Patologia molecolare

Patologia molecolare 101-10

Principi di interpretazione dei test di laboratorio

I biomarcatori sono tra gli analiti che hanno visto una evoluzione esponenziale, arrivando ai biomarcatori molecolari ed hanno fatto la differenza. Sappiamo che molti tumori hanno una base genetica ben precisa (per es. duplicazione, mutazione). Nel momento in cui si capisce qual è la base genetica e si definisce un biomarcatore molecolare alla base di quel tumore, il tipo di approccio terapeutico può essere, a quel punto, personalizzato (la chemioterapia non è un approccio personalizzato).

La medicina personalizzata è un argomento che sta a cuore a medici e ricercatori perché può garantire una maggior probabilità di successo e può evitare di sbagliare terapia (per es. la terapia a base di anticorpi monoclonali contro recettori di superficie di cellule tumorali che vanno bene in alcuni casi si tratta di anticorpi che legano, quindi bloccano, recettori di fattori di crescita e la cellula va in apoptosi. Ma ci sono casi di tumore in cui una molecola di trasduzione del segnale è mutata, per esempio KRAS. Se KRAS è nella via di segnalazione avviata dal recettore del fattore di crescita e se questa mutazione di KRAS lo rende sempre attivo, un anticorpo che blocca il recettore non serve a nulla perché KRAS, che è a valle, è sempre attivo).

Capire le basi molecolari delle malattie, individuare i marcatori molecolari, consente di arrivare a terapie personalizzate che possono garantire un maggiore successo. La diagnostica di laboratorio rappresenta una delle aree di maggiore sviluppo della medicina moderna. Ha consentito un allungamento della vita media. I clinici utilizzano le analisi di laboratorio dal momento in cui il bambino è ancora nell’utero per predire future malattie fino a determinare, post-mortem, le possibili cause del decesso.

La medicina di laboratorio comprende più discipline specialistiche

• Ematologia: esame degli elementi figurati del sangue. Ematocrito esame del sangue che indica la percentuale del volume sanguigno occupata dagli eritrociti; formula leucocitaria quantità di globuli bianchi e percentuale ma anche numero assoluto delle cellule che sono nella categoria dei globuli bianchi (importante esame per leucemie).
• Biochimica clinica: valutazione quantitativa di oltre 200 diverse sostanze nel siero e nei liquidi organici (plasma componente liquida di un sangue reso non coagulabile, contiene i fattori della coagulazione; siero componente fluida di un sangue coagulato).
• Medicina trasfusionale: screening dei donatori, preparazione componenti ematiche, prove di compatibilità. Gruppo 0 donatore universale.
• Microbiologia clinica: diagnostica batteriologica, micologica, virologica, parassitologica.
• Microscopia clinica: esame urine e fluidi organici. L’analisi microscopica degli elementi figurati del sangue o delle urine è utilissima, può aiutare molto nella diagnosi. Per esempio, le anemie da carenza di ferro hanno una caratteristica particolare che ne permette una facile identificazione, hanno globuli rossi più piccoli e ipocronici. Nel caso delle urine possiamo trovare cellule, sulla base del tipo di cellula e della quantità possiamo avere un’indicazione che ci suggerisce un percorso di ulteriori esami. Se troviamo cellule epiteliali, riconducibili ad un epitelio uretrale tendenzialmente non ci si preoccupa (normale sfaldamento) ma quando ci sono globuli rossi, per esempio, possiamo pensare ad una lesione (a livello vescicale o renale). Le emazie nelle urine si possono trovare anche in caso di una “banale” cistite (infiammazione importante spesso di origine batterica), però, una cosa del genere porta con sé una sintomatologia clinica importante (cistite è dolorosa). Vedere la pipì rossa con dolore da cistite non deve allarmare. Altra storia è vedere globuli rossi a livello di urine senza sintomi perché in questo caso può essere un problema renale: impermeabilità che viene meno del rene oppure un problema tumorale a livello renale. Analogo discorso si può fare per gli altri elementi figurati. Se c’è un problema a livello di barriera renale ci aspettiamo che prima di tutto aumenteranno le proteine (per le dimensioni) le proteine sono le prime che passano.
• Diagnostica immunologica: serie tecniche di laboratorio che si basano sull’utilizzo di anticorpi; es. SAGGI ELISA (molto utili nella diagnostica della celiachia). La diagnostica delle leucemie si avvale in maniera imprescindibile dell’utilizzo di anticorpi che servono per identificare non solo il tipo di cellula da cui il clone tumorale (clone leucemico) si è sviluppato ma servono anche per capire il grado di indifferenziamento (quanto più è indifferenziata la cellula) della cellula che ha dato origine al clone leucemico. Gli anticorpi monoclonali vengono utilizzati per identificare il tipo di cellula (monocita, linfocita) e per capire quanto indietro nella filiera di maturazione c’è stato il blocco che ha dato origine al clone tumorale. Questo tipo di diagnostica è essenziale per decidere il tipo di terapia. Quindi la diagnostica immunologica si avvale di anticorpi non solo per i saggi ELISA ma anche per definire l’immunofenotipo delle cellule leucemiche.
• Immunologia: valutazioni qualitative e quantitative dell’immunità cellulare e umorale per es. valutazione della presenza di immunoglobuline IgE oppure può essere importante capire se c’è un aumentato numero o un’aumentata attività di altri tipi cellulari come i mastociti. Alcuni soggetti hanno i mastociti iperattivati.

