Analisi dei farmaci III e degli alimenti

Analisi dei farmaci III e degli alimenti

Controllo di qualità dei metodi analitici

- Proprietà chimiche e fisiche delle molecole bioattive.

- Titolazioni e metodi di analisi chimica - (completamento rispetto a quanto previsto in Analisi dei Farmaci II).

- Spettroscopia UV/Visibile: strumentazione, analisi qualitativa (correlazione tra spettro UV e struttura chimica, effetto del pH e del solvente), analisi quantitativa (legge di Lambert-Beer, retta di calibrazione).

- Spettroscopia IR: strumentazione, applicazioni nell'analisi farmaceutica, spettroscopia NIR.

- Spettrometria atomica: di emissione e di assorbimento.

- Spettroscopia di emissione molecolare: spettrofotometria di fluorescenza.

- Spettrometria di massa: sorgenti (EI, CI, FAB, ESI, APCI e MALDI), analizzatori (settore magnetico, singolo e triplo quadrupolo, tempo di volo e trappola ionica). Applicazioni in campo farmaceutico e biologico.

- Tecniche cromatografiche: strumentazione ed applicazioni (TLC, HPLC e GC). Rivelatori per HPLC (UV/Vis, UV/Vis a fotodiodi ecc). Rivelatori per GC (FID, conducibilità termica, ecc). Analisi cromatografica quali-quantitativa.

- Elettroforesi capillare: strumentazione ed applicazioni.

- Metodi estrattivi nell'analisi farmaceutica.

Le metodiche analitiche impiegate per l’analisi dei farmaci devono essere adeguate in base:

• Al tipo di accertamento richiesto (quali-quantitativo).
• Alla struttura del composto in esame.
• Alle tecniche disponibili in laboratorio (metodi classici o strumentali).

Calcoli di base

Unità di misura della concentrazione

• % p/p = g / 100 g
• % p/v = g / 100 ml
• % v/v = ml / 100 ml
• ppm = 1 / 1.000.000 (1 mg/1.000.000 mg; mg/Kg, mg/g; 0,0001% p/p)
• ppb = 1 / 1.000.000.000 (1 mg/1.000.000.000 mg; 0,0000001% p/p)

Le ultime due unità di misura vengono utilizzate quando ci sono impurezze.

Soluzioni e densità

La densità è il rapporto della massa rispetto al volume: peso/massa — volume.

Concentrazione di una soluzione

Molarità: M = moli/litro = mmoli/ml

mM = mmoli/litro = mmoli/ml

nM = nmoli/litro

Normalità: N = equivalenti/litro

Se ho una soluzione nanomolare, a quanto corrisponde il micromolare? Devo dividere per 1000. Se parto da una soluzione molare e voglio arrivare al millimolare, moltiplico per 1000. Da sinistra a destra: moltiplico per 1000. Da destra a sinistra: divido per 1000.

moli = g/MW

g = moli x MW

mmoli = mg/MW

mg = mmoli x MW

Diluizioni

È necessaria perché molti strumenti lavorano solo a determinati range di concentrazione. Quando diluiamo un determinato volume con all'interno la sostanza, la quantità di sostanza non cambia: ciò che cambia è la concentrazione della sostanza dato che questa è distribuita in un volume maggiore. La quantità di analita rimane invariata, c1*v1 = c2*v2 (ovviamente variando il volume varia la concentrazione).

Regola della croce

È un metodo per miscelare due soluzioni per ottenere una terza soluzione a concentrazione intermedia. Fattore di diluizione (fd)

La diluizione è necessaria ad esempio per fare in modo che la concentrazione di una soluzione ricada nel range di utilizzo dello strumento in cui si intende fare l'analisi.

DF = C1/C2 = V2 / V10 ml -> a 100 ml, fd 10 (x 10)1fd (100/10)*(100/10) = 10 *10 = 100 (100 è il fattore di diluizione totale).

Se passo da una soluzione più concentrata a una più diluita, devo dividere. Se passo da una soluzione più diluita a una più elevata, devo moltiplicare.

Esempio

Add 15 ml of 1M NaOH to 5 ml of solution (A). Extract three times with ether, washing the ether extracts with 10 ml of water. Combine the aqueous layers and dilute to 100 ml. Take 10 ml of the diluted aqueous solution and dilute to 100 ml.

