Analisi dei farmaci III e degli alimenti

Spettrometria di massa ad alta risoluzione (ESI-TOF/MALDI-TOF)

Si basa sul fatto che ioni con diverso valore m/z, sulla base della loro diversa velocità, impiegano tempi differenti a percorre una distanza definita. Gli ioni più pesanti raggiungono il rivelatore in ritardo rispetto a quelli più leggeri. Gli ioni m/z sono in grado di percorrere distanze diverse in base al loro peso: quelli più pesanti ci mettono di più. Questo tipo di analizzatore è un tubo molto lungo in cui gli ioni vengono fatti passare; solo quelli leggeri raggiungono il detector prima. È una tecnica ad alta risoluzione.

Se arrivano due ioni nello stesso tempo ma hanno energia diversa, quello a energia minore entra meno in profondità ed esce per primo dalla traiettoria rispetto a quello con maggiore energia che va più in profondità. Questo analizzatore lavora ad impulsi, ossia dalla camera gli ioni devono uscire nello stesso momento.

In order to increase the resolution, the ion trajectory is bent by

un analizzatore Orbitrap che funziona in modo simile a una trappola ionica. Gli ioni orbitano attorno a un elettrodo interno e, applicando opportuni potenziali, quelli con un determinato rapporto di m/z si muovono lungo una traiettoria instabile ed escono dall'analizzatore per arrivare al rivelatore. È possibile effettuare una scansione in questo modo, facendo uscire uno alla volta tutti gli ioni.

risoluzione 10 , quindi è uno degli strumenti a maggiore risoluzione (in Italia ne esistono solamente 5). Gli ioni entrano ed orbitano all'interno di un elettrodo generando campi elettrici, poi vengono trasformati mediante trasformata di Fourier generando uno spettro.

Modalità di acquisizione dei dati: Possiamo chiedere allo strumento di fare un full scan (tempo di lavoro molto breve, decimi di secondo), ossia di rilevare tutti gli ioni affinché si possano avere informazioni identificative, strutturali oppure di lavorare in SIM, ossia si vuole vedere solo uno specifico ione con fini quantitativi. Ovviamente per fare SIM bisogna prima avere fatto un full scan, ossia dal full scan prendo solo un ione. Se faccio la SIM, allora abbiamo maggiore accuratezza dato che lo strumento non è occupato a vedere tutti gli ioni ma è concentrato solo su uno. Quando si fa spettroscopia si utilizza infatti la SIM.

SIM - Selected Ion Monitoring: acquisizione di singoli

FULL SCAN: acquisizione di uno o più treni di ioni- In scan mode, the mass analyzer monitors a range of mass-to- charge ratios. In SIM mode, the mass analyzer monitors only a few mass-to-charge ratios.- SIM mode is significantly more sensitive than scan mode but provides information about fewer ions. Scan mode is typically used for qualitative analyses. SIM mode is used for quantitation and monitoring of target compounds.

Esempio: Determinazione nel plasma dell'acido valproico

1. estrazione ed aggiunta dello SI,
2. derivatizzazione,
3. analisi GC-MS,
4. identificazione: tr e frammentazione,
5. analisi quantitativa in SIM.

Analisi quantitativa in SIM selezionando lo ione m/z opportuno con minimo rumore di fondo.

L'acido valproico è una sostanza anticonvulsivante. Viene prelevato il plasma; si fa una estrazione e si aggiunge uno standard d'interno (analisi quantitativa), in questo caso si utilizza C18; aggiungo un derivatizzante per avere qualcosa di più

volatile dato che siamo in gascromatografia; faccio l'analisi gascromatografica; ottengo degli spettri, uno relativo all'acido valproico e uno dello standard che differiscono per 4 unità di massa atomica. In questo sistema i ricercatori quindi fanno un'analisi quantitativa guardando i due picchi specifici delle sostanze escludendo tutto il resto.

