Analisi dei farmaci III e degli alimenti - Appunti

Analisi dei farmaci e degli alimenti

3° anno - a.a. 2020-2021

Prof. Annalida Bedini

Farmacopea

La farmacopea è un testo contenente requisiti e caratteristiche delle sostanze farmaceutiche definite secondo standard specifici dell'organismo di controllo ufficiale (ISS) della Repubblica Italiana. Funge da regolamento tecnico in campo farmaceutico. La F.U. della Repubblica Italiana è costituita dalla Farmacopea Europea (E.P.) e dalla Farmacopea Ufficiale.

Farmacopea ufficiale

• Prescrizioni generali;
• Metodi di analisi;
• Contenitori e materiali usati nella fabbricazione di quest’ultimi;
• Reattivi;
• Argomenti generali ed analisi statistica dei risultati dei dosaggi biologici.

Schema base di una monografia

→ Riporta le caratteristiche chimico-fisiche, identificazione, determinazione quantitativa, modalità di conservazione, ecc.

• Denominazione;
• Formula bruta e di struttura;
• Peso molecolare;
• Definizione ufficiale della sostanza;
• Descrizione dei caratteri;
• Criteri di identificazione;
• Saggi di controllo;
• Determinazione quantitativa;
• Criteri di conservazione;
• Possibili impurezze.

Classificazione dei metodi analitici

I metodi analitici sono classificati in base al tipo di informazione richiesta:

• Analisi qualitativa: stabilire l'identità chimica delle specie presenti nel campione.
• Analisi quantitativa: stabilire in termini numerici la quantità relativa di una o più specie presenti nel campione.

I metodi analitici per l'analisi dei farmaci devono essere scelti in base:

• Al tipo di accertamento richiesto (quali- e/o quantitativo);
• Alla struttura del composto in esame;
• Alle tecniche disponibili (metodi classici o strumentali).

Calcoli

Unità di misura della concentrazione

• % p/p = g/100g
• % p/v = g/100ml
• % v/v = ml/100ml
• ppm = 1/1.000.000 (Parti Per Milioni)
• ppb = 1/1.000.000.000 (Parti Per Bilioni)

Soluzioni e densità

d = massa/volume
xM (massa) = V d
V = M/d → x%M/V = M/(M/d) %M/M d→x%M/M = M/(V d) (%M/V)/d

Concentrazione di una soluzione

• Molarità (M) = moli/litro = mmoli/ml
• milliMolare (mM) = mmoli/litro = microMoli/ml
• microMolare (µM) = moli/litro = nmoli/ml
• nanoMolare (nM) = nmoli/litro
• Normalità (N) = equivalenti/litro

Moli massa

moli = g/PM
mmoli = mg/PM
x g = moli PM
mg = mmoli PM

Se si deve preparare un certo volume di una soluzione ad una determinata concentrazione:
moli = g/PM
M = moli/litro
x moli = M L
x M L = g/PM → x mmoli = mg/PM M ml = mg/PM

Diluizioni

Operazione necessaria, ad esempio, per fare in modo che la concentrazione di una soluzione ricada nell’intervallo di utilizzo dello strumento in cui si intende eseguire l’analisi. Nelle diluizioni la quantità di analita rimane invariata (cambia la concentrazione).

x C₁ V₁ = C₂ V₂

Regola della croce

In alto a sinistra metto la soluzione più concentrata. Al centro metto la concentrazione che voglio ottenere nella soluzione finale. In basso a sinistra metto la soluzione meno concentrata.

Esempio

Ho una soluzione concentrata di alcol al 96% e voglio ottenere una soluzione diluita al 40%. Si utilizza l’acqua, in cui la concentrazione della soluzione iniziale è 0%.

Calcolo:
96 - 40 = 56 (parti di alcol da utilizzare)
0 - 40 = 40 (parti di acqua da utilizzare)
40 + 56 = 96 (parti totali da utilizzare)

Se mi servono 500ml di soluzione diluita:
→ Acqua: 40 : 96 = x : 500, x = 208,3ml
→ Alcol: 56 : 96 = x : 500, x = 291,7ml

Miscelando 208,3ml di acqua e 291,7ml di alcol, ottengo 500ml di una soluzione di alcol al 40%.

Fattore di diluizione (Fd o df)

Indica quante volte una soluzione risulta essere meno concentrata rispetto alla soluzione di partenza (indica quante volte è meno concentrata la nuova soluzione).

