Patologia forestale

CAMPIONAMENTO

Per usare delle determinate tecniche di laboratorio ed affinchè i risultati siano attendibili è necessario eseguire un

campionamento corretto. Il prelievo di campioni deve essere effettuato da persone competenti, in modo

tecnicamente corretto e statisticamente attendibile, in funzione del tipo di analisi da effettuare. Nell’analisi di

patogeni necrotici, il campionamento va effettuato nella parte marginale della necrosi dove il patogeno è in attivo

accrescimento mentre nella parte necrotica vi potrebbe essere dei possibili saprofiti.

Gli aspetti da considerare sono:

• L’EPOCA DEL PRELIEVO DEI CAMPIONI (molti virus sono rilevabili nei tessuti vegetali soltano in periodi

dell’anno ristretti, la densità di popolazione di alcuni funghi tellurici presenta marcate variazioni stagionali,

con picchi di concentrazione nei mesi primaverili od all’inizio dell’autunno).

• Il saggio dei campioni, a partire già dalla scelta del materiale da saggiare (alcuni patogeni possono essere

rilevati con sufficiente sensibilità soltanto in particolari tessuti vegetali).

• La modalità di conservazione del campione (importanti sono soprattutto la temperatura, l’umidità e la

durata di conservazione).

• La sensibilità della tecnica o dei reagenti disponibili.

• L’accuratezza dell’esecuzione dei saggi (per alcune tecniche diagniostiche, oltre che un’elevata

professionalità degli operatori, è richiesta anche l’osservanza di procedure diagnostiche “standardizzate”,

che riducano le variabili che intervengono nei saggi).

SCHEMI DI CAMPIONAMENTO

Devono rispondere a criteri di semplicità e rapidità. L’approccio più

frequentemente utilizzato è quello sistematico randomizzato. Gli schemi

possono essere ad X, W, Z.

MICROSCOPIA OTTICA

Viene usato soprattutto per le malattie fungine mediante preparazione dei vetrini da sottoporre ad osservazione.

Consente di osservare la forma e la dimensione dei propaguli, la struttura dei corpi fruttiferi, aspetto e localizzazione

del micelio ed alterazione dei tessuti.

MICROSCOPIA ELETTRONICA

Il microscopio elettronico, è un tipo di microscopio che non sfrutta la luce come sorgente di radiazioni ma bensì un

fascio di elettroni. Consente di avere una risoluzione particolarmente elevata delle strutture, usato principalmente

per virus e batteri.

ISOLAMENTO SU TERRENI ARTIFICIALI

Tecnica utilizzabile per i parassiti facoltativi, cioè per tutti quei patogeni in grado di svilupparsi su un substrato

artificiale (possono vivere solo su cellule vive). Devono avere determinate caratteristiche quali concentrazione di

sostanze nutritive adeguata alle esigenze della specie microbica, adeguato grado di umidità e pH, devono infine

essere sterili e protetti dalla contaminazione. In base allo stato fisico si distinguono:

- TERRENI LIQUIDI: sono una semplice soluzione in acqua dei componenti nutritivi essenziali allo sviluppo

microbico e vengono chiamati anche brodi.

- TERRENI SOLIDI O AGARIZZATI: ai terreni liquidi viene aggiunto l’agar, un polisaccaride usato come

gelificante naturale e ricavato da alghe appartenenti a diversi generi. Dal punto di vista chimico, è un

polimero costituito principalmente da unità di D-galattosio (è quindi detto poligalattoside).

TIPOLOGIE DI SUBSTRATI ARTIFICIALI

- TERRENI GENERICI: servono alla coltivazione di un ampio spettro di microrganismi sia fungini sia batterici

senza particolari esigenze nutritive.

- TERRENI DIFFERENZIALI: in questi terreni la presenza di particolari indicatori consente di riconoscere le

singole specie batteriche dalle caratteristiche macroscopiche delle colonie.

- TERRENI SELETTIVI: favoriscono la crescita di alcune specie ed inibiscono quella di altre.

Si ottengono mediante l’aggiunta ai terreni nutritivi di sostanze inibenti quali antibiotici, coloranti e Sali.

Sono impiegati per isolare le singole specie da materiali plurimicrobici (es. V8).

PREPARAZIONE DI SUBSTRATI ARTIFICIALI

Si compie una pesata del substrato in polvere, dissoluzione in acqua distillata e controllo del pH.

Dopo di che si sterilizza in autoclave per garantire che il terreno sia privo di qualsiasi forma di vita, il trattamento si

esegue a 121°C per 15-20 minuti. Si versa poi il substrato in piastre Petri in condizioni di sterilità.

Si aspetta che la temperatura del substrato raggiunga i 50°C, si distribuisce poi il substrato ancora fluido in piastre

petri (90 mm) sotto cappa a flusso laminare che garantisce la sterilità.

IMPIEGO DI PIANTE INDICATRICI

Si tratta di quelle specie o cultivar che rispondono con sintomi caratteristici all’azione patogena determinata da un

virus o da un microrganismo o da una sostanza fitotossica. Si usano soprattutto per i patogeni biotrofi come i virus,

inoculati attraverso lesioni o microlesioni (polvere di cerite) oppure mediante vettori. Nel caso dei virus si può fare

una trasmissione meccanica su ospiti erbacei o mediante innesto

DIAGNOSI SIEROLOGICA

È basata sull’utilizzo di anticorpi-sonda in grado di identificare specificatamente, mediante un apposito test,

un antigene bersaglio (agente patogeno da identificare come virus ma anche per funghi e batteri).