Applicazioni della spettroscopia di MS all'analisi farmaceutica:

• Determinazione o conferma dell'identità o della struttura di farmaci.
• Accoppiata alla GC o alla LC fornisce metodi per la caratterizzazione delle impurezze presenti in farmaci e negli eccipienti usati per la loro formulazione.
• GC-MS ed LC-MS forniscono metodi altamente specifici per la determinazione dei farmaci e dei loro metaboliti nei liquidi e nei tessuti biologici.
• La spettrometria di massa non è pienamente utilizzata di routine nel controllo di qualità (CQ), ma ha il suo posto di elezione nel comparto ricerca e sviluppo.

per la risoluzione di problemi specifici che nascono da processi di routine o nel corso dello sviluppo di un processo.

La strumentazione è abbastanza costosa, richiede operatori altamente specializzati.

Questi limiti tendono ad essere gradualmente superati: spettrometri da banco e semplificazione delle procedure.

Spettrometria di massa tandem (massa-massa)

Il primo analizzatore (MS1) seleziona tra i vari ioni presenti in un o spettro lo ione desiderato (ione padre o genitore) che viene successivamente fatto collidere con un opportuno gas (He, Ar) in una cella di collisione (CDI), e i frammenti (ioni figli), così generati vengono separati dal secondo analizzatore (MS2) in base al loro rapporto m/z.

CID: Collision Induced Dissociation

La spettrometria di massa tandem utilizza più analizzatori che vengono sottoposti in serie. Le tecniche di ionizzazione sono le stesse, ma lo strumento è più complesso: il prodotto di ionizzazione passa attraverso un primo

per analizzare e separare gli ioni in base al loro rapporto m/z. Questo strumento è composto da due analizzatori collegati in serie. Nel primo analizzatore, gli ioni vengono separati in base al loro rapporto m/z. Successivamente, gli ioni passano attraverso il secondo analizzatore, dove possono essere ulteriormente frammentati. La frammentazione avviene quando gli ioni vengono bombardati con energia, causando la rottura delle loro molecole in frammenti più piccoli. Questa seconda frammentazione può fornire informazioni aggiuntive sulla struttura e l'identificazione degli ioni. Infine, gli ioni frammentati passano attraverso un terzo analizzatore che si occupa della separazione degli ioni derivanti da questa frammentazione. Questo permette di analizzare e identificare gli ioni frammentati in base alle loro masse e cariche. L'utilizzo del primo analizzatore consente di separare diversi ioni. Ad esempio, se abbiamo una molecola che produce vari frammenti, possiamo utilizzare il primo analizzatore per selezionare quale ione vogliamo che venga ulteriormente frammentato e di cui vogliamo analizzare gli ioni frammento prodotti. Questo è particolarmente utile nello studio della frammentazione, in quanto ci permette di identificare il progenitore di un determinato frammento. In conclusione, lo strumento di spettrometria di massa tandem è ampiamente utilizzato per l'analisi e l'identificazione degli ioni, consentendo la separazione, la frammentazione e la caratterizzazione di molecole complesse.anche accoppiato ad uno strumento di frammentazione ESI; l'ESI fa una scarsa frammentazione dal punto di vista strutturale, allora lo ione pseudomolecolare generato dall'ESI viene selezionato in modalità sim in maniera che sia l'unico ad uscire dall'analizzatore e l'unico a passare in un secondo analizzatore in modo che si abbia una seconda analizzazione. La camera del secondo analizzatore è riempita di un gas. Quindi con l'ESI identifico lo ione pseudomolecolare e grazie alla spettroscopia di massa tandem valuto la frammentazione dello ione (informazioni strutturali). Abbiamo quindi 3 analizzatori messi in serie. Elevata selettività: si seleziona lo ione frammento che è l'unico a comparire nel cromatogramma. Esempio: Questa molecola di interesse farmaceutico può essere analizzata tramite ESI. La sostanza viene analizzata con un detector di massa elettro-spray (ESI) e otteniamo un picco fondamentale. Il frammentopuò essere selezionato dal primo analizzatore che viene messo in modalità "sim" e poi portato al secondo analizzatore dove subisce una seconda frammentazione; i frammenti vengono fatti passare nel terzo analizzatore dove vengono separati e si può ottenere uno spettro. A questo punto faccio delle considerazioni relative alla struttura. Lo spettro che si ottiene secondo questa modalità in realtà non è perfettamente sovrapponibile con quello che otterrei con un EI. Infatti con un EI abbiamo una situazione molto standardizzata per avere spettri che costituiscono delle librerie; in questo caso invece gli spettri ottenuti non sono riproducibili dato che si sono varie situazioni che possono essere modificate. Queste sono ad esempio il tipo di gas utilizzato, la pressione del gas all'interno della cellula di collisione, oppure gli ioni devono essere accelerati per entrare nella cella e quindi può essere sia un potenziale di collisione che una.

