Patologia Molecolare

Patologia molecolare

Il termine patologia significa letteralmente studio della sofferenza, quindi lo studio delle varie malattie. La patologia generale studia gli agenti che provocano la comparsa delle manifestazioni patologiche e i meccanismi con cui questi agenti modificano lo stato di salute portando ad alterazioni strutturali e funzionali tipiche di una malattia. Le malattie in cui eziologia o patogenesi non sono ancora definite vengono chiamate idiopatiche. L’eziologia quindi studia la causa, la patogenesi i meccanismi. Quando di una malattia non si conosce la causa viene detta idiopatica.

Fattori eziologici

I fattori eziologici possono essere di due tipi:

• Intrinseci: Fattori genetici come alterazioni di DNA
• Estrinseci: Acquisiti come cause

• Fisiche: Traumi meccanici, esposizione a temperature estreme, radiazioni, elettricità
• Chimiche: Acidi, basi, veleni, pesticidi
• Biologiche: Batteri, virus, funghi o parassiti
• Alimentari

Raramente il fattore eziologico è unico.

Patologia genetica

La patologia genetica studia gli effetti fenotipici delle mutazioni che determinano così le malattie genetiche. Alcune malattie come la fibrosi cistica o la distrofia dipendono da mutazioni genetiche, invece, ad esempio radiazioni e traumi dipendono da fattori esogeni. Poi vi sono i fattori epigenetici che cambiano l’espressione genica: cioè modificano il fenotipo senza alterare la sequenza genetica.

Mutazioni

Una mutazione rappresenta un cambiamento permanente nella sequenza del DNA, cioè una modificazione stabile ed ereditabile del patrimonio genetico. Le mutazioni rappresentano la principale causa della variabilità genetica. Possono essere spontanee (soggetto mai esposto ad un agente mutageno) o causate da agenti fisici, chimici o biologici. Vi sono vari tipi di mutazioni che si distinguono:

• In base all’estensione della regione bersaglio in:
  • Geniche o puntiformi
  • Cromosomiche
  • Genomiche
• In base alla loro natura molecolare
  • Puntiformi: Sostituzioni, inserzioni e delezioni
  • Cromosomiche: Variazioni nel numero e nella struttura
• In base all’effetto che provocano sulla proteina:
  • Missenso
  • Nonsenso
  • Silenti
  • Frameshift
• In base al tipo cellulare in cui hanno origine
  • Somatiche: Colpiscono solo l’individuo in cui avviene e quindi non sono ereditabili dalla progenie. Da una cellula somatica mutata verrà prodotta una linea mutata, ma la mutazione non verrà trasmessa alle generazioni successive. Alcune di queste possono rendere le cellule maligne e provocare tumori.
  • Germinali: Riguardano tutti gli individui delle generazioni future. La mutazione può essere trasmessa attraverso i gameti alla generazione successiva, dando luogo ad un individuo mutato sia nelle somatiche che nelle germinali.
• In base alla causa scatenante:
  • Spontanee
  • Indotte

L’esposizione ad un mutageno quindi causa l’induzione di una mutazione. Nelle cellule somatiche possono sviluppare neoplasia o effetti teratogeni che possono determinare malformazioni alla nascita. Nelle cellule germinali, se vi sono alterazioni letali allora si avrà un aborto, con alterazioni genetiche allora si avranno individui con anomalie cromosomiche o geniche.

Mutazioni spontanee e indotte

Le mutazioni inoltre possono essere spontanee o indotte da mutageni. Se un agente aumenta il tasso di mutazione al di sopra di un certo livello allora è definito agente mutageno. Le spontanee si verificano come risultato di processi naturali che avvengono nelle cellule come errori di replicazione. Quelle indotte da agenti mutageni si verificano come risultato di interazioni del DNA con un agente o un mutageno esterno che provoca un danno al DNA. Le cause delle mutazioni spontanee sono 6:

1. Tautomeria delle basi
2. Deaminazione
3. Depurinazione
4. Errori nella replicazione, ricombinazione e riparazione del DNA
5. Danni da ossidazione
6. Radiazioni

Tautomeria delle basi

Modificazioni spontanee ed occasionali delle basi del DNA. Le basi del DNA per il 99% si possono trovare in uno stato chimico normale, ma possono anche passare da uno stato normale a uno raro: gli atomi rimangono sempre quelli ma la conformazione varia. Ad esempio, la timina nel 99% si presenta nella stato chetonico normale e lega l’adenina, nello stato raro si presenta come forma enonica: cambia la conformazione della timina e così non è più in grado di interagire con l’adenina ma con la guanina non con 2 legami idrogeno ma con tre. Quando il DNA si replica, si inserisce la timina rara e così cambia la base e alla successiva replicazione al posto di T-A si avrà C-G. Questo meccanismo riguarda anche il fatto che molti agenti mutageni chimici inducono mutazioni in questo modo. La citosina si può anche appaiare con la forma rara dell’adenina.