Fd = C₁/C₂ = V₂/V₁

Es: ho 10ml di soluzione, la diluisco fino a 100ml
Fd = V₂/V₁ = 100/10 = 10 (la soluzione finale è 10 volte più diluita rispetto a quella iniziale).

In seguito, diluisco 10ml della soluzione ottenuta fino a 100ml
Fd = 100/10 = 10
Fd totale = Fd₁ Fd₂ = 10 x 10 = 100

Esempio

Aggiungi 15ml di NaOH 1M a 5ml di una soluzione A. Estrai 3 volte con etere, lava l’estratto di etere con 10ml di acqua. Combina le fasi acquose e diluisci fino a 100ml. Prendi 10ml della soluzione diluita con acqua e diluisci fino a 100ml.

Fd = (100/5) (100/10) = 20 x 10 = 200

Come riportare i risultati

Esempio: Peso 3 persone: 71,2 kg / 75,7 kg / 65,0 kg

Faccio una media: ottengo 70,6333333333 Kg

Non va bene riportare il risultato finale del calcolo in questo modo, ci sono troppe cifre decimali. Le cifre significative devono esprimere il risultato di una misura con il grado di accuratezza con cui questa è stata eseguita. Nei calcoli, il risultato finale dovrà essere espresso con il numero di cifre significative relative al dato meno accurato (se uno di questi 3 dati fosse stato ottenuto senza nessuna cifra decimale, il risultato finale va tenuto senza cifre decimali).

Esempio: Peso 3 persone: 71 kg / 75,7 kg / 65,01 kg

Faccio una media e scrivo il risultato senza cifre decimali (dato meno accurato).

Elementi caratterizzanti il metodo analitico

Validazione di un metodo

Chiunque si occupi di un’analisi farmaceutica nell’ambito del controllo della qualità è in grado di sviluppare un metodo analitico che avrà un determinato obiettivo, per esempio identificare e dosare la presenza di un determinato principio attivo all’interno di una forma farmaceutica. Lo sviluppo di un metodo di questo genere richiede l’esecuzione di specifici passaggi per essere validato, cioè bisogna definire, per questo metodo, una serie di parametri che indicano la qualità di quel metodo. Va cioè validata la prestazione di quel metodo e che quindi possa essere, una volta sviluppato, utilizzato per gli obiettivi desiderati.

Il processo di validazione richiede di esplicitare le caratteristiche di prestazione del metodo attraverso opportuni parametri di qualità del metodo di analisi e quindi del dato da esso prodotto. La validazione del metodo è un processo che dimostra che le procedure analitiche sono adatte per il loro uso. La validazione passa attraverso l’identificazione della precisione, dell’accuratezza, specificità, linearità, robustezza, ecc.. Questi parametri devono essere descritti in maniera matematica e devono essere quantificabili.

La validazione del metodo analitico ha principalmente queste finalità:

• Identificare le fonti e quantificare potenziali errori;
• Determinare se il metodo è accettabile per l’uso previsto;
• Dimostrare che un metodo può essere utilizzato per il processo decisionale (sulla base dei risultati di una determinazione effettuata mediante una metodica analitica, poi anche a livello industriale si prendono delle decisioni, ossia magari di approvare o rifiutare di introdurre nel mercato un determinato lotto di compresse, perché magari rientrano o meno in determinate specifiche).

Esempi di metodi analitici in campo farmaceutico che richiedono documenti di validazione:

• Metodi cromatografici: HPLC, GC, TLC, GC/SM, ecc..
• Metodi spettrofotometrici: UV/VIS, IR, AAS, ecc..

International Council on Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH)

ICH è unico nel riunire le autorità di regolamentazione e l'industria farmaceutica per discutere gli aspetti scientifici e tecnici della registrazione dei farmaci. Dal suo inizio nel 1990, ICH si è gradualmente evoluto, per rispondere al volto sempre più globale dello sviluppo della droga.

La missione di ICH è di raggiungere una maggiore armonizzazione a livello mondiale per garantire che i medicinali sicuri, efficaci e di alta qualità siano sviluppati e registrati nel modo più efficiente sotto il profilo delle risorse. Obiettivo: standardizzazione mondiale della regolamentazione farmaceutica. Lo scopo dell’organizzazione è anche quello di introdurre una standardizzazione della validazione di metodi analitici.

