Analisi dei farmaci III e degli alimenti

CROMATOGRAFIA: DEFINIZIONI E GRADIENTI

Il comportamento di un soluto in un sistema cromatografico deve essere descritto in

termini precisi mediante l’uso di opportuni parametri per effettuare confronti

obbiettivi tra i vari soluti, acquisire elementi utili alla loro identificazione e validare il

sistema cromatografico.

In un processo cromatografico parliamo oltre che di tempo di ritenzione, anche di

tempo morto, che è il tempo impiegato da una molecola non trattenuta per

percorrere la FS.

Ho anche un volume di ritenzione cioè, il volume di eluente richiesto per l’eluizione

di un’analita. Il volume morto, invece è il volume di eluente che si trova negli spazi

interstiziali.

Fattore di capacità (di ritenzione)

Questo parametro ci dà informazioni sul grado di ripartizione tra le due fasi e

descrive la velocità di migrazione dell’analita lungo la colonna.

Può essere usato per confrontare le prestazioni di

colonne diverse a parità di eluente.

Può essere modificato in GC variando la

temperatura e in HPLC la composizione della fase

mobile.

Efficienza cromatografica

Queste 3 sostanze che eluiscono con tempi diversi hanno un diverso

profilo del picco, i primi picchi che escono hanno tutti una base più

piccola e mano a mano che escono gli ultimi avrò picchi più allargati,

questo vuol dire che le ultime sostanze hanno trascorso tempi più

lunghi all’interno della colonna, questo è un inconveniente perché

potrebbero verificarsi fenomeni di sovrapposizione dei picchi.

Questo allargamento dipende da diversi fattori che vedremo.

Si parla di efficienza cromatografia (capacità di ridurre al minimo

l’allargamento di queste bande). 25

In termini quantitativi sulla base della teoria dei piatti, l’efficienza è espressa dal

numero dei piatti

teorici (N) della colonna

e può essere definita

come:

N= indica l’efficienza (

Il numero di piatti

teorici viene espresso

per metro), Wb=

ampiezza del picco alla

base.

W1/2= ampiezza del picco a metà altezza).

Il piatto teorico è la sezione della colonna che consente di realizzare un equilibrio

reversibile di distribuzione di un componente fra le fasi.

Normalmente le colonne HPLC possono esprimere 50000 piatti teorici per metro,

vuol dire che ogni 0,02 mm c’è un piatto teorico, per mantenere il più possibile

accorpate queste sostanze.

H = L/N questa è l’altezza del piatto teorico e dipende da numerosi fattori specifici

della colonna usata come le dimensioni delle particelle delle fasi stazionarie,

l’impaccamento della colonna, poi abbiamo anche dei fattori come la velocità della

fase mobile che dipende dall’operatore.

H basso bande strette migliore la separazione

à à

L’HETP deve essere basso perché significa che in un piccolo cammino si verifica un

equilibrio completo.

La selettività esprime la capacità del sistema

cromatografico di eluire in tempi differenziati specie

chimiche diverse o simili. Slide quindi la valutazione

dell’alfa ci può dare indicazioni su come alcune

sostanze possono essere separate.

La risoluzione esprime in maniera quantitativa la

capacità del sistema cromatografico di separare in

maniera netta e distinta i diversi analiti della

miscela (diversa dalla selettività).

Una buona risoluzione può derivare sia da una buona efficienza (picchi molto stretti,

elevato numero di piatti

teorici) sia da una buona

differenziazione del

comportamento dei soluti

(selettività).

eNel secondo caso ho una

buona risoluzione 26

Dobbiamo quantizzare il parametro della risoluzione attraverso alcune formule cioè:

Quindi la differenza di selettività non dipende solo dal tempo di ritenzione ma anche

dall’efficienza.

La risoluzione quindi dipende dall’efficienza, selettività o ritenzione.

Si può aumentare la risoluzione:

- Allunganfo la colonna, quindi cambiarla

- Ridurre l’HETP

- Modificare la k’ attraverso T (GC) o composizione FM (LC).

- Modificare alfa FM, FS, T o usando particolari additivi alla FM.

La prima scelta non è quella di cambiare la colonna ma prima modifico questi fattori,

cioè cambiare FM, aggiungere additivi… mi dà risposte di efficienza notevoli.

Un'altra cosa importante è l’asimmetria dei picchi, quindi avere dei picchi

caratterizzati da fronting (tracciato che sale lentamente e scende bruscamente) o un

trailing (tracciato che ha una scodatura finale).

Le cause sono un analita fortemente adsorbito, un carico eccessivo oppure delle

decomposizioni. 27

Le soluzioni per ovviare a questi problemi sono: aumento della ritenzione,

aggiustamento delle condizioni cromatografiche, modifica del sistema

cromatografico.

Anche questo è quantizzato dal fattore di asimmetria

Un altro punto fondamentale è che la risoluzione è influenzata da eluizioni in

gradiente, posso pensare di cambiare la temperatura: al

posto di fare un’isoterma a 45°C la faccio a 145°C, quindi

aumento la temperatura e diminuisce il t , vengono

R

rilevati componenti che a bassa temperatura non c’erano,

ma ho una scarsa risoluzione perché i picchi sono tutti

molto sovrapposti e non posso fare un’analisi quantitativa

poiché i soluti tendono ad avere un minore t .

