Analisi dei farmaci III e degli alimenti

Analisi dei farmaci III e degli alimenti

13/01/2018

Parametri che caratterizzano un metodo analitico

Il processo di validazione richiede di esplicitare le caratteristiche di prestazione del metodo attraverso opportuni parametri di qualità del metodo di analisi e quindi del dato da esso prodotto.

Precisione ed accuratezza: una misura è tanto più precisa quanto più i singoli valori misurati si concentrano intorno alla media della serie di misure effettuata (la precisione viene influenzata dall’esecuzione). Una misura è tanto più accurata quanto più la media delle misure si approssima al valore vero della grandezza (influisce non solo l’esecuzione ma anche il metodo).

Tipi di errori nelle analisi

Quando facciamo delle analisi possiamo introdurre vari tipi di errori.

• Grossolano: errore di calcolo, di pesata alla bilancia, sbagliare a leggere il volume nella buretta, spesso sono errori di facile individuazione.
• Sistematici: influenzano continuamente la misura sempre in un medesimo senso, portando a misure in difetto o in eccesso rispetto a quelle che si avrebbero in loro assenza. Sono errori eliminabili molto spesso, riconducendo la prova si può correggerlo e avere maggiore accuratezza (questo errore influenza l’accuratezza).
• Casuali: originati da processi incontrollabili e indeterminati, variano in modo imprevedibile da una misura all’altra e influenzano il risultato qualche volta in eccesso, qualche altra volta in difetto. Riducibili ma non eliminabili (aumentando il numero di casi); influenzano la precisione.

Precisione di una misura (dispersione)

Quando facciamo un set di analisi su un determinato campione, si ottiene una media e i valori si distribuiscono intorno al valore medio e si distribuiscono in una curva gaussiana. Si stima che il 68% dei valori cadano intorno a 2 con un –sigma e +sigma (sigma = varianza rispetto al valore medio), e il 95% cade intorno alla media e + o – quel determinato valore.

Stimare sigma è molto importante, infatti è legato alla precisione delle misure: perché se questo è molto piccolo l’ampiezza della curva si restringe quindi la misurazione si avvicina a quello che è il valore medio. Viceversa se sigma è grande, vede valori distanti da quello medio. Ai fini di valutare la precisione è quindi necessario poter stimare σ.

Deviazione standard (s/DS e DSR) s esprime il grado di concordanza o di dispersione, per cui se è molto piccolo vuol dire che i dati che ho utilizzato sono molto vicini alla media, viceversa il contrario, quindi è un indice della qualità della misurazione. L’unità di misura della deviazione standard è quello che stiamo misurando, cioè se misuro varie aree dei picchi cromatografici sarà cm… in base ai dati che ho, di quello che sto misurando.

Alla deviazione standard si associa la deviazione standard relativa DSR, questa è importante perché ci permette di fare valutazioni sul grado di precisione di vari dati analitici, è un numero puro adimensionale, questo permette di confrontare la deviazione standard di metodi analitici che misurano grandezze diverse (es. se voglio fare determinazione quantitativa di HPLC in cui misuro l’area del picco e correlando un'altra misura che vede un'altra unità di misura lo faccio con la relativa perché è adimensionale e vedo la precisione).

Livelli di precisione

Quando parliamo di precisione in un processo analitico, la distinguiamo in vari livelli perché un metodo analitico si compone di vari processi. Quando facciamo un’analisi strumentale va considerata anche la precisione dello strumento, normalmente queste non influenzano grandemente la precisione totale perché sono piuttosto precisi. Devo poter utilizzare gli stessi reattivi, la stessa strumentazione, lo stesso operatore e condurre l’indagine in un ridotto lasso di tempo.

Poi abbiamo la precisione intermedia, cioè nell’ambito dello stesso laboratorio, collaborano diversi operatori, in giorni diversi o con diverse attrezzature. Ancora questo però non è sufficiente perché i risultati devono essere riproducibili tanto che in un altro laboratorio questo dato deve essere riproducibile e correlato, molto uguale al valore che ho trovato nell’altro laboratorio. Quindi si fanno queste 3 tipologie di prove.

