezza del picco: distanza tra il massimo del picco e la sua base, misurata perpendicolarmente all’asse dei tempi.

Ampiezza del picco: segmento delimitato sulla base del picco dai punti di intersezione delle tangenti tracciate nei punti di esso da ambedue i lati.

Area del picco: dipende dalla quantità di sostanza in uscita dalla colonna e dalle caratteristiche del rivelatore.

Analisi quantitative: attraverso diverse metodologie di studio quantitativo come ad es. standardizzazione interna, standardizzazione esterna, metodo delle aggiunte ecc.

Tempo di ritenzione ( ): tempo totale impiegato dall’analita

Per percorrere la FS.R t + tTempo che impiega un componente della miscela ad uscire dalla colonna ( ) o,FS FMtecnicamente, ad essere rivelato come picco dal detector.Dipende dalla natura della sostanza, dalla colonna e dalle condizioni operative.

Analisi qualitative: confronto dei tempi di ritenzione tra la miscela in esame e sostanze pure o miscele acomposizione nota.

- t o tTempo morto ( ) : tempo impiegato da una molecola non trattenuta per percorrere la FS;M 0 t′ = t − t

- Tempo di ritenzione corretto ( ): tempo speso da un dato soluto nelle interazioniR 0Rcon la FS.

- VVolume di ritenzione ( ) : volume di eluente richiesto per l’eluizione di un’analita.R- V , VVolume morto ( ): volume di ritenzione di un composto non trattenuto (volume di eluente che si trova negli spaziM 0interstiziali).

Fattore di capacità