Abbiamo A in 5 ml; ci mettiamo 15 ml di NaOH. Questa diluizione non fa cambiare la quantità di analita. Prendiamo i 20 ml e li sbattiamo con l'etere, il quale estrae quello che vuole. Estraiamo nuovamente l'etere con 10 ml di acqua, che quindi aggiungiamo ai 20 ml. A questo punto abbiamo 30 ml. Prendo i 30 ml e li diluisco a 100 ml.

Per calcolare il fattore di diluizione ci dobbiamo riferire a 5 ml, il quale è poi stato portato a 100 ml. fd (100/5) x (100/10) = 20 x 10 = 200

Acqua ed etere non si mescolano.

Incertezza delle misure

È impossibile fare una misura esatta: ad ogni misura è associata un'incertezza più o meno grande. Questa impossibilità è dovuta a due ragioni:

• Nel fare una misura, si compiono inevitabilmente degli errori.
• Gli strumenti hanno una sensibilità limitata, per cui non sono in grado di distinguere grandezze che differiscono per meno di una certa quantità.

Esempio ponderale

Quale incertezza nella pesata di 2 mg di sostanza con una bilancia a 4 cifre decimali? +/- 0,1 mg di incertezza su 2 mg corrispondono ad una incertezza del 5%.

0,1:2=X:100

Esempio volumetrico

Quale incertezza nella titolazione con un volume di 10 ml in buretta con tacche da 0,1 ml? +/- 0,1 ml di incertezza su 10 ml corrispondono ad una incertezza analitica dell’1%.

0,1:10=X:100

Riportare i risultati

Peso medio di tre persone: Kg 71,2 Kg 75, 7 Kg 65,0 = 70,6333333 Kg

Le cifre significative debbono esprimere il risultato di una misura con il grado di accuratezza con cui questa è stata eseguita. Nei calcoli il risultato finale dovrà essere espresso con il numero di cifre significative relative al dato meno accurato. Per la maggior parte delle analisi si usano non più di 4 cifre significative che corrispondono ad una incertezza di circa lo 0.1%. Nel primo esempio, 0.22 indica la precisione. Il valore che ha generato 0.22 è non più accurato della prima cifra decimale, per cui non è corretto. Il valore corretto è 99.2 + o - 0.22.

Accuratezza, precisione e altri parametri che caratterizzano una metodica analitica

I parametri che caratterizzano un metodo analitico sono cruciali. Il processo di validazione richiede di esplicitare le caratteristiche di prestazione del metodo attraverso opportuni parametri di qualità del metodo di analisi e quindi del dato da esso prodotto. Un metodo deve essere validato. Il metodo di validazione è un processo che dimostra che la procedura analitica è effettivamente efficace e utile allo scopo per la quale quella procedura analitica è stata sviluppata.

Precisione e accuratezza

Una misura è tanto più precisa quanto più i singoli valori misurati si concentrano intorno alla media della serie di misure effettuate (esecuzione). Una misura è tanto più accurata quanto più la media delle misure si approssima al valore vero della grandezza (metodo ed esecuzione).

Errori sistematici

Influiscono sul risultato di una misura sempre in un medesimo senso e portano o a misure in difetto o in eccesso rispetto a quelle che si avrebbero in loro assenza. In linea di principio eliminabili; influenzano l'accuratezza.

Errori casuali

Originati da processi incontrollabili e indeterminati, variano in modo imprevedibile da una misura all'altra e influenzano il risultato qualche volta in eccesso, qualche altra volta in difetto. Riducibili ma non eliminabili (aumentando il numero di casi); influenzano la precisione.

Errori grossolani

Errori di calcolo, di lettura, di pesata, di diluizione, ecc.

Precisione di una misura dispersione

Il 68% delle misure è compresa nell'intervallo µ ± σ ed il 95% nell'intervallo µ ± 2σ. Il fattore σ è legato alla precisione delle misure: minore è la larghezza della curva, migliore è la precisione. Ai fini di valutare la precisione è quindi necessario poter stimare σ.

La precisione di una procedura analitica esprime il grado di concordanza o di dispersione fra una serie di misurazioni ottenute per lo stesso campione e viene comunemente espressa come DS (Deviazione Standard) o DSR (Deviazione Standard Relativa). La deviazione standard relativa è il rapporto tra la (deviazione standard / media) x 100. L'unità di misura della DSR? È adimensionale dato che deriva dal rapporto di due quantità con la stessa unità di misura.

La DSR ha una sua importanza soprattutto quando bisogna fare comparazioni di precisione tra metodi analitici che utilizzano, per esempio, unità di misura molto diverse (es. concentrazioni molti diverse in 2 paesi diversi).

