Patologia molecolare

Patologia genetica

Studia gli effetti fenotipici delle mutazioni. Gli agenti eziologici che le causano possono essere intrinsechi (genetici; Distrofia muscolare, Emofilia, Fibrosi cistica) ed estrinseci, questi ultimi si distinguono in chimici, fisici, biologici (virus, batteri). Le malattie multifattoriali sono causate da entrambi i fattori (Diabete, Aterosclerosi, ecc.).

Mutazione germinale

È un cambiamento casuale, stabile ed ereditabile nella sequenza del DNA, sono responsabili della variabilità genetica e possono avere conseguenze neutre, positive o negative. La conseguenza dipende dall'ambiente in cui l'organismo si trova, un esempio è il vantaggio dell'eterozigote nelle regioni malariche (varianti alleliche del gene β, Hbs in Africa e βThal nel Mediterraneo) che non si ammala di malaria. La mutazione somatica non è ereditabile dalla progenie.

Tasso di mutazione

È la frequenza con cui una mutazione si origina ex novo nell'unità di tempo, nell'uomo è di 10⁵/gene/generazione, la frequenza di mutazione è la frequenza della mutazione in una popolazione.

Classificazione delle mutazioni

• In base alla dimensione della regione bersaglio: geniche (puntiformi), genomiche, cromosomiche.
• In base alla natura molecolare:
  • Cromosomiche: variazione del numero o della struttura.
  • Puntiformi: sostituzioni (trasversioni e transizioni), inserzioni, delezioni (la Fibrosi cistica è causata da una delezione di un codone del gene CF, ciò causa la produzione della proteina CFTR mancante di un amminoacido).
• In base alla conseguenza sulla proteina:
  • Sinonime/silenti: il cambiamento nel codone non causa il cambiamento dell’amminoacido.
  • Nonsenso: sostituzione di un amminoacido con un codone di stop, quindi la proteina è incompleta.
  • Missenso: sostituzione di un amminoacido con un altro, può essere:
    • Neutra: sostituzione di un amminoacido con un altro con proprietà chimiche simili.
    • Non conservativa: l’amminoacido sostituito ha caratteristiche chimiche diverse dall’amminoacido originale; l’eterozigote può avere un vantaggio selettivo.
    • Sostituzione read-through: un codone di stop è sostituito da un codone codificante per un amminoacido, causa l'allungamento della proteina.
    • Mutazione frameshift: risultato di una delezione/inserzione di 1 o più basi nella sequenza codificante il gene, se è di 3 nucleotidi o multipli la lettura non è sfasata ma la proteina sarà accorciata/allungata; causa lo slittamento della fase di lettura dell’mRNA.
• In base alla regione in cui sono:
  • Sequenze codificanti: hanno effetto sul fenotipo:
    • Mutazioni “loss of function”: il prodotto che ne deriva ha una funzione ridotta o assente. Gli effetti della perdita di funzione possono essere recessivi o dominanti (Aploinsufficienza: la ridotta quantità di proteina data dall'allele normale non è sufficiente per una normale funzione). A volte il peptide prodotto, oltre ad essere privo di funzione, interferisce con l’allele normale in un soggetto eterozigote (effetto dominante negativo; interessa proteine multimeriche come il Collagene I: Osteogenesi imperfecta). Le malattie sono generalmente recessive quindi i soggetti malati sono omozigoti per la mutazione.
    • Mutazioni “gain of function”: il prodotto che ne deriva ha acquisito una funzione nuova o diversa. Le malattie dovute a queste mutazioni sono dominanti (es., acondroplasia: mancato sviluppo armonico della cartilagine delle ossa lunghe; dovuta alla mutazione di FGFR3: il recettore in condizioni normali esplica un controllo negativo sui condrociti, la mutazione causa un'attività tirosin-kinasica aumentata del recettore).
  • Sequenze regolatrici (non codificanti): negli enhancer altera il legame con i fattori di trascrizione, negli introni possono dare splicing, mRNA difettoso o traduzione compromessa, nel confine tra introne ed esone da omissione di un esone.
• In base alla causa che le ha prodotte:
  • Spontanee: avvengono in assenza di agenti esterni:
    • Tautomeria delle basi: quando le basi dalla loro normale forma chetonica/iminica passano a quella rispettivamente enolica/aminica, avviene spontaneamente o quando le basi si ionizzano; ciò causa appaiamenti errati.
