Patologia molecolare

Patologia molecolare

Malattie genetiche

Agenti mutageni e meccanismi di mutazione. Trasmissione dei caratteri patologici. Malattie monogeniche ad ereditarietà mendeliana: malattie autosomiche dominanti, m. autosomiche recessive, m. X-linked. Ereditarietà non classica. Patologie da triplette: Sindrome del X-fragile. Imprinting genomico: sindrome di Angelman e Prader-Willy. Basi molecolari ed esempi di malattie da alterazione di un singolo gene: ipercolesterolemia familiare, PKU, alterazioni di proteine strutturali (osteogenesi imperfecta, Sindrome di Ehlers-Danlos, Sindrome di Marfan, Distrofia muscolare), patologie da alterazioni di canali e trasportatori, malattie da accumulo lisosomiale. Alterazioni numeriche e strutturali dei cromosomi.

Diagnostica molecolare delle malattie genetiche

Diagnosi pre- e postnatale. Metodi di diagnosi delle malattie genetiche e cromosomiche.

Fisiopatologia del sangue

Emopoiesi e cellule staminali. Caratteristiche delle cellule del sangue. Patologia del metabolismo del gruppo eme: porfirie ed itteri.

Patologia genetica degli eritrociti

Anemie da diminuita produzione: anemie megaloblastiche, anemia da carenza di ferro. Anemie emolitiche da cause intrinseche ed estrinseche: falcemia, talassemie, eritroenzimopatie, alterazioni del citoscheletro, MEN. Diagnostica di laboratorio.

Le neoplasie

Nomenclatura. Cenni di classificazione ed epidemiologia. Caratteristiche delle cellule tumorali. Tumori benigni e maligni. Proto-oncogeni e geni oncosoppressori. Grading e staging. Oncogenesi virale. La crescita tumorale e la progressione neoplastica. Le cause dei tumori. Cancerogenesi chimica-fisica. Progressione neoplastiche. Metabolismo dei tumori. Le cellule staminali del cancro. Patologie delle cellule staminali: linfomi, leucemie. Marcatori tumorali. Diagnostica molecolare delle neoplasie. Utilizzo di anticorpi monoclonali in oncologia. Diagnostica di laboratorio.

Invecchiamento cellulare

Basi cellulari dell'invecchiamento. Riduzione della replicazione cellulare. Accumulo di danno genetico e metabolico. Sindromi da invecchiamento precoce: sindromi di Werner, Hutchinson-Gilford, Bloom, Xeroderma pigmentosum, Cockayne. Telomerasi, senescenza e cancro.

Malattie neurodegenerative

Amiloidosi, Morbo di Alzheimer, Morbo di Parkinson, Malattie da Prioni, Corea di Huntington.

Patologia generale

Studio (logos) della sofferenza (pathos). Patologia = studio delle malattie. La Patologia Generale studia:

• Gli agenti che provocano la comparsa delle manifestazioni patologiche (eziologia = conoscenza delle cause delle manifestazioni patologiche).
• I meccanismi con cui gli agenti eziologici direttamente o indirettamente modificano lo stato di salute, cioè la patogenesi.

Eziologia e Patogenesi

Eziologia: studia gli stimoli patogeni o i fattori di malattia. La patogenesi: studia i meccanismi responsabili della comparsa di malattie, cioè la sequenza degli eventi che seguono l’esposizione delle cellule o dei tessuti all’agente eziologico e che portano all'espressione finale della malattia. Malattia idiopatica: eziologia e/o patogenesi non ancora definite.

Patologia molecolare

Studia le cause ed i meccanismi dei processi patologici a livello cellulare e molecolare. Cerca di spiegare come un cambiamento genetico dia luogo ad un particolare fenotipo clinico.

Fisiopatologia generale

Studia le risposte ai processi patologici di tessuti, organi e sistemi.

Patologia genetica

Studia effetti fenotipici di mutazioni → malattie genetiche.

Eziologia

• Cause intrinseche
• Cause estrinseche
• Fisiche (traumi meccanici, esposizione a temperature estreme, radiazioni, elettricità)
• Chimiche (acidi, basi, veleni, pesticidi, …)
• Biologiche (batteri, virus, ricketsie, funghi, parassiti)

Genoma umano

< 3% del genoma (circa 25000 geni) codifica per le proteine. > 50%, blocchi di sequenze ripetute di nucleotidi a funzione ignota.