Significato della medicina di laboratorio

I laboratori per l’analisi su materiali derivati dall’organismo umano hanno il proposito di fornire informazioni per la diagnosi, la prevenzione e la terapia delle malattie o la valutazione dello stato di salute degli esseri umani. I campioni che il laboratorista è chiamato ad analizzare sono il sangue (sangue intero, plasma, siero), l’urina, le feci, il liquido cerebrospinale, il liquido amniotico, seminale, l’escreato, i succhi gastrici e duodenali, i liquidi circolanti e cavitari e frammenti di tessuto (utilizzati per tecniche più raffinate di immunoistochimica o anche di identificazione di microRNA).

I microRNA sono dei biomarcatori molecolari che stanno diventando sempre più interessanti non solo per il loro ruolo di indicatori di alcune patologie (aumentano o diminuiscono in certi contesti) ma anche per il fatto che in molti tumori la loro espressione è deregolata. È fondamentale che le informazioni siano esenti da errori, tempestive, di facile interpretazione ed utilizzazione nel processo diagnostico-terapeutico. A fronte di una spesa che non supera il 3% del budget di un’istituzione sanitaria, le informazioni di laboratorio sono essenziali nel 60-70% delle decisioni cliniche (ricovero, dimissioni, cure). Quindi l’informazione di laboratorio ha un elevato valore informativo clinico associato ad una spesa quasi irrisoria.

Ci sono laboratori legati a dipartimenti di emergenza, si chiamano laboratori di reparto, abbinati a sale operatorie, strutture di terapia intensiva. Dato che in questi laboratori è richiesta tempestività di informazione, si tratta di strumenti che sono ad altissima tecnologia, di semplice e rapido utilizzo e in genere semiquantitativi. Viceversa il laboratorio generale è quello che fornisce test quantitativi, è certificato (ISO 9001) in termini di corrispondenza del prodotto agli obiettivi analitici prefissati e di corrispondenza del processo agli standard predefiniti, possiede apparecchiature automatizzate e consente la valutazione di una numerosa compagine di analiti. Terza tipologia di laboratorio che consente la diagnostica di pochi analiti è il laboratorio specialistico. Per esempio, la immunofenotipizzazione nella diagnostica delle leucemie è un tipo di indagine che non viene fatta in tutti i laboratori generali. Il secondo e il terzo sono i laboratori che maggiormente si avvalgono di tecnologie informatiche e dell’automazione. Più elevata è l’automazione minore è il contatto dell’operatore con il campione.

Processo totale dell’analisi di laboratorio (“brain to brain”)

Le analisi che vengono fatte in laboratorio prendono origine dal medico curante. Si procede alla raccolta del materiale, che poi viene smistato. Si procede con le analisi e alla fine viene prodotto un referto che molto spesso è interpretabile dal paziente perché vengono indicati degli asterischi che indicano un valore sopra o sotto un determinato range di riferimento ma non necessariamente (non è soltanto il range di riferimento il sistema di cui ci si avvale per interpretare i risultati).