Deaminazione

Un esempio è la deaminazione spontanea della citosina che perde il gruppo NH₂ e si trasforma in uracile. Ma l’uracile non è una base normale del DNA e a questo punto c’è un sistema di riparazione che nota la presenza di U e interviene nella sostituzione. Un sistema di riparazione è il sistema BER che funziona bene ad esempio in questo caso perché è facile riconoscere l’U che non fa parte del DNA. Ma nel caso di altre basi non riescono bene a capire che la base è sbagliata.

• Si forma l’uracile
• Interverrà per primo l’uracil-DNA-glicosidasi che stacca l’uracile
• Poi interverranno una endonucleasi, una DNA polimerasi I e una ligasi che inseriscono dentro la base corretta.

Un altro esempio è la metilazione della citosina. Avviene quando la citosina si trova dietro una guanina. In molti geni le citosine sono metilate a livello del promotore ed è una sorta di controllo dell’espressione genica perché se le citosine sono iper-metilate il gene è più spento. Modifica la struttura della citosina ma non ne modifica l’appaiamento con G. La 5-metil-citosina può venire deaminata trasformandosi così in una timina. Dal legame C-G si passa al legame T-A. Circa il 3% delle citosine nel DNA dei vertebrati è metilato come controllo dell’espressione genica. I punti in cui ci sono molte citosine metilate sono detti punti caldi di mutazione. Questo danno non è rilevabile dal BER. La metilazione è causata dalla DNA metil transferasi.

Depurinazione

È l’alterazione che colpisce più frequentemente il DNA e rappresenta la perdita di basi puriniche per scissione spontanea. Viene persa una guanina o una adenina. C’è un sistema di riparazione che inserisce la base, se il sistema non funziona si ha così la perdita ad esempio di una guanina e ciò comporta nel filamento di DNA lo sviluppo di una mutazione frameshift. Fino a quella base va tutto bene, da lì in poi si avrà lo sfalsamento della lettura.

Errori di replicazione

La DNA polimerasi può compiere errori di duplicazione. Ad esempio può inserire una T al posto di una G ma generalmente questi errori vengono riparati dal complesso di duplicazione in fase di correzione, ma alcuni sfuggono e diventano permanenti.

Meccanismi di riparazione

• Riparazione per: (intervengono anche nella riparazione dei danni causati da luce UV)
  • Escissione di basi (BER)
  • Escissione di nucleotidi Mismatch repair
• Riparazioni sul posto
  • MGMT (O-6-metilguanina-DNA metiltransferasi)
• Riparazione di Double strand breaks (DSB)
  • Ricombinazione omologa
  • Giunzione non omologa delle estremità

Agenti mutageni

Possono essere classificati in:

• Analoghi delle basi
• Agenti alchilanti
• Acido nitroso
• Agenti intercalanti
• Micotossine
• Radiazioni

Gli analoghi delle basi sono dei composti chimici che hanno una struttura simile all’anello delle basi e vengono incorporati nel DNA. Il 5-bromouracile è analogo alla timina. L’agente chimico per contatto, inalazione o ingestione passa attraverso la membrana ed entra nel nucleo e viene incorporato al posto della timina. Alla successiva replicazione questo analogo può interagire non con una A ma è capace di aderire con una G. Si avrà la sostituzione di T-A con C-G. Se si appaia con l’adenina non si verificano errori di replicazione. Un altro analogo è la 2-amminopurina che è simile alla timina ma nella successiva replicazione al posto di legarsi ad A si lega a C.

Agenti alchilanti

Fanno parte di alcuni farmaci anti-neoplastici. Sono detti alchilanti perché contengono gruppi alchilici. Entrano nel DNA e aggiungono i gruppi nella base. Ad esempio l’etil-metano-sulfonato interagisce con una guanina aggiungendo il gruppo alchilico formando l’etil-guanina. Questa cambia la sua conformazione diventando in grado di interagire non più con la C ma con la T.