• Saggi d’identificazione;
• Saggi quantitativi per le impurezze;
• Saggi limite per il controllo delle impurezze;
• Saggi quantitativi per valutare l’attività biologica di p.a., farmaci o altri componenti di un prodotto farmaceutico.

Le linee guida ICH consentono un approccio adottato uniformemente dalla gran parte dei paesi (USA, Europa, Giappone) per problematiche relative al controllo qualità ed alla validazione dei metodi analitici. I laboratori di Controllo Qualità (CQ) effettuano tutte le analisi previste sul farmaco confermando la conformità del prodotto con le specifiche di approvazione, e che le caratteristiche del prodotto che verrà venduto sono quelle attese. Le misure analitiche devono essere affidabili e comparabili per poter essere di aiuto nei processi decisionali. Il metodo di analisi applicato dal laboratorio deve avere prestazioni stabili nel tempo in modo da garantire la confrontabilità dei risultati, quindi la loro qualità.

Precisione e accuratezza

Una misura è tanto più precisa quanto più i singoli valori misurati si concentrano intorno alla media della serie di misure effettuate (dipende dall’esecuzione dei vari passaggi). Una misura è tanto più accurata quanto più la media delle misure si approssima al valore vero della grandezza (dipende dal metodo e dall’esecuzione dei vari passaggi).

Errori

• Errori sistematici: influenzano il risultato di una misura sempre in un medesimo senso e portano o a misure in difetto o in eccesso rispetto a quelle che si avrebbero in loro assenza. In linea di principio eliminabili; influenzano l’accuratezza.
• Errori casuali: originati da processi incontrollabili e indeterminati, variano in modo imprevedibile da una misura all’altra e influenzano il risultato qualche volta in eccesso, qualche altra volta in difetto. Riducibili (aumentando il numero di casi) ma non eliminabili; influenzano la precisione.
• Errori grossolani: errori di calcolo, di lettura, di pesata, di diluizione, ecc.

Precisione

Bisogna quantificare la precisione del metodo analitico. Quando uno esegue una serie di misurazioni, queste si distribuiscono secondo una distribuzione gaussiana attorno alla media ( ). Il 68% delle misure effettuate è compresa nell’intervallo ± ; il 95% nell’intervallo ±2 . Se è piccolo la gaussiana si “impenna”; se è ampio la gaussiana si appiattisce. Bisogna quindi valutare, quantizzare, il fattore , ossia la deviazione standard (DS). La deviazione standard esprime la dispersione del dato: se la DS è elevata, significa che il valore medio è stato ottenuto da dati molto dispersi, molto diversi tra loro; se la DS è piccola significa che la media ottenuta è stata ricavata da dei dati molto vicini gli uni agli altri (precisi). Ha come unità di misura la stessa di ciò che misuriamo.

Alla DS spesso si accompagna una DSR (deviazione standard relativa), rapporto tra la DS e la media ottenuta, il tutto moltiplicato per 100. La DSR è un numero puro (poiché deriva dal rapporto di due misure che hanno la stessa unità di misura). Con la DSR si possono comparare metodiche analitiche diverse e quindi valutare, e comparare, la precisione di metodi diversi.

Ripetibilità di un metodo

• Possibilità di ottenere lo stesso risultato. Un dato viene classificato come ripetibile se si ottengono dei dati confrontabili ad opera dello stesso operatore, nello stesso lasso di tempo e con lo stesso strumento (stessa procedura effettuata dallo stesso operatore).
• Precisione intermedia: Se ottengo lo stesso risultato nell’ambito dello stesso laboratorio, ma con diversi operatori, diverso tempo e diversi strumenti. (Una precisione maggiore).
• Riproducibilità: Se si ottiene lo stesso risultato in un altro laboratorio (con altri operatori, altri strumenti, altre sostanze).

Accuratezza

È sinonimo di esattezza (e non di precisione!). Può essere stimata in un campione avendo la certezza della quantità di analita presente. L’accuratezza può essere impiegata per confrontare due metodi di analisi diversi: posso aver già determinato la quantità con un metodo stabilito e verificare l’accuratezza di uno nuovo. Può essere espressa come:

• % Recupero rispetto alla quantità nota di analita presente in un campione;
• Differenza fra la quantità nota e quella determinata sperimentalmente.