Valutazione dell'accuratezza

Se con la deviazione standard % valuto il grado di precisione, l’accuratezza (esattezza), la valuto in un campione dove la quantità di sostanza dentro è nota, si costruiscono delle forme farmaceutiche identiche in tutto e per tutto nella quale metto quantità esatte di analita, sottoposta ad un processo di analisi e da quello che è il risultato dico se è più o meno accurata perché so qual è il risultato.

L’accuratezza è usata anche per correlare due metodi analitici diversi: posso aver già determinato la quantità con un metodo stabilito e verificare l’accuratezza di uno nuovo.

Può essere espressa come:

• Recupero % rispetto alla quantità nota di analita presente in un campione;
• Differenza tra la quantità nota e quella determinata sperimentalmente.

Incertezza delle misure

È impossibile fare una misura esatta: ad ogni misura è associata un’incertezza più o meno grande. Questa impossibilità è dovuta a due ragioni:

• Nel fare una misura, si compiono inevitabilmente degli errori;
• Gli strumenti hanno una sensibilità limitata, per cui non sono in grado di distinguere grandezze che differiscono per meno di una certa quantità.

Esempio (ponderale): quale incertezza nella pesata di 2 mg di sostanza con una bilancia a 4 cifre decimali? 0,1 mg di incertezza su 2 mg corrispondono ad un’incertezza del 5%. 0,1:2 = X: 100.

Come riportare i risultati?

Prendo in esempio il peso di 3 persone in cui la bilancia ha un’incertezza al decimo di kg, faccio la media e ottengo più valori decimali, questo però non è corretto perché intervengono le cifre significative quindi devo fermarmi al decimo di kg anche nella media. Le cifre significative devono esprimere il risultato di una misura con il grado di accuratezza con cui questa è stata eseguita.

Nei calcoli il risultato finale dovrà essere espresso con il numero di cifre significative relative al dato meno accurato. Per la maggior parte delle analisi si usano non più di 4 cifre significative che corrispondono ad un’incertezza di circa lo 0,1%.

Altri termini per metodiche analitiche

• Bianco analitico: soluzione che è del tutto simile a quella che vogliamo analizzare ma priva dell’analita che è soggetto di analisi.
• Calibrazione: operazione attraverso il quale uno strumento di misura viene tarato, quindi si usano standard in cui si sa che determinati picchi sono significativi e quindi l’analisi la prendo su questi picchi di riferimento.
• Rumore di fondo: variazione indesiderata del segnale casuale e dipendente dal tempo (noise); segnale non dovuto all’analita, costante o lentamente variabile (deriva). Più basso è il valore di fondo e più facile sarà l’analisi.
• Limite di rilevabilità: è la concentrazione di un’analita che può essere rilevato e considerato significativo ad un livello di fiducia noto. È la più piccola quantità di analita che può essere rilevata attraverso un particolare metodo. Dal punto di vista formale, è definito come segue: x – xB = 3SB.
• Limite di quantificazione: più piccola quantità di analita che può essere quantificata (LOQ), è 10 volte la deviazione standard. Un’analisi può essere quantificata correttamente se la differenza di lettura tra campione e bianco è almeno 10 volte la DS del bianco: x - xB = 10SB.
• Linearità: la maggior parte dei metodi analitici si basano su procedimenti in cui il metodo produce una risposta lineare, che aumenta o diminuisce linearmente con la concentrazione dell’analita. L’equazione di una retta ha la forma: y = a + bx dove a è l’intercetta della retta con l’asse y e b è la pendenza della retta. L’adattamento migliore di una retta attraverso questi valori si può ottenere dalla determinazione di a e b da equazioni più complesse. Il criterio adottato per determinare la migliore retta prende il nome di criterio dei minimi quadrati.
• Coefficiente di correlazione: stima quanto bene i punti siano descritti da una linea retta. La misura statistica dell’adattamento della retta attraverso i dati è fornita dal coefficiente di correlazione r. Un coefficiente di correlazione > 0,99 viene considerato un indicatore di linearità. Il coefficiente di correlazione si determina con un’equazione abbastanza complicata.
• Intervallo di linearità: quando faccio una retta di taratura è importante considerare questo parametro. È il range di concentrazioni compreso tra il limite di rilevabilità e il limite di linearità.
• Limite di linearità (LOL): valore di concentrazione oltre il quale la risposta non è più lineare con la concentrazione ma ottengo un dato inutilizzabile.
• Intervallo dinamico o limite di intervallo di risposta dinamico: limite di concentrazione oltre i quale non si possono fare misure quantitative sennò commetto errori troppo elevati.
• Selettività o specificità di un metodo: vari metodi analitici presi in considerazione di cui qualcuno è più specifico e qualcuno meno, la fluorescenza non è una caratteristica che hanno tutte le sostanze, allora se ho una sostanza fluorescente in una miscela non fluorescente, utilizzando lo strumento che lo rileva mi permette di dire che quel metodo è selettivo.
• Robustezza di un metodo: capacità di un metodo di dare la stessa risposta anche se introduciamo piccole variazioni.
• Sensibilità del metodo: è la capacità di un metodo di quanto questo sia sensibile ad una piccola variazione di concentrazione di un analita. Se lo strumento è sensibile piccole variazioni di concentrazione mi danno un valore diverso. Può essere visto come la pendenza di una curva di risposta che può essere funzione del metodo stesso o del modo in cui è stata tarata la strumentazione. Da non confondere con il LOG perché fa riferimento alle variazioni di concentrazione.