Livelli della precisione

Quando si fa un’analisi, si parla di livelli di precisione. Sono 3: ripetibilità, precisione intermedia e riproducibilità del metodo.

• La ripetibilità è quella effettuata per vedere se, attraverso l’utilizzo di uno stesso operatore in diversi giorni e con gli stessi reagenti, si riesce a ottenere lo stesso risultato.
• La precisione intermedia riguarda diversi operatori con tempistiche diverse ma con lo stesso risultato; è intermedia poiché, magari, il laboratorio è lo stesso.
• La riproducibilità riguarda situazioni completamente diverse: reagenti diversi, laboratorio diverso, persone diverse, attrezzatura diversa.

Accuratezza di un metodo

Sinonimo di esattezza (e non di precisione). L’accuratezza di un metodo può essere stimata in un campione avendo la certezza della quantità di analita presente. L’accuratezza può essere impiegata per confrontare due metodi di analisi diversi: posso aver già determinato la quantità con un metodo stabilito e verificare l’accuratezza di uno nuovo. Può essere espressa come:

• Recupero % rispetto alla quantità nota di analita presente in un campione.
• Differenza fra la quantità nota e quella determinata sperimentalmente.

Linearità

È la capacità del metodo analitico di dare risultati che sono direttamente proporzionali alla concentrazione degli analiti nei campioni all’interno di un determinato campo di validità. Il criterio adottato per determinare la migliore retta prende il nome di criterio dei minimi quadrati.

Coefficiente di correlazione

Stima quanto bene i punti siano descritti da una linea retta. Range: intervallo compreso fra la minima e la massima concentrazione di analita per il quale è possibile ottenere un livello stabilito di precisione ed accuratezza.

Selettività (specificità)

Capacità di un metodo di effettuare la misura dell’analita in presenza di altri composti (simili) nel medesimo campione.

Robustezza

La capacità di precisione ed accuratezza di non risentire di piccole variazioni introdotte nel metodo.

Sensibilità

La capacità di discriminare tra piccole differenze di concentrazione di analita. Se la calibrazione è lineare, la sensibilità è il coefficiente angolare della retta di calibrazione. Pertanto la sensibilità è la quantità minima di sostanza che il metodo analitico è in grado di rilevare. È la capacità di rilevare piccole differenze.

Limite di rivelabilità

DL (Detection Limit) o LOD (Limit Of Detection): la concentrazione (o quantità) di sostanza che può essere rivelata ad un livello di fiducia noto. È la più piccola quantità di analita che può essere rivelata attraverso un particolare metodo. Dal punto di vista formale, è definito: – = 3.

Rumore di fondo

Variazione indesiderata del segnale, casuale e dipendente dal tempo (noise); segnale non dovuto all’analita, costante o lentamente variabile (deriva) (background).

Limite di quantificazione

QL (Quantification Limit) o LOQ (Limit of Quantification) è la più piccola quantità di analita che può essere quantificata in modo attendibile. –=10S B. Un analita può essere quantificato correttamente se la differenza di lettura fra campione e bianco è almeno dieci volte la DS del bianco.

Bianco analitico

Una miscela del tutto simile al campione da analizzare (reagenti e/o solventi) ma priva degli analiti di interesse.

Calibrazione

Operazione in cui uno strumento di misura viene regolato in modo da migliorarne l'accuratezza, attraverso il confronto di un determinato parametro con uno standard.

Spettroscopia UV-Vis

(λ UV: 200-400 nm, Vis: 400-800 nm)

Spettroscopia di assorbimento molecolare che promuove cambiamenti dell’energia elettronica della molecola.

λ UV: 200-800 nm. L’interazione con radiazioni UV-Vis può provocare la transizione di un elettrone da un orbitale molecolare di legame o di non legame ad un orbitale di anti-legame vuoto e quindi il passaggio della molecola da uno stato elettronico fondamentale ad uno dei vari stati eccitati possibili.

Transmittanza: rapporto tra la radiazione emergente e quella incidente T = P / 0. La transmittanza varia da 0 a 1 (campione assorbe totalmente = 0, campione non assorbe totalmente = 1).

T % = 100, Assorbanza: dice quanto il campione ne assorbe (non quanto trasmette) A = - log T10 A= log λ/T10 A= log P /P10 0. Transmittanza e assorbanza dipendono dalla lunghezza d’onda della radiazione impiegata.