Altri parametri di validazione

• Linearità: La capacità del metodo analitico di dare risultati che sono direttamente proporzionali alla concentrazione degli analiti nei campioni. Linearità all’interno di un determinato range di concentrazione, oltre il quale lo stesso metodo non dà più una risposta lineare.

Si devono effettuare almeno da 3 a 6 repliche di 4 o più concentrazioni. Sulla base dei dati ottenuti si costruisce una curva di interpolazione e si ricava la retta di regressione. La linearità viene stimata attraverso appropriati metodi:

• Costruzione di una curva di interpolazione (retta di regressione):
  L’equazione di una retta ha la forma: y = a + bx
  dove:
  • a: intercetta della retta con l’asse y
  • b: pendenza della retta (coefficiente angolare)
  • y: dato analitico
• Una volta ricavati questi, posso calcolare x, ossia la concentrazione degli standard.
• La linearità va confermata ulteriormente attraverso il coefficiente di correlazione (r): ci dà un’indicazione di come i valori che abbiamo ricavato cadono nella retta; stima quanto bene i punti siano descritti da una linea retta: i punti utilizzati per costruire la retta devono quanto più possibile cadere sulla retta o comunque essere molto vicino ad essa.

La misura statistica della bontà dell’adattamento della retta attraverso i dati è fornita dal coefficiente di correlazione (r). Un coefficiente di correlazione > 0,99 viene considerato un indicatore di linearità.

Limite di rivelabilità (LOD: Limit Of Detection)

Rappresenta la più piccola concentrazione (o quantità) di analita che può essere rivelato in maniera attendibile (ad un livello di fiducia noto). È la più piccola quantità di analita che può essere rivelata attraverso un particolare metodo.

Esempio: Tracciato cromatografico, ossia un segnale in funzione del tempo; c’è una linea di base che a volte può essere molto disturbata: questo si chiama rumore di fondo ed è una variazione che si ha sempre nel segnale (anche in assenza di analita), questo deriva. Dal rumore di fondo si possono innalzare dei picchi, ma quale corrisponde al mio analita? Il limite di rivelabilità ci dice che possiamo considerare come segnale effettivo attribuibile ad un analita solo quei picchi che si innalzano dal rumore di fondo in un rapporto segnale/rumore di fondo di 3:1. Quindi, un picco che ha un’intensità pari a 3 volte la deviazione standard del rumore di fondo viene riconosciuto come un segnale reale. Picchi inferiori sono segnali del rumore di fondo (degli spike, non sono attribuibili all’analita).

Rumore di fondo

Variazione indesiderata del segnale, causale e dipendente dal tempo; segnale non dovuto all’analita, costante o lentamente variabile (deriva).

Limite di quantificazione (LOQ: Quantiation Of Limit)

È la più piccola quantità di analita che può essere quantificata in modo attendibile. Quindi, LOD: per la rivelazione dell’analita; LOQ: per la quantificazione.

Esempio: Tracciato cromatografico: rumore di fondo dove si innalza un picco. In questo caso, il rapporto segnale/rumore di fondo deve essere di 10:1. Quindi, un analita può essere quantificato correttamente se la differenza di lettura fra campione e bianco è almeno 10 volte la deviazione standard del bianco.

Quindi, quando un segnale è maggiore LOD possiamo dire che l’analita è presente nel campione, ma per quantizzare quello stesso analita è necessario stabilire il limite oltre il quale definire LOQ.

Range

Intervallo compreso fra la minima e la massima concentrazione di analita per il quale è possibile ottenere un livello stabilito di linearità, precisione ed accuratezza (si stabilisce e si valuta sperimentalmente; deriva da studi di linearità).

Selettività

Capacità di un metodo di differenziare e quantificare un analita in presenza di varie sostanze in un campione. Per esempio, le molecole fluorescenti sono presenti in numero molto ridotto (fluorescenza: assorbire radiazioni UV-Vis e riemetterle a una lunghezza d’onda maggiore). La fluorescenza è un metodo molto selettivo, poiché all’interno di una miscela è possibile che ci sia una sola sostanza che ha questa proprietà: la spettrometria di fluorescenza è una tecnica selettiva che permette di rivelare solo le poche sostanze fluorescenti all’interno di una miscela (le altre sostanze non vengono rivelate, serviranno altri metodi).

Robustezza

Capacità di un metodo di mantenere precisione ed accuratezza senza risentire di piccole variazioni introdotte. Per esempio, in LC un metodo robusto è un metodo che non risente di...