Spettroscopia UV-Vis.

È una tecnica robusta, quindi dà dati abbastanza affidabili, la strumentazione ha un costo abbordabile, quindi non è stata soppiantata da altre tecniche. Parliamo di un’interazione radiazione-materia e quella che ci interessa è quella 200-400 nm dell’UV e quella del Vis 400-800 nm. Si tratta di una spettroscopia di assorbimento molecolare, cioè se la sostanza viene investita da una radiazione, viene assorbita e questa cambia l’energia elettronica della molecola.

L’energia elettronica della molecola mi vede lo stato fondamentale della molecola, poi abbiamo livelli definiti vibrazionali, non solo nello stato fondamentale ma anche in quello eccitato, per cui ogni livello elettronico è accompagnato da quello vibrazionale. L’interazione con radiazioni Uv-Vis può provocare la transizione di un elettrone da un orbitale molecolare di legame o di non legame ad un orbitale di anti legame vuoto e quindi il passaggio della molecola da uno stato elettronico fondamentale ad uno dei vari stati eccitati possibili.

Se abbiamo una radiazione che attraverso una cella contenente la soluzione, abbiamo una radiazione che entra e parte di questa se ha un’energia sufficiente è in parte assorbita, quindi quella che ne esce è inferiore a quella entrata. Si parla di trasmittanza: T=P/Po, varia da 0 a 1 (completa trasmissione o assente), espressa anche in percentuale moltiplicando il valore per 100. Ci interessa anche non solo quanta è trasmessa ma anche quanta è assorbita, le due variabili sono associate nella relazione: A = - log T₁₀. L’assorbanza varia da zero (non trasmessa e non assorbita) a infinito. Sia trasmittanza che assorbanza dipendono dalla lunghezza d’onda della radiazione inviata.

Nell’analisi quantitativa scelgo una specifica lunghezza d’onda e sulla base di questa si fa l’analisi quantitativa. Da un punto di vista qualitativo ho uno spettro UV-VIS, in cui in ordinata ho sempre l’assorbanza in funzione della lunghezza d’onda. Ogni sostanza ha un particolare spettro di assorbimento ciò permette di identificare una sostanza (per confronto diretto con campioni noti o tramite banche dati di spettri) o di controllarne il grado di purezza.

Analisi quantitativa: legge di Lambert-Beer

L’assorbanza è il valore direttamente proporzionale alla concentrazione del nostro analita e dalla lunghezza del cammino ottico. A= k b c. Più è elevata la concentrazione e maggiore sarà l’assorbimento, b è il cammino ottico cioè il cammino che la radiazione fa, in genere lo spessore che deve attraversare, normalmente è pari a 1. K è una costante che mi dice l’assorbimento unitario specifico di una radiazione.