Acido nitroso

Determina deaminazione delle basi del DNA:

• La citosina diventa uracile e si lega all’adenina
• L’adenina diventa ipoxantina e si lega alla citosina
• La guanina diventa xantina
• La timina non viene deaminata

Un altro composto è l’idrossilammina che modifica la citosina in idrossilammin citosina che è capace di interagire con l’adenina.

Agenti intercalanti

Sono simili alle purine e sono utili in laboratorio perché diventano fluorescenti sotto luce UV. Vengono mescolati nella provetta col DNA e sono capaci di inserirsi tra le basi. Uno di questi è il bromuro di etidio usato per individuare le bande del DNA. Possono inserirsi nel filamento stampo o in quello di nuovo formazione. Se si inserisce nel filamento stampo può far comparire una mutazione per inserzione, se si inserisce in quello di nuova sintesi si ha mutazione per delezione.

Danni da ossidazione

Sono causati da radicali superossido, perossido di idrogeno e radicali ossidrilici OH (ROS: specie reattive dell’ossigeno). Queste fanno bene perché da una parte scatenano l’infiammazione e fanno fuori l’agente lesivo ma dall’altra possono interagire con le basi del DNA. Ad esempio interagendo con una guanina creano una nuova base che può appaiarsi in maniera errata con l’adenina causando sostituzioni di base del tipo GT. Per definire tali caratteristiche si usa un test che prevede l’uso di batteri.

• Si parte dal composto chimico che si deve testare per valutare la presenza di un agente chimico o cancerogeno
• Si aggiunge un estratto di microsomi epatici perché il fegato contiene anche enzimi particolari che hanno il compito di detossificare
• Poi si crea una cultura dei batteri che non crescono in presenza di istamina
• La sostanza chimica se mutata o cancerogena viene attivata e induce mutazioni nel genoma. I batteri mutati vengono evidenziati seminandoli in un terreno privo di istamina.

Danni fisici da radiazioni

Le radiazioni possono essere di 2 tipi:

1. Ionizzanti: Sono le più pericolose e hanno una energia elevata. Interagiscono con gli atomi trasformandoli nella forma ionica. Tra queste vi sono i raggi alfa, beta, gamma e i raggi X
2. Non ionizzanti: Hanno una minore energia e provocano un aumento del livello energetico degli atomi con cui interagiscono e tra queste vi sono i raggi UV e gli infrarossi.

Le ionizzanti colpiscono il DNA e possono provocare rotture cromosomiche e quindi sia riarrangiamenti che mutazioni puntiformi. Non c’è una dose soglia particolare al di sotto della quale dal punto di vista biologico non si hanno alterazioni. Gli effetti si dividono in diretti o indiretti. Direttamente la radiazione interagisce col DNA. Gli effetti indiretti sono quelli per cui la radiazione interagisce con la molecola d’H₂O o di O₂ cambiandole e facendo venir fuori le ROS. Le eccitanti interagiscono con un filamento del DNA quando ci sono due pirimidine una di fianco all’altra (ad esempio due T). Le due timine interagiscono tra di loro e si ha una distorsione dell’elica e quindi si ha la comparsa della mutazione.

Danni biologici

Le aflatossine sono prodotte da alcuni funghi come l’Aspergillus Flavius che contaminano i cereali. La più pericolosa è l’aflatossina B1 che si attacca alla guanina in posizione N provocando la rottura del ponte tra la G e lo zucchero con liberazione della base e la formazione di un sito apurinico. Sui dimeri di T viene usato il NER (riparazione per escissione di nucleotidi). Si inserisce il dimero di timina e si va a creare una bolla intorno alla lesione. Una endonucleasi crea dei nick a monte e a valle della lesione e con un sistema enzimatico viene eliminato il dimero e poi si va a ricucire il tutto. Se il gene che codifica per questo meccanismo di riparazione è mutato si avrà una patologia detta Xeroderma Pigmentosum. Questa è caratterizzata da numerose lesioni pigmentose cutanee che portano a insorgenza di carcinomi multipli. Le mutazioni che in generale riguardano i sistemi di riparazione del DNA sono importanti perché sono alla base delle neoplasie.