Mutazione

È un cambiamento permanente nella sequenza del DNA. Porterà a modifica stabile ed ereditabile del patrimonio genetico. Possiamo quindi dire che le mutazioni sono eventi casuali, rari e stabili che producono un cambiamento ereditabile nel patrimonio genetico. Principale causa della variabilità genetica. Elementi fondamentali per l’evoluzione. Possono essere spontanee oppure causate da agenti fisici, chimici o biologici. Possono avere conseguenze deleterie o (raramente) vantaggiose per un organismo o per i suoi discendenti.

• Di piccole dimensioni (puntiformi): Mutazione può essere: - sostituzioni di basi, - inserzioni o delezioni.
• Di grosse dimensioni (delezioni).
• Coinvolgere il numero o la struttura dei cromosomi.

Frequenza e tasso di mutazione

Frequenza di mutazione: frequenza di una mutazione in una popolazione nel momento dell’osservazione. È una misura “statica” della sua incidenza. Tasso di mutazione: frequenza con cui una mutazione si origina ex novo in una unità di tempo (di solito una generazione). È una misura dinamica, riferita a quante “nuove” mutazioni si realizzano per unità di tempo “biologico”.

Esempio: Il tasso di mutazione è di una nuova mutazione ogni 7 divisioni cellulari. La frequenza di mutazione nella 4^° generazione è di 2 mutanti su 16 cellule.

Selettività delle mutazioni

Dal punto di vista selettivo una mutazione può risultare:

• Vantaggiosa → l’organismo che la porta ha una “fitness” (capacità riproduttiva) maggiore.
• Svantaggiosa → l’organismo che la porta ha una “fitness” minore.
• Neutra → non influenza la fitness di chi la porta.

Esistono centinaia di diverse emoglobine mutanti in tutta la popolazione umana. Molte di queste forme sono dannose e danno origine a forme patologiche. Altre sono "neutre" e non sembra arrechino ai portatori né vantaggi né svantaggi. L’effetto delle mutazioni va sempre correlato all’ambiente in cui l’organismo si trova: una data mutazione può rivelarsi svantaggiosa in un dato ambiente, vantaggiosa in un altro.

Il vantaggio dell’eterozigote nelle regioni malariche

Alcune varianti alleliche del gene β (la variante HbS in Africa, le varianti βThal nel Mediterraneo) di per sé dannose, hanno frequenze elevate in regioni malariche (o ex malariche). L’alta frequenza (fino al 30%) di questi alleli nelle regioni malariche, è dovuta al fatto che l’eterozigote, a differenza dell’omozigote sano che possiede due alleli β normali, non si ammala di malaria. Quindi l’eterozigote ha (o ha avuto) una maggiore probabilità di riprodursi trasmettendo i suoi geni (quindi anche l’allele S o βThal) alla progenie rispetto al w/t. In zone malariche i portatori (eterozigoti per la mutazione HbS) sono avvantaggiati rispetto agli omozigoti sani. In ambiente non malarico i portatori e gli omozigoti per l’allele sano hanno la stessa fitness. La resistenza alla malaria degli eterozigoti è dovuta al fatto che il Plasmodio non riesce a completare il suo ciclo nei loro globuli rossi.

Tipi di mutazioni

Mutazioni somatiche: non ereditabili dalla progenie. Da una cellula somatica mutata verrà prodotta una linea mutata, ma la mutazione non verrà trasmessa alle generazioni successive. Alcune di queste mutazioni possono rendere le cellule maligne e provocare tumori. Mutazioni germinali: colpiscono i gameti e possono essere trasmesse alla prole, dando luogo ad un individuo mutato sia nelle cellule somatiche che germinali.

• Mutazione Somatica: colpisce solo l’individuo nel quale avviene.
• Mutazione Germinale: riguarda tutti gli individui delle generazioni future.

Mosaicismo

Coesistenza di 2 o più linee cellulari geneticamente distinte nello stesso individuo. La mutazione colpisce una cellula dello zigote o dell’embrione. Tutte le cellule che originano dalla mutazione e l’individuo risulterà essere un mosaico di cellule normali e di cellule mutate.

Comune nelle piante, sia in natura che nelle varietà selezionate dall’uomo. Rara nei poliploidia: animali, nei mammiferi è sempre incompatibile con la vita.

Mutazioni: conseguenze

Mutazioni in regioni codificanti

Una mutazione che cade in sequenze regolatrici può alterare il legame coi fattori di trascrizione, influendo sul livello di trascrizione del gene e quindi sulla quantità di proteina. Ho mutazioni sia di geni esoni che di promotori, può capitare entrambe. Conseguenze diverse se interessa promotore non sarà un effetto (alterazione sulla quantità di proteina piuttosto che sulla qualità) qualitativo ma quantitativo Un’alta percentuale (98%) del nostro genoma contiene regioni non codificanti. Le mutazioni che riguardano queste regioni non hanno di solito alcuna particolare conseguenza sul fenotipo, sono quindi selettivamente neutre.