Tutti gli strumenti Uv misurano l’assorbanza, che varia in maniera lineare con la concentrazione e abbiamo la retta entro determinati limiti. T (non lineare rispetto alla concentrazione) diminuisce in modo esponenziale in rapporto alla concentrazione c del composto e alla lunghezza del percorso della luce, b, nel modo seguente: T = 10^-kbc. La legge di Lambert-Beer evidenzia la relazione lineare fra assorbanza e concentrazione; riveste grande importanza per determinazioni quantitative.

Limitazioni della legge di Lambert-Beer

L’estinzione specifica o molare A= k b c. A= assorbanza, E= estinzione, D= densità ottica K cambia in funzione di come noi esprimiamo la concentrazione, cioè se la concentrazione è in p/v (g/100 ml) allora K è dato dall’Assorbanza (1%, in un cammino ottico 1 cm). Queste costanti per specifiche lunghezze d’onda sono caratteristiche del composto di analisi, si riferiscono ad una cella di lunghezza 1 cm e dipendono anche dalla natura del solvente e dal pH. Se troviamo in letteratura un coefficiente di tipo epsilon, possiamo tornare alla legge di Lambert-Beer però trasformando i coefficienti con le opportune variabili.

Nei prodotti farmaceutici, le concentrazioni e le quantità si esprimono generalmente in grammi o milligrammi piuttosto che in moli e quindi per l’analisi di questi prodotti l’equazione di Lambert-Beer si scrive nella seguente formula: A= A (1%, 1 cm) b c, quindi usa g/ml. A è l’assorbanza misurata; A (1%m 1cm), non usa la molarità perché compaiono nella FU una miscela di sostanze e quindi in quel caso siamo impossibilitati a trovare una concentrazione specifica espressa in grammi su V. Questo porta a conclusioni interessanti ovvero è di avere una A specifica, prepara una soluzione diluita, andare allo strumento, misurare l’assorbanza in una cella di 1 cm, quindi dal rapporto di quello che leggo sullo strumento e quello che ho in letteratura è la concentrazione dell’analita in g/100 ml.

Limiti della legge di Lambert-Beer:

• Concentrazioni: all’aumentare della concentrazione aumentano le forze interioniche e/o intermolecolari e possono formarmi molecole o aggregati di particelle che costituiscono qualcosa di diverso dalla molecola solvatata per cui si potrebbe avere uno spostamento del massimo di assorbimento, e può determinare una linearità.
• All’aumentare della concentrazione si ha un aumento dell’indice di rifrazione e quindi una maggior dispersione del raggio nell’attraversare la soluzione stessa.

Aspetti pratici

Dobbiamo trovare il modo di tirare fuori il principio attivo dalla compressa che contiene tutta una serie di eccipienti, quindi dobbiamo preparare una soluzione di questa compressa, le soluzioni devono essere limpide affinché passi la radiazione, se è necessario faremo delle diluizioni per raggiungere il range di linearità e metteremo la sostanza dentro a cuvette trasparenti di circa 3 ml di soluzione. La lettura va fatta in maniera che il cammino ottico sia sempre di 1 cm.

I solventi hanno a loro modo un assorbimento tipico, quelli comunemente usati non hanno transizioni alla frequenza analitica utilizzata. Per ogni solvente esiste una lunghezza d’onda minima, al di sotto della quale non può essere usato perché assorbe troppo. Se possibile, impiegare solventi non polari, in quanto interazioni forti fra solventi polari e soluti comportano la perdita della struttura fine, e quindi una perdita di informazione utile.

Linearità della legge di Lambert-Beer

Questa legge ha delle limitazioni, una di queste era la diluizione, però ho anche altre limitazioni che sono:

• Deviazione chimica: il campione si dissocia o associa in soluzione.
• Deviazione strumentale: valida per radiazioni monocromatiche, quindi per una lunghezza d’onda, non si possono usare strumenti che emettono radiazioni non monocromatiche.