Patologia: Lezione 01

RFLP

Varianti di sequenza del DNA che alterano siti di taglio di enzimi di restrizione (=sono enzimi che

tagliano il dna in determinate sequenze). Un esempio di RFLP che è stato utilizzato per individuare

l’anemia falciforme (causata da mutazione nella beta globina). In questo gene erano state

individuate delle sequenze in cui un enzima di restrizione (MST2) riconosceva e tagliava queste

sequenza di dna(taglia tre volte e quindi due bande). Nel momento in cui si ha una mutazioni in

queste sequenze di dna si è visto che l’enzima non riconosceva più il sito di taglio ed è possibile

riconoscere la regione in base alla lunghezza del dna. Il dna viene fatto migrare in un campo

elettrico e in base alla dimensione migra di più o di meno.

Dna minisatellite ipervariabile o VNTR (Variable

Number of Tandem Repeat)

Tra individuo e individuo cambia la lunghezza delle

sequenze ripetute e andando a studiare la lunghezza

di determinate regioni ripetute,ad esempio la

lunghezza di una regione di due nucleotidi ripetute

in un individuo un certo numero di volte in un altro

possono essere di più o di meno e questo ci permette

di distinguere un individuo da un altro, andando

semplicemente a vedere la lunghezza di questo dna.

Questo si può fare attraverso tecniche quali la PCR.

I marcatori sono importanti perché vengono ereditati

come caratteri mendeliani. Ad esempio due individui

che hanno dei figli: in alto la madre presenta un gene

mutato (T) e presenta un polimorfismo in un

determinato minisatellite; mentre il padre, in basso, è

un individuo sano. Vedendo l’albero genealogico gli

individui indicati in nero sono gli individui affetti (i

pallini=femmine; quadrati=maschi). Si vede, facendo

ad esempio una pcr, come tutti gli individui affetti,

anche nelle generazone successive, presentino quel

tipo di polimorfismo. In questo caso indicato M’’ , la

seconda banda ->Tutti gli individui che presentano la

patologia presentano anche il polimorfismo. Questo

è utile per individuare i geni che causano la malattia

(utile in passato quando ancora non si conosceva il

gene per una determinata malattia e si vedeva che

tutti gli individui che presentavano la malattia

presentavano anche quel determinato polimorfismo).

Questi polimorfismi possono essere molto utili in quanto consentono di fare la cosiddetta impronta

digitale di dna di ognuno di noi: DNA fingerprinting. Considerando infatti tutti i polimorfismi che

ognuno di noi ha nel proprio dna, combinati insieme possono dar luogo alla impronta digitale del

dna(viene fuori una specie di codice a barre che distinque i diversi individui) e queste differenze

vengono utilizzate nella medicina forense per l’identificazione di crimini o a fini diagnostici.

Vengono usate , per delineare l’impronta digitale, delle sonde che marcano tanti polimorfismi

contemporaneamente e ci permettono di ottenere un codice a barre di ognuno di noi (Un’unica

sonda di DNA che contiene la sequenza centrale comune può ibridare simultaneamente con più

loci contemporaneamente determinando un complesso schema di ibridazione, specifico per

ciascun individuo).

SNP (polimorfismi da singolo nucleotide)

Variazioni anche di un singolo nucleotide all’interno della popolazioni. Possono essere sia

mutazioni (che riguardano quindi dna codificante e quindi i geni),una percentuale minore dell’1% è

presente nelle regioni codificanti infatti la maggior parte delle variazioni sono presenti nel dna non

codificante e quindi conoscendo la variazione di un singolo nucleotide questo consente

un’altissima resa di tipizzazione. Questi SNP sono presenti in numero elevatissimo all’interno del

genoma. Per esempio un polimorfismo della proteina p53 è stato visto che il 75% della

popolazione presenta un determinato polimorfismo, mentre un 25% presenta una sequenza

alternativa. Alcuni 75% presentano una guanina in una posizione del gene, mentre il 25% presenta

una citosina. Questa può essere vista come una maggiore suscettibilità allo sviluppo di alcuni tipi

di tumori. Il 25% di questi individui che sviluppano una citosina al posto della guanina non è detto

che sviluppino il tumore, bensì hanno una maggiore suscettibilità a svilupparlo. Perché p53 è la

proteina guardiano del genoma: preserva l’integrità del genoma e segnala eventuali danni al dna e

se questi danni non vengono segnalati correttamente il danno può propagarsi e quindi c’è un

maggiore rischio di sviluppare neoplasie. I polimorfismi sono anche importanti

perché ci permettono di distinguere la

diversa suscettibilità ad agenti

ambientali, farmaci in ognuno di noi.

È stato visto che un polimorfismo del citocromo P450 (complesso di proteine importanti per la

detossificazione di diverse sostanze chimiche e farmaci) in individui fumatori questo polimorfismo

in alcuni sia più protettivo, quindi alcuni fumatori possono fumare e non sviluppare nessun tipo di

patologia perché hanno un determinato polimorfismo del citocromo p450; mentre altri individui

possono sviluppare malattie cardio vascolari e altri ancora che hanno una suscettibilità diversa a

sostanza chimiche presenti nel fumo di sigaretta, questo polimorfismo aumenta la suscettibilità ad

avere tumori polmanari. Questi polimorfismi possono influenzare la suscettibilità ad determinati

agenti.