    • Deaminazione: es.: la deaminazione della C in U è riparata dall’Uracil-DNA-glicosidasi, che idrolizza il legame glicosidico tra U e deossiribosio, poi l’endonucleasi, la DNApol I e la DNA ligasi inseriscono una nuova C. Modificazioni epigenetiche possono causare la metilazione del DNA da parte della DNA-metil-transferasi: metilazione della C in 5-metil-C rendendola instabile, ciò la porta a deaminare a T. In questo caso la T è una base naturale del DNA quindi non è riconosciuta come errore. Questo tipo di mutazioni identificano i punti caldi di mutazione (dove la frequenza di mutazione aumenta).
    • Depurinazione: (più frequente) perdita di basi puriniche per scissione spontanea (rottura del legame glicosidico), se questo errore non è riparato durante la trascrizione è inserita una qualsiasi base.
    • Errori nella replicazione/crossing over (tra cromosomi non omologhi)/riparazione del DNA: la DNApol III compie 1 errore ogni 10⁵ basi, il sistema di correzione di bozze riduce ad 1 ogni 10⁷ basi. Processo di riparazione del DNA: riconoscimento del danno (MSH) → eliminazione del DNA danneggiato (DNA glicosilasi o endonucleasi) → riparazione (DNA elicasi, esonucleasi, DNApol, DNAligasi); ci sono diversi meccanismi:
      • Escissione di basi (BER): la C è deaminata a U che si trova appaiato alla G → la glicosilasi taglia il legame glicosidico tra base e zucchero → danno da depurinazione → Endonucleasi AP e Fosfodiesterasi tolgono lo zucchero → la DNApol aggiunge il nucleotide corretto usando l'altro filamento come stampo → la DNA ligasi salda il nick.
      • Escissione di nucleotidi (NER): dimero di T → interviene il complesso UvrA (riconosce la distorsione dell'elica)/UvrB (denatura il DNA nel sito) → l'endonucleasi UvrC crea un nick a monte e a valle della lesione → rimosso la porzione con la lesione.
      • Mismatch repair, riparazione di Double Strand Breaks (DSB), ricombinazione omologa (HR), giunzione non omologa delle estremità (NHEJ).
    • Difetti in questi meccanismi possono causare malattie ereditarie (se riguardano le cellule germinali) o tumori (cellule somatiche), per esempio il Xeroderma Pigmentosum, dovuto a mutazioni in geni coinvolti nel NER ed è associato ad un rischio > 2000 volte di tumori cutanei, indotti dall’esposizione ai raggi solari. Causa anomalie cutanee (nelle zone del corpo esposte al sole: eritema, aree di iperpigmentazione e ipopigmentazione, tumori benigni e maligni), oculari e neurologiche (microcefalia, progressivo ritardo mentale).
  • Indotte: da agenti mutageni (aumentano la frequenza degli eventi mutazionali oltre il tasso spontaneo di mutazione):
    • Analoghi delle basi: avendo struttura simile alle normali basi vengono inseriti nel DNA. Ad esempio, il 5-Bromouracile, analogo della T, che nello stato normale si appaia con l'A, in quello raro ionizzato con la C; la 2-amminopurina, analogo dell'A, che nello stato normale si appaia con la T, in quello raro protonato come la G.
    • Agenti alchilanti: metilano la base dando errori di appaiamento (la G metilata si comporta come A, la T metilata come C).
    • Acido nitroso: deamina le basi (la C → U, l'A → C, la G → Xantina).
    • Agenti intercalanti: (EtBr) simili alle purine che si inseriscono tra le basi, causano inserzioni/delezioni di singole basi durante la replicazione dando mutazioni frameshift.
    • Danni da ossidazione: danni da radicali superossido, perossido di idrogeno e radicali ossidrilici; es. la G diventa 8-ossi-7,8-diidro-deossiG e si appaia con l'A causando transversioni G→T.
    • Test di Ames: l'estratto di microsomi epatici e il composto chimico da analizzare (procancerogeno) sono aggiunti ad un ceppo di salmonella deficiente in medium con His, se il composto chimico è cancerogeno da mutazioni nel genoma batterico → i batteri vengono piastrati su terreno con His per vedere se sono mutati.
    • Radiazioni ionizzanti (> ε, comprendono raggi X, α, β, γ e cosmici; interagiscono con gli atomi espellendo gli elettroni più esterni: ionizzazione degli atomi) e non ionizzanti (< ε, raggi UV, visibili e infrarossi; interagiscono con gli atomi aumentando il livello energetico: eccitazione). Le radiazioni ionizzanti hanno sia effetti diretti (rotture cromosomiche e quindi riarrangiamenti e mutazioni puntiformi), che indiretti (producono ROS).
    • Tossine vegetali: l'Aflatossina B1 si attacca alla G in N7 causando la rottura del ponte tra base e zucchero con liberazione della base e formazione di un sito apurinico.