Spettro UV-Vis

Uno spettro UV-Vis è un grafico in cui si riporta l’intensità della radiazione assorbita dal campione in funzione della lunghezza d’onda o frequenza della radiazione stessa. Ogni sostanza ha un particolare spettro di assorbimento, ciò permette di identificare una sostanza (per confronto diretto con campioni noti o tramite banche dati di spettri) o di controllarne il grado di purezza. Ciò che si presenta a basse frequenze non parte da 0 ma parte da un valore più elevato.

Aspetti quantitativi: Legge di Lambert-Beer

L’assorbanza dipende dalla concentrazione dell’analita e dalla lunghezza del cammino ottico. T = P/P = e -k b c 0 A= kb c. K è una costante. B è il cammino ottico (il portacampione è 1 cm e si fa quasi sempre riferimento a 1 cm). C è la concentrazione. La transmittanza va da 0 a 100. L’assorbanza va da 0 a infinito. Man mano che la transmittanza % diminuisce, l’assorbanza aumenta numericamente in modo diverso. Dal punto di vista teorico l’assorbanza può andare a infinito, tuttavia la sua variazione di solito è minima. Se ad esempio la T è 1, A varia fino a 3 (non fino a un numero alto!).

La legge fa riferimento alla assorbanza poiché la transmittanza varia in funzione della concentrazione in modo esponenziale e non lineare. T (non lineare rispetto alla concentrazione) diminuisce in modo esponenziale in rapporto alla concentrazione c del composto e alla lunghezza del percorso della luce, b, nel modo seguente: T= 10 -k b c. La legge di Lambert-Beer evidenzia la relazione lineare fra assorbanza e concentrazione; riveste grande importanza per determinazioni quantitative. IR è principalmente qualitativa, mentre l’UV-Vis è principalmente quantitativa.

Assorbanza specifica o molare

A= Assorbanza (A), Estinzione (E), Densità Ottica (D). La concentrazione può essere espressa in vari modi e, in base a come viene espressa, cambia la k. La costante ‘k’ misura l’assorbimento di una soluzione che ha una concentrazione generica pari a 1 ed un cammino ottico di 1 cm. Se cambia il modo di misurare la concentrazione, cambia di conseguenza la k. Tutto ciò è dipendente da una lunghezza d’onda specifica, ossia quella a cui decido di fare la determinazione quantitativa.

A= k b c c in g/L k = a (se la concentrazione è espressa g/L, la k prende il nome di assorbività)

c in % p/v (g/100ml) k = A (1%, 1cm) o E (1%, 1cm) (se la concentrazione viene espressa in % p/v, allora si parla di assorbanza specifica/estinzione specifica).

c in M (moli/L) k = e (se la concentrazione è espressa in moli/L, allora si parla di assorbanza molare/estinzione molare)

Queste costanti per specifiche lunghezze d’onda sono caratteristiche del composto in analisi, si riferiscono ad una cella di lunghezza 1 cm e dipendono anche dalla natura del solvente e dal pH.

Se noi trovassimo un valore di k espresso in concentrazione molare e volessimo invece esprimerlo in % p/v, possiamo farlo semplicemente. Cosa ci serve per passare da una concentrazione peso/volume ad una concentrazione molare? Bisogna conoscere il PM della sostanza che stiamo studiando: da una parte abbiamo la massa e dall’altra le moli.

a = A (1%, 1cm)/10 = e / MW

A (1%, 1cm) = e · 10 / MW

e = A (1%, 1cm) · MW / 10

Applicazioni in Farmacopea

Ad esempio dentro l’olio ci sono miscele e quindi non possiamo avere PM. La Farmacopea, allora, ha deciso di affidarsi sempre alla concentrazione peso/volume sia che si tratti di una miscela che di una sostanza pura. Se nella legge di Lambert-Beer ‘b’ è = 1 cm, possiamo ricavare la concentrazione della soluzione di cui noi andiamo a fare la misurazione. Quindi prepariamo una soluzione di cui vogliamo determinare la concentrazione UV-Vis, cosicché noi misureremo con lo strumento l’assorbanza sperimentale. La legge di Lambert-Beer è valida per soluzioni diluite. In soluzioni concentrate le molecole sono meno libere: queste nuove forme (diverse dalla molecola libera) possono avere diverso assorbimento e quindi potrebbero portare a risultati sfalsati. All’aumentare della concentrazione aumentano le forze interioniche e/o intermolecolari e possono formarsi molecole o aggregati di particelle più complesse, diverse per struttura da quelle