Classi di mutazioni

• Mutazioni puntiformi
  • Sostituzioni di basi
    • Transizioni
    • Transversioni
  • Mutazioni frameshift
    • Delezioni
    • Inserzioni
• Espansioni di triplette
• Ampie inserzioni e delezioni (rare)

Effetti sulla sequenza amminoacidica

1. La mutazione è detta sinonima o silente se c’è un cambiamento di una base con un’altra che non comporta un cambiamento nell’aminoacido.
2. La nonsenso è una sostituzione di un aa di una tripletta con un’altra che codifica con un codone di stop. La proteina risulterà incompleta e si hanno effetti deleteri sulla funzione genica.
3. La missenso è sostituzione di un aa con un altro. Può essere più o meno grave in base al tipo di aa che viene sostituito:
   • Neutra o conservativa: Sostituzione di un aa con un altro con proprietà chimiche simili. Conseguenze spesso non gravi sulla funzione proteica (es. lisina e arginina).
   • Non conservativa: L'aa sostituito ha caratteristiche chimiche diverse dall'aa originale. La proteina avrà così un aa diverso e ci saranno conseguenze gravi per la funzione proteica.
4. Sostituzione read-through: Un codone di stop viene sostituito da un codone che specifica per un aa. C’è così un allungamento del prodotto proteico.
5. Mutazioni frameshift: Si ha una delezione o inserzione di una o più coppie di basi nella sequenza codificante di un gene. Dal punto della mutazione in poi verranno incorporati aas sbagliati. Se questo avviene con 3 nucleotidi allora la lettura non sarà sfalsata (come nel caso in cui viene introdotto un codone non senso) ma risulterà o accorciata o allungata.

Vi sono poi mutazioni che riguardano anche gli enhancer. Ciò si ritrova in alcune beta-talassemie. In questo caso la mutazione è corretta ma si può avere una riduzione o assenza di trascrizione. Negli introni possono determinare splicing o mRNA difettosi, traduzione compromessa e assenza della proteina.

Patologie recessive e dominanti

Le malattie genetiche ad eredità mendeliana possono essere ereditate in 3 modi:

• Malattie autosomiche dominanti
• Malattie autosomiche recessive
• Malattie legate all’X

Perché alcune patologie sono dominanti e altri recessive? Le malattie sono dominanti quando è espressa in eterozigosi e recessive in omozigosi. Questa differenza dipende da come la mutazione cambia il fenotipo e ciò può avvenire in 2 modi:

1. Mutazioni loss of function: il prodotto che ne deriva ha una funzione ridotta o assente
2. Mutazioni gain of function: il prodotto ha acquisito nuove caratteristiche

Le malattie dovute ad acquisto di funzioni sono dette dominanti. Nella cellula si avrà il 50% di proteine normali e il 50% di proteine che hanno acquisito la funzione diversa. La presenza dell’allele normale non impedisce al prodotto dell’allele mutato di comportarsi in maniera anomala. Le malattie enzimatiche invece sono principalmente recessive perché se fosse mutato un solo allele si avrebbe un 50% di enzima mutato e un 50% di enzima normale. Se nella cellula c’è il 50% di enzima normale questo funziona lo stesso e quindi la malattia si eredita in modo recessivo. L’acquisizione di una nuova funzione è abbastanza rara nelle malattie ereditarie ma molto comune nel cancro.

Acondroplasia

È la più comune forma di nanismo che colpisce 1:25.000 nati vivi. C’è un mancato sviluppo della cartilagine delle ossa lunghe. La mutazione riguarda il recettore FGFR2 che in condizioni normali esplica un controllo negativo sulle cellule della cartilagine. Invece, nel caso della mutazione si avrà un’attività tirosin-chinasica maggiore quindi il recettore sarà sempre attivo, trasduce sempre il segnale rallentando la proliferazione dei condrociti. In omozigosi è letale.

Per le malattie dominanti dovute a perdita di funzione si parla di aploinsufficienza. La presenza del 50% del prodotto dell’allele normale non è sufficiente per una normale funzione. Si riscontra ad esempio nell’ipercolesterolemia familiare e nella sindrome di Marfan. A volta viene prodotto un peptide che, oltre a non svolgere la normale funzione, può interferire con la funzione dell’allele normale in un soggetto eterozigote (dominante negativo), si ritrova ad esempio nell’osteogenesi imperfetta. Generalmente le malattie con perdita di funzione sono recessive. Per molte proteine la quantità precisa non è cruciale e può bastare un apporto dimezzato. Gli eterozigoti e cioè i portatori sono sani: una riduzione del 50% viene tollerata se il rimanente 50% è sufficiente per una funzione normale. I soggetti malati saranno quindi omozigoti o eterozigoti composti.