Motivazione delle richieste

• Diagnosi: come conferma, esclusione o ricerca di uno stato fisiopatologico che comporti l’alterazione di uno o più analiti.
• Valutazione del decorso di una malattia e della risposta del paziente alla terapia, con conseguente valutazione prognostica.
• Valutazione dello stato di salute.

Spesso ci si imbatte in richieste improprie da parte del medico curante: 1) quelle fatte per tranquillizzare il paziente sul suo stato di salute; 2) quelle fatte per non essere accusato di non aver sottoposto un suo paziente ad un determinato esame che avrebbe potuto essere determinante per una corretta diagnosi. Vanno evitate: inutile pericolo (seppur minimo) per il paziente; costo inutile per l’individuo e per il sistema sanitario.

Il referto analitico

Si compone di 4 parti:

• Identificazione del campione: indicazione del materiale di partenza su cui si esegue analisi.
• Esame eseguito e risultato: con indicazione anche dell’unità di misura.
• Valori di riferimento: è possibile che siano riportati per gruppi di popolazione. Ci sono molti analiti che presentano dei valori che sono molto diversi per esempio in funzione dell’età o di sesso.
• Riferimenti tecnici e metodologici: questo permette di confrontare esami che sono stati fatti in laboratori diversi (un approccio metodologico diverso può portare a esiti diversi). È molto importante che le indagini vengano condotte avvalendosi di un medesimo laboratorio di analisi; questo consente una maggiore riproducibilità dei valori e soprattutto al medico di confrontare. Questo è particolarmente importante non tanto quando i valori di un’analita vengono confrontati con un range di riferimento ma è molto importante quando ci si avvale di un sistema interpretativo diverso (si chiama “differenza critica”). È proprio una differenza tra i valori che l’analita ha o ha avuto in due misurazioni temporalmente distinte. Per molti analiti le cui misurazioni vengono fatte temporalmente in due momenti distinti e per i quali non ci si avvale dei range di riferimento ma piuttosto va valutata la differenza di valori da un tempo t0 a un tempo t1 ecco che a maggior ragione capiamo l’importanza di eseguire gli esami nel medesimo laboratorio.

Non sempre, ma può essere presente anche un commento interpretativo o una conclusione.

La variabilità degli esami di laboratorio

C’è un elemento importantissimo che non può essere annullato ma è importante sapere che esiste questo parametro che è la variabilità, consente poi di adottare l’approccio metodologico migliore per interpretare i dati. La variabilità è uno dei problemi centrali nell’utilizzo dei dati di laboratorio da parte del clinico.

La variabilità totale è costituita da due componenti:

• Variabilità analitica
• Variabilità biologica

La variabilità analitica e quella biologica non sono indipendenti. Infatti la variabilità biologica è sinonimo, corrisponde alla variabilità pre-analitica.

Variabilità analitica

È legata alla precisione ed accuratezza delle analisi, quindi dipende unicamente dalle prestazioni del laboratorio: queste devono essere tali per cui se vengono eseguite determinazioni multiple sullo stesso campione biologico, le differenze che si riscontrano devono essere minime. Nel laboratorio sono disponibili degli standard di cui si conosce la concentrazione quindi il responsabile che ha in gestione lo strumento più volte al giorno carica gli standard per i quali lo strumento deve restituire i valori attesi; questo è controllare che il sistema sia perfettamente tarato. Tutte queste accortezze fanno sì che la variabilità analitica sia minima le misurazioni fatte degli stessi campioni in momenti successivi restituiscono differenze minime.

Variabilità post analitica

È legata ai processi che avvengono una volta ottenuti i risultati analitici e che consistono nella validazione, stesura del referto, firma dello stesso e sua trasmissione in tempi brevi. Questo tipo di variabilità si è molto ridotta grazie all’evoluzione dei sistemi informativi. Ha un impatto molto basso: sicuramente l’efficienza dei sistemi informatici ha consentito di ridurre al minimo questo tipo di variabilità.