Difetti di trasporto

Trasporto di ioni

• Fibrosi cistica: patologia AR multiorgano caratterizzata da mutazioni nel gene CF (cromosoma 7, 27 esoni) codificante per la proteina canale CFTR che trasporta nella cellula Cl-. La proteina si attiva quando è fosforilata nel dominio R da PKA/C/G grazie al legame di ATP al dominio NBD1/2. Mutazioni in R alterano la regolazione chinasi-dipendente lasciando il canale aperto o chiuso. Tale patologia è caratterizzata da:
  • Malfunzionamento delle ghiandole sudoripare: eccesso di Cl nel sudore a causa del basso riassorbimento di NaCl da parte di CFTR.
  • Ostruzione dei dotti biliari e pancreatici con insufficienza pancreatica e malassorbimento intestinale: affinché gli enzimi digestivi possano scorrere nei canalicoli pancreatici è necessario il rilascio di H₂O dalle cellule, il suo trasporto dipende però dal quello dei sali: è necessario il trasporto di Cl- nel lume dei canalicoli creando un potenziale elettrico negativo che provochi il flusso passivo di Na nella stessa direzione, ciò aumenta la pressione osmotica del liquido extracellulare e permette l'uscita passiva dell'H₂O dalle cellule. Se però CFTR è mutato non permette l'uscita di Cl- dalle cellule causando l'ostruzione dei canalicoli, gli enzimi digestivi vengono quindi rilasciati in circolo.
  • Ostruzione bronchioli da muco denso, infezioni respiratorie, insufficienza respiratoria: la presenza di CFTR mutato sulla porzione apicale della membrana delle cellule epiteliali bronchiali causa una mancata estrusione di Cl-, aumenta quindi il flusso di Na nella cellula tramite i canali EnaC e quindi anche di H₂O tramite le acquaporine. Il muco presente sull'epitelio è quindi disidratato e meno fluido, ciò causa ostruzione bronchiale e facilita lo sviluppo d'infezioni che a loro volta inducono infiammazioni ricorrenti tendenti a cronicizzare.
  • Mancanza dei dotti deferenti nel maschio, tappi di muco uterini nella femmina: causa sterilità.
  • Difetti nella crescita.