Identificazione di un gene-malattia

In passato spesso si conosceva il prodotto proteico anomalo di una

determinata malattia (ad es anemia falciforme) però non si conosceva la

sequenza del gene. Si procedeva a ritroso dalla sequenza proteica e si

cercava di individuare la possibile sequenza del dna e si procedeva a trovarla

all’interno del genoma : CLONAGGIO FUNZIONALE.

Nel CLONAGGIO POSIZIONALE invece non si conosceva quello che era il

prodotto proteico finale ma, effettuando studi di popolazione, si vedeva che

una determinata malattia era associata a determinati marcatori genetici e si cercava la posizione

del gene vicino a quella di questo marcatore di cui si conosceva la posizione.

In questo modo è stato localizzato nel 1985 il gene che codifica per il canale CFTR la cui

mutazione causa la fibrosi cistica. Il gene era stato localizzato sul cromosoma 7 perché veniva

sempre ereditato assieme al polimorfismo di un marcatore genetico di un enzima chiamato

parossonasi e andando ad analizzare e ad individuare la posizione del gene è stato possibile

mappare il gene in una regione precisa del dna (un mappaggio più fine, che localizzò il gene in un

intervallo di 500 kb tra due marcatori (cMet e D7S8). Il DNA di tutta la regione è stato clonato

usando le tecniche del chromosome walking che utilizza librerie di DNA genomico.

Quando si parla di malattie mendeliane ci riferiamo a malattie causate da variazioni in un singolo

gene (malattie ereditarie). Quando invece si parla di malattie complesse o multifattoriali sono

ascrivibili a mutazioni in più geni. I polimorfismi possono afferire una suscettibilità diversa anche a

malattie non genetiche, ad esempio il citocromo p450 ; oggi c’è tutta una branca chiamata

farmacogenetica che studia la correlazione tra determinati polimorfismi del dna e effetti di farmaci:

si sta cercando di dare il giusto farmaco in base al determinato polimorfismo di un individuo (studi

molto recenti).

Patologie genetiche Patologie genetiche causate da un

solo gene vengono dette malattie

mendeliane e il 90% di queste

sono patologie pediatriche, metre

meno del 10% sono malattie

dell’adolescenza o successive;

appena l’1% compaiono dopo il

periodo riproduttive. Nel grafico, a

sx ,si vedono le malattie

cromosomiche che se abbiamo

aberrazioni di interi cromosomi o

direttamente delezioni queste

possono essere fatali e si possono

avere prima della nascita ed

essere fatali. Infine, a dx nel grafico, abbiamo malattie dell’età adulta che sono molto complesse e

multifattoriali che derivano dall’ambiente e da fattori genetici.

La causa più comune di mutazione nel dna è l’errore durante la replicazione del dna. Il dna è

presente nella cellula e nel momento in cui queste si duplicano, duplicano anche il loro dna ed è

stato calcolato che in una persona adulta ci sono circa 10^14 cellule e avvengono 10^16-10^17

divisioni cellulari nell’arco di una vita(includendo embriogenesi e ricambio cellulare) in ogni

individuo. Considerando che il genoma umano è costituito da 3x10^9 paia di basi, ogni

replicazione del DNA richiede l’incorporazione di 6x10^9 nuove basi ed è stato calcolato che

nell’arco di una intera vita vengono aggiunte 6x10^25 nuove basi. Il problema è che la DNA

polimerasi (enzima che duplica il dna) commette degli errori:ogni circa miliardo di basi duplicate,

commette degli errori incorporando basi sbagliate e quindi paradossalmente, il fatto che il dna si

duplichi è fonte di mutazioni ed è stato calcolato che un individuo man mano che va avanti con l’

età accumula circa più di mille miliardi di mutazioni. Il dato può sembrare catastrofico, ma in realtà

la maggior parte delle mutazioni riguarda il dna non codificante, sono quindi “innocue”. Ad esempio

una mutazione che capita in una cellula dell’orecchio,in un gene importante per la mano, non ha

nessun effetto.

Mutazioni

Per mutazione si intende un cambiamento permanente del dna ereditabile (trasmesso alle

generazioni successive per via germinale). In base alle dimensioni delle mutazioni, noi

distinguiamo:

– Geniche o Puntiformi : riguardano parti di geni o un singolo nucleotide

– Cromosomiche: riguardano solo parti di cromosomi

– Genomiche : riguardano interi cromosomi

Tipi di mutazione che coinvolgono uno o pochi nucleotidi :

– Sostituzioni di basi: una base viene sostituita con un’altra (Transizioni & Trasversioni).

– Inserzioni: uno o più nucleotidi vengono inseriti per errore durante la trascrizione del dna

– Delezioni: quando uno o più nucleotidi vengono persi dal dna. Vi possono essere anche scambi

durante il crossing over tra diversi pezzi di dna.

Le cause possono essere:

– Spontanee:la semplice replicazione del dna è già indice di mutazione

– Indotte da mutageni: aumentano il tasso di mutazione

Vi è anche una nomenclatura delle mutazioni: a livello di DNA

· · · · · A T G · · ·

· · ·-2 -1 1 2 3 · · · N.B. : non c’è zero

g.=DNA genomico, c.=cDNA

Sostituzione: g.G1162>A (in posizione 1162 di un gene x è stata sostituite una guanina da una

adenina)

Delezione: c.1524-1527del (nucleotidi dal 1524 al 1527 sono andati per