Variabilità pre-analitica: variabilità biologica

La vera componente della variabilità totale che ha un impatto importante è la variabilità pre-analitica, quella che precede le analisi. Questa è il risultato della variabilità biologica.

Se si esegue una determinazione di un componente su prelievi fatti in giorni diversi da uno stesso individuo, si osserverà una variabilità di risultati maggiore rispetto a quella ottenuta da ripetute determinazioni dello stesso prelievo (imprecisione analitica), e ancora di più se lo stesso componente viene misurato in individui diversi, questo è il risultato della variabilità biologica.

Principali cause della variabilità biologica sia inter che intra-individuale:

• Ritmi circadiani (variazioni circadiane ormoni, il cortisolo, il GH)
• Variazioni stagionali (aumento conc. proteine totali e colesterolo nei mesi invernali; diminuzione trigliceridi in estate).
• Ciclo mestruale (variazione conc. ormoni, aumento creatinina e acido urico durante il periodo mestruale, diminuzione albumina e proteine totali a metà ciclo).
• Dieta (diete molto ricche in glucidi; aumentano fosfatasi alcalina e lattato DH; diete iperproteiche; aumentano urea e fosfati nel sangue; alto rapporto di acidi grassi insaturi vs. acidi grassi saturi provoca una variazione della colesterolemia).
• Gravidanza (diminuzione proteine totali, albumina e sideremia).
• Sesso (differenze dovute alle diverse influenze ormonali o legate alla diversa massa corporea; intervalli di riferimento specifici per maschi e femmine).
• Etnia (esempio: PSA nei maschi afro-americani maggiore che nei caucasici in accordo con una maggior incidenza del tumore prostatico; bassa incidenza nei giapponesi, più elevata nei giapponesi emigrati negli Stati Uniti per cambio stile di vita).
• Massa corporea (differenze negli enzimi muscolari, nei lipidi plasmatici, nei livelli dei peptidi natriuretici)
• Età (esiste una fisiologica modificazione della funzionalità di sistemi enzimatici, organi e apparati nelle diverse età, specialmente fra età pediatrica e età adulta).
• Attività fisica (particolarmente significativi gli aumenti di enzimi e metaboliti legati alla funzione muscolare, creatinina, transaminasi, creatin chinasi).
• Localizzazione geografica (i cambiamenti improvvisi ad esempio di altitudine possono portare a diminuzione glucosio e proteine totali, aumento lattato nel sangue, aumento numero globuli rossi... in generale i cambiamenti improvvisi e rapidi possono portare alterazioni).
• Fumo di tabacco
• Ingestione recente di cibo o alcol; assunzione di droghe o farmaci
• Postura
• Disturbi del sonno - Stati di ansia - Affaticamento fisico – Immobilizzazione forzata
• Presenza di patologie

La variabilità biologica è quella responsabile della variabilità pre-analitica. Preanalitica, analitica e post analitica sono nella categoria della variabilità analitica. La variabilità biologica si compone della variabilità intra e inter-individuale.

Nel primo grafico abbiamo in ascissa i risultati e in ordinata i soggetti. Il pallino è il valore medio che un certo analita assume in una popolazione di 10 individui. La variabilità intra-individuale è riportata come barretta, non c’è pallino perché anche se consideriamo un unico soggetto lui non ha un unico valore, il suo analita presenta delle differenze in condizione di salute. Un soggetto non si può dire abbia un unico valore ma a caratterizzarlo sarà un range di valori che sono intorno al punto omeostatico che può essere considerato il valore medio dei valori che il suo analita ha nell’ambito di valutazioni fatte in tempi differenti.

Variabilità biologica intra-individuale

È definita come fluttuazione casuale di un costituente dell’organismo, misurato in tempi diversi nello stesso individuo, intorno al suo punto omeostatico. La concentrazione di qualsiasi componente dell’organismo non è un parametro statico, ma è il risultato di un equilibrio fra “entrate” ed “uscite”. Definisce l’individualità del soggetto.

Punto omeostatico: definizione Valore di concentrazione all’equilibrio dinamico tra entrate ed uscite. Le entrate sono l’introduzione con la dieta ma anche il rilascio...