Le mutazioni di CF si classificano in 6 classi:

1. Mutazioni non-senso, mutazioni frame-shift, ampie delezioni; formazione di una proteina tronca.
2. Alterazioni del traffico; le proteine misfolded sono degradate.
3. Alterazioni di gating; la proteina raggiunge la membrana apicale ma lo stato aperto del canale è breve.
4. Aumento della conduttività del Cl- a causa della struttura alterata del canale.
5. Alterazioni dello splicing (per mutazioni missenso); la quantità di proteina sulla membrana apicale è molto ridotta poiché si riduce la quantità di mRNA prodotto.
6. La proteina è funzionale ma molto instabile (dimezzamento dell'emivita in membrana).

La mutazione più frequente è Delta F508, una delezione di 3 nucleotidi che causa la perdita dell'amminoacido Fen codificato dal codone 508; si ha un errato folding della proteina che è individuato dalle proteine chaperone Hsp70 e Calnexina che ne impediscono il trasporto in membrana.

Funzioni alternative di CFTR

• Recettore batterico di P. aeruginosa
• Attivazione gap-junction.
• Attivazione di altri canali del Cl- (attivazione dei canali ORCC da parte dell'ATP che è riportata nella cellula tramite i P2R, uscita di Cl-) e K (ROMK), inibizione degli ENaC.
• Regolazione del traffico vescicolare.
• Regolazione del pH degli organuli.
• Trasporto ATP (all'esterno) e HCO₃.

La diagnosi può prevedere uno screening neonatale (rilevazione di un'alta concentrazione di Tripsinogeno nel sangue), il test del sudore (si dosa la concentrazione di Cl nel sudore inducendo la sudorazione con corrente elettrica a basso voltaggio e Pilocarpina, se la concentrazione è > 60 mEq/L ≥ 2 volte è positivo), la diagnosi molecolare. Quest'ultima consiste nell'individuare mutazioni note tramite ibridizzazione con sonde ASO (deposizione del prodotto di PCR campione su una membrana di nylon su cui sono fissati gli oligonucleotidi sonda).

La terapia differisce in base allo stadio di compromissione dell'apparato respiratorio:

• Mutazione genica → terapia genica
• CFTR alterato → i potenziatori aumentano il funzionamento della proteina in membrana, i correttori riparano i difetti conformazionali (chaperone farmacologici -Glicerolo, Taurina-, regolatori della proteostasi), i correttori di produzione legano un sito dell’rRNA ed inseriscono amminoacidi alternativi nel sito del codone mutato (antibiotici aminoglicosidi).
• Trasporto Na e Cl anomalo → si attivano altri canali del Cl- (TMEM16A e SLC26A9) o inibiscono i canali che riassorbono il Na (EnaC); Amiloride, ATP.
• Muco denso e liberazione di DNA dai leucociti → RhDNasi
• Ristagno di muco → fisioterapia respiratoria
• Infezione, infiammazione → antibiotici, corticosteroidi
• Danni al tessuto polmonare, insufficienza respiratoria → ossigenoterapia, trapianto.

Per gli altri organi: evitare di sudare troppo, pancreatina, dieta ricca di lipidi (pancreas), Gastrografin (intestino).

Sordità

Può essere causata da fattori genetici (40%) o ambientali. I DFN (DeaFNess) rappresentano i loci associati alle varie forme di sordità genetica; DFNA (forme ad eredità AD, 20% casi), DFNB (forme AR, 75%), DFN (forme ad eredità recessiva legata ad X, 5%).

Il labirinto è bagnato dall'endolinfa (alta concentrazione di K, bassa di Na), e dalla perilinfa (contrario). Le cellule ciliate sono disposte in 4 file lungo la Membrana Basilare, nell'interfaccia tra i due liquidi: il polo apicale nell'endolinfa, quello basale nella perilinfa. Le cilia delle cellule ciliate, in presenza della stimolazione sonora che muove l'endolinfa, si spostano e ciò determina l'apertura dei canali del K sensibili allo stiramento: entrata di K e Na e depolarizzazione della cellula → al polo basale apertura dei canali del Ca V-dipendenti → ingresso di Ca e rilascio di neurotrasmettitore che eccita le fibre sensitive afferenti che decorrono attraverso il nervo acustico al cervello. Terminata la stimolazione il K è rilasciato nello spazio extracellulare della perilinfa e infine recuperato nell’endolinfa.