Polimorfismi del DNA

Un sito viene detto polimorfico se di esso si conoscono almeno 2 forme alleliche la più rara delle quali ha una frequenza di almeno l’1% → Identificazione individuale (medicina forense, paternità).

Mutazioni nei siti di splicing

Mutazioni che avvengono nelle sequenze introniche di solito non hanno effetto sul fenotipo, a meno che non cadano in particolari sequenze localizzate ai confini tra esone e introne → ritenzione/omissione di un esone.

Nomenclatura delle mutazioni

Si fa riferimento alla sequenza del DNA codificante (c.) o a quella del DNA genomico (comprensivo di introni, g.) o a quella della sequenza amminoacidica della proteina (p.). Sostituzioni aminoacidiche: Gli aa si indicano con una lettera: F = fenilalanina, Q = glutamina, X = STOP. R117H: l’aminoacido arginina (R) in pos 117 è stato sostituito da Istidina. G542X: l’aminoacido glicina (G) in pos 542 è stato sostituito da STOP.

Inserzioni (ins), delezioni (del)

F508del = delezione della fenilalanina in posizione 508. 1162 (G→A): sostituzione della guanina 1162 con una adenosina.

Sostituzioni nucleotidiche

c.1001+11 C→T: 1001 è l’ultimo nt. di un esone, la mutazione è la sostituzione C→T dell’11^° nt. dell’introne immediatamente a valle. c.621+1(G→T): sostituzione della guanina con una timina nella prima pos dell’introne immediatamente dopo la pos 621.

Meccanismi di mutazione

Mutazioni spontanee

Insorgono in condizioni normali in assenza di specifici agenti esterni identificabili. Mutazioni indotte da agenti mutageni: si verificano come risultato di interazioni del DNA con un agente o un mutageno esterno che provoca un danno al DNA. Mutageno = agente fisico/chimico che aumenta in modo significativo la frequenza degli eventi mutazionali al di sopra del tasso spontaneo di mutazione.

Mutazioni spontanee

Molto rare. Ruolo importante in fenomeni biologici quali l’evoluzione e la cancerogenesi. Probabilmente implicate nell’invecchiamento, nelle malattie autoimmuni e neurodegenerative, nell’aterosclerosi. Si verificano con maggiore frequenza in alcuni siti definiti punti caldi (hot spots). Le cause possono essere:

• Esogene: presenza nell’ambiente di agenti mutageni come radiazioni cosmiche, radionuclidi e composti chimici che possono interagire casualmente con il DNA.
• Endogene: prodotte da errori nei processi di ricombinazione, replicazione e/o riparazione del DNA.

Cause delle mutazioni spontanee

1. Tautomeria delle basi
2. Deaminazione
3. Depurinazione
4. Errori nella replicazione, ricombinazione, riparazione del DNA
5. Danni da ossidazione
6. Radiazioni

Meccanismi spontanei di insorgenza di mutazioni

Tautomeria delle basi

Modificazioni spontanee ed occasionali delle basi del DNA, una particolare condizione per la quale una molecola si presenta sotto due diverse forme pur avendo lo stesso numero di atomi. Si formano spontaneamente o quando le basi si ionizzano.

Passaggio di stato: stato chetonico normale → enolico raro.

Esempio: conseguenza sulla proteina: proteina è diversa perché da ta ho cg dal processo di replicazione.

Depurinazione

L’alterazione che colpisce più frequentemente il DNA (5000 depurinazioni/cellula/giorno) è la depurinazione, cioè la perdita di basi puriniche per scissione spontanea. Si rompe il legame glicosidico e si perde una G o una A. Se la mutazione non viene riparata, durante la replicazione nel filamento di nuova sintesi potrà essere incorporata qualunque base.

Deaminazione spontanea della citosina

Uracile. Il danno è rilevabile! (U non è una base del DNA). La citosina dopo che è andata incontro a deaminazione spontanea viene riparata nel seguente modo: riparazione (BER). La citosina può deaminare spontaneamente per formare l’uracile. Questa mutazione spontanea viene riparata dall’uracil-DNA-glicosidasi che idrolizza il legame glicosidico tra l’uracile e il deossiribosio. Una endonucleasi prima e poi la DNA polimerasi I e la DNA ligasi intervengono nel riparare e inserire la citosina. BER: corregge errori che avvengono spontaneamente durante il processo replicativo, per tautomerizzazione, deaminazione o alchilazione → timina.

