Patologia: Lezione 01

Lezione 1 - il DNA

Struttura del DNA

Il DNA è costituito da porzioni codificanti dette esoni e presenta, dopo la trascrizione, i cosiddetti introni che vengono rimossi prima che si abbia l’RNA messaggero maturo attraverso un fenomeno chiamato splicing. Il DNA presenta delle regioni al 5’ regioni regolatorie, dette enhancer, che servono a regolare l’espressione del gene. Poi abbiamo la regione promotore alla quale si legano i fattori di trascrizione per trascrivere l’RNA e la sequenza codificante, tradotta in proteina.

RNA maturo

L’RNA maturo presenta, dopo la rimozione degli introni, oltre alla sequenza codificante, degli elementi che stabilizzano la struttura dell’RNA: al 5’ un cappuccio e al 3’ una coda Poli A e delle sequenze che rappresentano le regioni non tradotte (untranslated region, UTR).

Traduzione in proteina

L’RNA messaggero viene tradotto in proteina secondo uno schema a triplette, per cui tre nucleotidi corrispondono ad un amminoacido.

Il genoma umano

Sequenziamento e conservazione

Il genoma umano oggi è stato completamente sequenziato. La sequenza del genoma si conosce completa dall’inizio degli anni 2000 (primi studi inizio anni '80) e quello che è venuto fuori è che è strettamente conservato tra ogni individuo. Anche individui di razze diverse condividono circa il 99,99% del DNA e la differenza tra individui è dello 0.1 %.

Organizzazione del genoma

Il genoma è organizzato in un genoma nucleare che presenta circa 3300 Mb organizzato nei cromosomi; in più vi è un DNA mitocondriale, nei mitocondri ed è molto più piccolo, 1600 Mb e molto conservato. Del DNA nucleare solo il 25% è ascrivibile a geni veri e propri e a sequenze relative a geni. Di questo 25% (DNA nucleare) solo il 10% è rappresentato da DNA codificante e tradotto in proteine; mentre il 90% è rappresentato da DNA che non codifica (introni, sequenze regolatorie enhancer, promotori).

DNA extragenico

Il 75% del DNA nucleare invece, è costituito da DNA extragenico che non codifica per proteine e ha una funzione ignota. È importante per la genotipizzazione, ovvero per distinguere un individuo da un altro perché le differenze all’interno di una popolazione e la costituzione di una mappa genica, è relativa al DNA extragenico. Questo è distinguibile in DNA a copia singola (circa il 60%) presente solo una volta all’interno del genoma; mentre il 40% è costituito da DNA ripetitivo cioè sequenze ripetute più volte all’interno del genoma e che cambiano la loro dimensione.

Geni umani

• Numero ~30.000 + 37 mitocondriali
• Densità 1 gene ogni 100 kb
• ~1400 geni/cromosoma
• ~60 geni/banda
• Dimensione in media 10-15 kb
• Esoni numero variabile da 1 a 363
• Dimensione media 122 bp
• RNA dimensione media 2.6 kb
• 5' UTR – Coding – 3' UTR: 0.2 kb 1.5-1.8 kb 0.77 kb

Distribuzione e particolarità

A livello cromosomico: la lunghezza media cromosoma umano: 140 Mb; la quantità di eterocromatina costitutiva (DNA non codificante che si trova nel centromero) va da 3 a 30 Mb. La distribuzione dei geni sui cromosomi non è uniforme: la densità genica è elevata nelle regioni sub-telomeriche, si trovano qui, quindi la maggior parte delle regioni codificanti.

Genoma mitocondriale

Il genoma mitocondriale è codificante al 93%; ha la peculiarità di non presentare introni e codifica per 37 geni. Questo viene ereditato per via materna perché gli spermatozoi forniscono alla cellula uovo solo il genoma nucleare, a differenza di quello mitocondriale che viene fornito dalla cellula uovo.

DNA extragenico ripetitivo

Il DNA extragenico ripetitivo viene classificato in base alle dimensioni delle sequenze ripetute che occupa sul cromosoma. I DNA satellite che occupano anche centinaia di migliaia di basi e si trovano a livello del centromero, sono regioni strutturali che non vengono trascritte. Il DNA minisatellite, sono più piccoli e localizzati nelle regioni telomeriche e variano da individuo a individuo e ci permettono di distinguere i vari genotipi. Sono state individuate regioni di DNA microsatellite: piccolissime regioni di DNA che si trovano disperse all’interno dei cromosomi.

Allele e polimorfismo

Definizione di allele

Allele: variante della sequenza di un gene. Per molti geni vi è la variante di un singolo allele nella popolazione ovvero, la sequenza di DNA è conservata per tutti e non cambia fra individuo e individuo. Ci sono poi dei casi in cui abbiamo la presenza di più alleli all’interno di una popolazione e quindi più varianti di una proteina con una percentuale elevata e si parla di alleli multipli in una popolazione.

Polimorfismo

Polimorfismo: la variante di un allele è presente nella popolazione con una frequenza maggiore dell’1%. Se invece la variante è presente all’interno della popolazione con una frequenza minore dell’1% si parla allora di varianti rare. Raramente queste variazione interessano geni veri e propri: la maggior parte delle variazioni sono presenti nel DNA extragenico. Ci possono però essere variazioni di frequenza nelle regioni regolatrici di un gene quindi ad esempio un individuo potrebbe esprimere una maggiore quantità di un determinato gene rispetto ad un altro individuo. Questo è importante per una diversa suscettibilità alle malattie.