La sordità si distingue in:

• Sordità ereditaria dominante: più soggetti sono colpiti per ogni generazione, è bilaterale e tende al peggioramento, può insorgere in età infantile o adulta. Una mutazione importante è quella legata al gene del canale ionico KCNQ4 del K, volt-dipendente ed espresso nelle cell ciliate.
• Sordità ereditaria recessiva: (sordità neurosensoriale grave) il soggetto ha genitori portatori sani, è bilaterale e non peggiora, già presente alla nascita. Le mutazioni più importanti sono:
  • Mutazione nel gene della Miosina 7: (braccio lungo del cromosoma 11, AR) è importante per la formazione dei fasci di stereociglia.
  • Mutazione gene GJB2 (gap junction protein β2): codifica per la Connexina 26 (in più del 50% delle sordità AR), la mutazione più frequente è 35delG (delezione della G in posizione 35 e formazione di un codone di stop). Questa proteina nelle gap junction è fondamentale per la trasmissione dell'impulso elettrico e il ricircolo di K endolinfatico.

Sindrome di Usher

Patologia AR caratterizzata da deficit uditivo alla nascita e perdita progressiva della vista (a causa di Retinite pigmentosa), si distingue in 3 tipi: I (ipoacusia profonda alla nascita, problemi di equilibrio), II (ipoacusia media), III (ipoacusia progressiva).

Trasporto di glucosio

I trasportatori del glucosio sono:

• SGLT1/2: nelle cellule intestinali e renali, cotrasportano rispettivamente Na, glucosio e galattosio per l'assorbimento di glucosio e Na e glucosio per il riassorbimento di glucosio. Difetti in SGLT1 causano la Sindrome da malassorbimento di glucosio e galattosio, caratterizzata da diarrea e disidratazione nel neonato; difetti in SGLT2 causano la Glicosuria renale familiare, caratterizzata da glicosuria in presenza di glicemia normale.
• GLUT1 (tutti i tessuti, assorbimento basale del glucosio), /2 (cellule β del pancreas, regola l'insulina), /3 (tutti i tessuti), /4 (intestino, sensibile all'insulina).

Trasporto di amminoacidi

Assorbimento di amminoacidi neutri (Ala, Ser, Thr, Val, Trp, Glu, Asp, His): eseguito dal trasportatore attivo secondario B⁰AT sulla membrana apicale e dal Sistema L (LAT2 e 4F2hc) sulla basale, cotrasportano entrambi il Na; entrambi sono presenti in intestino e reni.

Malattia di Hartnup

Patologia metabolica AR con sintomatologia simile alla Pellagra (dermatite da fotosensibilità, atassia, demenza) dovuta alla carenza di Niacina. Essa è dovuta a difetti in B⁰AT che causa bassa concentrazione plasmatica di amminoacidi, aminoaciduria, bassa concentrazione di triptofano che porta alla riduzione di Niacina (prodotta da esso); la Niacina (detta anche vitamina B3 o PP) è importante per una corretta attività del sistema nervoso, per la salute di pelle e lingua e per la formazione dei tessuti del tratto gastrointestinale, è il costituente fondamentale di NAD.

Assorbimento di amminoacidi cationici e Cistina

Il trasporto è eseguito da B⁺ (formato dalle subunità rBAT e B⁰AT) sulla membrana apicale, che intrude amminoacidi cationici e Cistina ed estrude amminoacidi neutri, e dal Sistema y⁺L (subunità y⁺LAT1 e 4F2hc) sulla basale, che estrude amminoacidi cationici e Cistina ed estrude amminoacidi neutri.