Deaminazione della 5-metil-citosina

Modificazioni epigenetiche: Metilazione del DNA da parte della DNMT (DNA metil transferasi), enzima importante per la regolazione genica. 5-metil-citosina: conformazione che modifica la struttura della citosina, ma non ne modifica l’appaiamento con la G. Circa 3% delle citosine nel DNA dei vertebrati è metilato. 5-metil-citosina nel genoma: identifica i punti caldi di mutazione (siti del DNA in cui la frequenza di una mutazione è molto aumentata). Ottengo instabilità della 5-metil-citosina e quindi il danno non è rilevabile. Quindi... Se il prodotto della mutazione è una base naturale, i sistemi di riparazione non possono riconoscere l’errore.

Errori nella replicazione

La DNA polimerasi può compiere errori di duplicazione. Per esempio, può inserire una T al posto di una G. Generalmente questi errori vengono riparati dal complesso di duplicazione in fase di correzione di bozze, ma alcuni sfuggono a questa funzione e diventano permanenti. Errori nella replicazione: DNA polimerasi III (5’ → 3’): compie errori con frequenza di 1/10⁵ basi. Sistema di correzione di bozze (3’ → 5’): riduce gli errori 1/10⁷. Causa di delezioni/duplicazioni: I cromosomi omologhi si appaiano in maniera scorretta (spesso a causa della presenza di regioni vicine a sequenze simili) scambiandosi pezzi di cromosoma non omologhi.

Mutazioni indotte da mutageni

Come può avvenire:

• Agenti mutageni: Analoghi delle basi, Agenti alchilanti, Acido nitroso, Agenti intercalanti, Micotossine, Radiazioni → Vengono incorporati nel DNA.
• Analoghi delle basi: 5-bromouracile, analogo della timina. Nello stato normale si comporta come la timina, mentre nello stato raro come la citosina.
• Agenti alchilanti: introducono mutazioni in seguito a metilazione. Non sono incorporati nel DNA ma alterano una base provocando errori di appaiamento. Esempio: Aggiungono gruppi alchilici alle basi del DNA: una guanina metilata si comporta come una adenina. Una timina metilata si comporta come una citosina.
• Acido nitroso: deaminazione delle basi del DNA.
• Agenti intercalanti (chimicamente simili alle purine): molecole capaci di inserirsi tra le basi. Possono causare inserzioni o delezioni di singole coppie di basi (mutazione frameshift). In seguito all’inserimento di un agente intercalante nel DNA, al momento della duplicazione si possono produrre inserzioni o delezioni, sulla base del fatto che questo si inserisca sul filamento stampo o sul filamento di nuova sintesi. Il bromuro di etidio è un potente agente mutageno intercalante!

Danni da ossidazione

Il termine stress ossidativo o “squilibrio REDOX” indica l'insieme delle alterazioni che si producono nei tessuti, nelle cellule e nelle macromolecole biologiche quando queste sono esposte ad un eccesso di agenti ossidanti. L'effetto è costituito da alterazioni metaboliche, danno e morte cellulare. Squilibrio tra ros e antiossidanti a favore di questi ultimi. I danni da ROS sono quindi danni da radicali superossido, perossido di idrogeno e radicali ossidrilici OH.

Il test di Ames

Il test di Ames, ideato da Bruce Ames nel 1973, è un test genetico per l'analisi della genotossicità di una sostanza, molto utilizzato ad esempio in ambito biomedico e farmaceutico-industriale nella fase preclinica di sperimentazione di nuove molecole e per analisi ambientali. Il principio del test si basa sulla valutazione della capacità di un sospetto mutageno di provocare la reversione di un carattere auxotrofo his- in un ceppo di batteri mutato (Salmonella typhimurium), rendendolo nuovamente capace di sopravvivere in un terreno privo di istidina. La maggior parte dei ceppi di Salmonella utilizzati nel test presentano anche altre mutazioni che alterano la permeabilità della parete (rfa-, elimina la catena polisaccaridica dei lipopolisaccaridi di membrana), consentendo l'ingresso nel batterio di mutageni anche di grosse dimensioni, o eliminano l'azione dei meccanismi di riparo del DNA (ΔuvrB, delezione del gene uvrB), permettendo in tal modo il mantenimento delle mutazioni ottenute. Poiché l'assenza di meccanismi di riparo rende complessa la crescita del batterio, in molti casi si introduce nel ceppo il plasmide pKM101, contenente i geni per il sistema di riparo SOS del DNA, incline a commettere errori durante la riparazione.