Distinzione delle varianti

Importante è distinguere le varianti per locus (gene o allele) che causano variazioni del fenotipo, dalle varianti si sequenza del DNA che non hanno effetto sul fenotipo ma che hanno una differenza a livello fenotipico. Questo è un discorso utile perché ci permette di distinguere un individuo dall’altro. Questi polimorfismi sono stati utilizzati a partire dagli anni '70 per distinguere gli individui fra loro perché inizialmente non si conosceva la sequenza completa del DNA e si sfruttavano caratteristiche peculiari del DNA stesso.

Tipi di polimorfismi

• RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism (metà degli anni ’70)
• VNTR – Variable Number of Tandem Repeats (metà degli anni ’80)
• SNP – Single Nucleotide Polymorphism (fine anni ’90, quando si è iniziato ad avere la sequenza completa di DNA)

Questi polimorfismi vengono ereditati come caratteri mendeliani e utilizzati come marcatori genetici.

RFLP

Varianti di sequenza del DNA che alterano siti di taglio di enzimi di restrizione (=sono enzimi che tagliano il DNA in determinate sequenze). Un esempio di RFLP che è stato utilizzato per individuare l’anemia falciforme (causata da mutazione nella beta globina). In questo gene erano state individuate delle sequenze in cui un enzima di restrizione (MST2) riconosceva e tagliava queste sequenze di DNA (taglia tre volte e quindi due bande). Nel momento in cui si ha una mutazione in queste sequenze di DNA si è visto che l’enzima non riconosceva più il sito di taglio ed è possibile riconoscere la regione in base alla lunghezza del DNA. Il DNA viene fatto migrare in un campo elettrico e in base alla dimensione migra di più o di meno.

DNA minisatellite ipervariabile o VNTR

Tra individuo e individuo cambia la lunghezza delle sequenze ripetute e andando a studiare la lunghezza di determinate regioni ripetute, ad esempio la lunghezza di una regione di due nucleotidi ripetute in un individuo un certo numero di volte in un altro possono essere di più o di meno e questo ci permette di distinguere un individuo da un altro, andando semplicemente a vedere la lunghezza di questo DNA. Questo si può fare attraverso tecniche quali la PCR.

Importanza dei marcatori

I marcatori sono importanti perché vengono ereditati come caratteri mendeliani. Ad esempio due individui che hanno dei figli: in alto la madre presenta un gene mutato (T) e presenta un polimorfismo in un determinato minisatellite; mentre il padre, in basso, è un individuo sano. Vedendo l’albero genealogico gli individui indicati in nero sono gli individui affetti (i pallini=femmine; quadrati=maschi). Si vede, facendo ad esempio una pcr, come tutti gli individui affetti, anche nelle generazioni successive, presentino quel tipo di polimorfismo. In questo caso indicato M’, la seconda banda ->Tutti gli individui che presentano la patologia presentano anche il polimorfismo. Questo è utile per individuare i geni che causano la malattia (utile in passato quando ancora non si conosceva il gene per una determinata malattia e si vedeva che tutti gli individui che presentavano la malattia presentavano anche quel determinato polimorfismo).

DNA fingerprinting

Questi polimorfismi possono essere molto utili in quanto consentono di fare la cosiddetta impronta digitale di DNA di ognuno di noi: DNA fingerprinting. Considerando infatti tutti i polimorfismi che ognuno di noi ha nel proprio DNA, combinati insieme possono dar luogo alla impronta digitale del DNA (viene fuori una specie di codice a barre che distingue i diversi individui) e queste differenze vengono utilizzate nella medicina forense per l’identificazione di crimini o a fini diagnostici. Vengono usate, per delineare l’impronta digitale, delle sonde che marcano tanti polimorfismi contemporaneamente e ci permettono di ottenere un codice a barre di ognuno di noi (Un’unica sonda di DNA che contiene la sequenza centrale comune può ibridare simultaneamente con più loci contemporaneamente determinando un complesso schema di ibridazione, specifico per ciascun individuo).

SNP (polimorfismi da singolo nucleotide)

SNP (polimorfismi da singolo nucleotide) Variazioni anche di un singolo nucleotide all’interno della popolazioni. Possono essere sia mutazioni (che riguardano quindi DNA codificante e quindi i geni), una percentuale minore dell’1% è presente nelle regioni codificanti infatti la maggior parte delle variazioni sono presenti nel DNA non codificante e quindi conoscendo la variazione di un singolo nucleotide questo consente un’altissima resa di tipizzazione. Questi SNP sono presenti in numero elevatissimo all’interno del genoma. Per esempio, un polimorfismo della proteina p53 è stato visto che il 75% della popolazione presenta un determinato polimorfismo, mentre un 25% presenta una sequenza alternativa. Alcuni 75% presentano una guanina in una posizione del gene, mentre il 25% presenta una citosina. Questa può essere vista come una maggiore suscettibilità allo sviluppo di alcuni tipi di tumori. Il 25% di questi individui che sviluppano una citosina al posto della guanina non è detto che sviluppino il tumore, bensì hanno una maggiore suscettibilità a svilupparlo. Perché p53 è la proteina guardiano del genoma: preserva l’integrità del genoma e segnala eventuali danni al DNA e se questi danni non vengono segnalati correttamente il danno può propagarsi e quindi c’è un maggiore rischio di sviluppare neoplasie. I polimorfismi sono anche importanti perché ci permettono di distinguere la diversa suscettibilità ad agenti ambientali, farmaci in ognuno di noi.

Polimorfismi e farmaci

È stato visto che un polimorfismo del citocromo P450 (complesso di proteine importanti per la detossificazione di diverse sostan...