energia di collisione che possono essere modificati; lo spettro che si ottiene è quindicaratteristico e non esistono biblioteche per gli spettri ottenuti con la spettrometria di massa tandem. Non c'è quindi riproducibilità di questo sistema; l'unico modo per ottenerla è lavorare sempre nello stesso campo e alle stesse condizioninello stesso laboratorio. Anche nota come Massa-Massa (MS/MS) per Tripli Quadrupoli. Un triplo quadrupolo è sostanzialmente uno strumento di massa-massacaratterizzato da una sorgente di ionizzazione, che può essere ESI, PCI, EI, ecc.; il primo quadrupolo può funzione da selezionatore di unoione che passa nel secondo quadrupolo che altro non è una cella di collisione nella quale avviene la frammentazione, poi i risultati dellaframmentazione passano nel terzo quadrupolo che è utilizzato sia in full-scan che in sim. Esempio: analisi di un composto beta-adrenergico che dà uno spettroin

HPLC con detector di massa ESIIl terzo quadrupolo è utilizzato in modalità sim per selezionare uno ione frammento. In questo esempio nella camera di ionizzazione abbiamo la formazione di ioni; il primo quadrupolo è usato per selezionare lo ione M+H, lo si manda al secondo quadrupolo usato per la frammentazione e si forma un determinato ione, il quale viene inserito nel terzo quadrupolo in modalità sim per identificare esclusivamente quello ione.Il sistema, dunque, è estremamente selettivo. Questo sistema è un detector, ossia è a valle di un sistema cromatografico; abbiamo quindi la possibilità di selezionare uno ione con la massa desiderata e, dopo la frammentazione, possiamo avere informazioni relative solo a lui. Abbiamo una doppia selezione. Se noi mettiamo un sistema di questo genere a valle di un sistema cromatografico, aumentiamo notevolmente la selettività.Gli spettri ottenuti mediante CID possono risultare diversi per

uo interno di una camera di reazione, la distribuzione di ioni frammento e la loro abbondanza possono essere influenzate da diversi fattori. Uno di questi è la variazione dell'energia collisionale. L'energia collisionale si riferisce all'energia cinetica degli ioni che collidono tra loro durante una reazione. Aumentando l'energia collisionale, si aumenta la probabilità che gli ioni si frammentino in particelle più piccole. Al contrario, diminuendo l'energia collisionale, si favorisce la formazione di ioni più grandi. Un altro fattore che può influenzare la distribuzione di ioni frammento è la pressione del gas all'interno della camera di reazione. Aumentando la pressione del gas, si aumenta la probabilità di collisioni tra gli ioni, favorendo così la frammentazione. Al contrario, diminuendo la pressione del gas, si riduce la probabilità di collisioni e si favorisce la formazione di ioni più grandi. In conclusione, la distribuzione di ioni frammento e la loro abbondanza possono essere modificate variando l'energia collisionale e la pressione del gas all'interno di una camera di reazione.