R

Allora ovvio questo problema usando una temperatura

programmata, cioè la temperatura aumenta in sequenza

e ottengo un

sistema con

un’ottima

risoluzione di

tutti i picchi,

non lavoro in situazioni di costanza di

temperatura, quindi prima vengono

eluite le sostanze più volatili e poi quelle

meno.

La stessa cosa la ottengo se la faccio in HPLC, però al posto di variare la

temperatura, modifico il potere eluente della FM, non faccio un’eluizione isocratica,

ma se siamo in fase normale aumento la polarità (in fase inversa invece, diminuisce

la polarità) nel tempo (gradiente di solvente). 28

13/03/18

Allargamento delle bande cromatografiche

Molecole di uno stesso composto, pur avendo lo stesso fattore di

capacità, impiegano intervalli di tempo diversi per attraversare la

colonna.

H = H diffusione vorticosa + H diffusione longitudinale + H

trasferimento di massa.

Diffusione vorticosa: porta ad un allargamento della banda, ed è caratteristica di

colonne impaccate nelle quali c’è

un sopporto all’interno. Questo

viene dal fatto che quando

facciamo partire la sostanza a capo

della colonna, qualcuna si può

perdere e altre invece vanno più

veloce, quindi alla fine della colonna le particelle seppur della stessa sostanza

arrivano con tempi diversi in fondo alla colonna. Riusciamo a limitare questo

fenomeno di diffusione se abbiamo delle particelle più piccole e regolari, e se

all’interno del sistema si abbia un impaccamento omogeneo.

Le colonne capillari non hanno un impaccamento all’interno ma

hanno questo tipo di fronte, quindi anche con queste ho la

possibilità di partire da una banda stretta ed arrivare ad una

allargata.

La diffusione longitudinale viene dal fatto che per la presenza di un gradiente di

concentrazione, le molecole tendono a

diffondere sia da un lato che dall’altro.

Più l’analita percorre lentamente la

colonna e più il fenomeno è consistente.

È più evidente in gascromatografia, mentre trascurabile in cromatografia liquida.

Abbiamo un altro fenomeno che porta all’allargamento di banda che è il

trasferimento di massa, si verifica poiché il movimento del soluto all’interno della

FM o della FS non è abbastanza veloce

da mantenere una distribuzione

all’equilibrio del soluto tra le due fasi.

Un’elevata velocità del flusso impedisce

il raggiungimento dell’equilibrio (tempo

per raggiungere l’equilibrio), ci sono

quindi rallentamenti dovuti al trasferimento di massa.

Più nel dettaglio, posso suddividerla in due categorie di resistenza al trasferimento

di massa: 29

- Resistenza al trasferimento nella fase mobile: le stesse molecole se sono

molecole analoghe ci impiegano un tempo diverso per arrivare nello stesso

punto. Oppure se la superficie è molto irregolare esistono delle sacche di

ristagno, quindi se raggiunge profondità elevate nella superficie fa fatica a

risalire e quindi di conseguenza provoca allargamento di banda.

- Resistenza al trasferimento nella fase stazionaria: se lo spessore della fase

liquida (FS) non è regolare, due molecole della stessa sostanza possono essere

ripartite in maniera diversa. Quindi ancora una volta è importante che la fase

stazionaria risulti il più possibile regolare.

Tutto si riassume in un’equazione, quella di Van Deemter.

H= misura l’efficienza della colonna

A= diffusione microvorticosa

B= 2 x coefficiente di diffusione dell’analita;

C= parametro composto da termini relativi alla

velocità di diffusione dell’analita nelle fasi gassosa e liquida, e u è la velocità del gas

di trasporto (carrier).

In una colonna capillare, A non contribuisce all’allargamento della banda, quando si

usa azoto come gas di trasporto, il rapporto B/u è favorevole perché i coefficienti di

diffusione delle molecole di questo gas sono minori rispetto a quelli nell’idrogeno e

nell’elio. Tuttavia, l’azoto garantisce una migliore efficienza solo quando la velocità

del gas u è bassa, poiché una velocità di flusso d’azoto elevata riduce l’interazione

dell’analita con la FS.

In una colonna impaccata, l’efficienza della separazione è bassa perché, sebbene il

coefficiente di diffusione sia minore, il contributo di A provoca l’allargamento delle

bande. Inoltre, in una colonna impaccata gli effetti di trasferimenti di massa sono

maggiori a causa della forma irregolare delle particelle dell’impaccamento, le quali

di conseguenza presentano un rivestimento irregolare costituito da uno strato di FS

liquida relativamente spesso.

Dobbiamo considerare numerosi fattori che rientrano nell’efficienza del processo. 30

TLC (cromatografia planare)

Ha un’importanza anche in campo analitico, tanto che nelle monografie della FU

molte sostanze vengono identificate con questa tecnica. È versatile come tecnica

anche come disponibilità di saggi… posso fare un’analisi sia qualitativa che

quantitativa e rivelare impurezze anche in tracce.

La cromatografia è su una superficie piana, mentre que