Gli anticorpi sono delle proteine animali la cui formazione viene provocata in un organismo, come reazione di difesa,

in seguito all’invasione da parte di sostanze ad esso estranee che vengono definite antigeni per le caratteristiche

fisico-chimiche tali da stimolare la formazione di anticorpi.

Gli anticorpi sono definiti anche gamma globuline o immunoglobuline,

costituiscono una delle frazioni delle proteine del siero (parte liquida

del sangue) che comprende anche albumine, alfa e beta globuline.

Le immunoglobuline sono a loro volta suddivise in diverse classi:

IgA, IgD, IgM e IgG.

Le IgM predominano nella rispsota anticorpale all’immunizzazione

primaria mentre le IgG predominano nella reazione alle iniezioni di

richiamo. Le immunoglobuline sono prodotte dai linfociti B, hanno una

forma a Y composte da 3 segmenti di uguali dimensioni, tenute insieme

da una catena polipeptidica flessibile.

Sono presenti quattro catene polipeptidiche: due catene leggere, due

catene pesanti tenute insieme da ponti disolfuro.

Per quanto riguarda invece la struttura antigenica dei virus, la proteina virale, o capside, è costituita a sua volta da

subunità strutturali polipeptidiche. Per uno stesso antigene virale esistono solitamente diversi determinanti

antigenici (epitopi). Gli epitopi possono essere di superficie ed indipendenti dalle condizioni di assemblaggio

(metapodi) oppure interni, accessibili solo in condizioni di disassemblaggio (criptotopi).

ANTICORPI POLICLONALI: immunoglobuline eterogenee che si legano sulla superificie dell’antigene a diversi epitopi

(più siti antigenici). Sono prodotti in quantità limitata, eterogenei e dalla bassa specificità.

ANTICORPI MONOCLONALI: anticorpi omogenei uniformi che si legano ad un solo determinante antigenico o

epitopo. Sono tutti quanti identici e prodotti dalla fusione dei linfociti e delle cellule tumorali che formano così gli

ibridomi, la cellula avrà la capacità di produre anticorpi ma in modo indefinito.

SAGGI SIEROLOGICI

1- Precipitazione in tubo

2- Microprecipitazione in goccia

3- Doppia diffusione in gel di agar

4- Test ELISA (Elaisa) – più importante, si svolge in laboratorio

TEST ELISA

Il test si esegue in una piastra formata da 96 pozzetti in ciascuno dei quali si

fa una reazione sierologica, in cui l’anticorpo specifico reagisce col virus

prima intrappolandolo e poi rivelandone la presenza facendo reagire il virus

con anticorpi già coniugati ad un enzima (per esempio fosfatasi alcalina) ed

aggiungendo un adatto substrato (per esempio para-nitro-fenil-fosfato) che,

in presenza dell’enzima coniugato, sviluppa una reazione colorimetrica.

Sensibilità di rivelazione dell’antigene: 1 ng/ml.

FASI DEL SAGGIO ELISA

1- SENSIBILIZZAZIONE DELLA PIASTRA

Il pozzetto viene riempito con l’antisiero ed alcuni anticorpi (igG), i quali aderiscono alle

pareti del substrato, una volta riempiti i pozzetti si lascia in incubazione a 37°C

(temperatura ottimale) per 2 ore, permette così l’adsorbimento degli anticorpi alle pareti

del pozzetto. Successivamente si capolge la piastra eliminando dai pozzetti la soluzione e si

effettuano 3 lavaggi di 3 minuti con buffer di lavaggio.

2- AGGIUNTA DEL CAMPIONE

I pozzetti vegono riempiti con il campione, ovvero il succo estrato dal campione infetto

per triturazione. L’anticorpo riconosce l’antigene in particolari siti antigenici creando un

complesso (legame) tra l’anticorpo legato al pozzetto e l’antigene.

Si lascia poi in incubazione per 16 ore a 4°C (consente che il riconoscimento sia lento e

duraturo nel tempo permettendo la formazione di un legame stabile).

Poi si svuota nuovamente la piastra e ciò che non è stato riconosciuto viene eliminato,

si effettuano quindi 3 lavaggi di 3 minuti mediante buffer.

3- AGGIUNTA DEL CONIUGATO

I pozzetti vengono riempiti con una preparazione di IgG coniugata (anticorpo iniziale)

ad un enzima. L’anticorpo andrà a legarsi al virus creando un ulteriore complesso.

Questa fase si effettua ad una temperatura di 37 °C per 2 ore, dopo di che si esegue un

lavaggio.

4- AGGIUNTA DEL SUBSTRATO

Si aggiunge ai pozzetti una soluzione di substrato specifico per l’enzima (degradabile),

si sviluppa così una reazione colorimetrica in quanto l’enzima digerisce il substrato

producendo un colore giallo. Nei pozzetti con viraggio si avrà così l’indicazione che è

contenuto effettivamente il virus al suo interno mentre, nei pozzetti senza colorazione

è rimasto solamente il primo anticorpo. Si può impiegare anche un lettore di piastre ELISA

DIAGNOSI SIEROLOGICA MEDIANTE LATERAL FLOW

Permette di eseguire un’ analisi immediata, anche in campo, ma i cui risultati devono essere accertati

poiché non del tutto affidabili. Si basa su un dispositivo di test LF costituito da una membrana

cromatografica inserita tra due supporti in plastica. Sulla faccia superiore si aprono un pozzetto per il

caricamento dell’estratto vegetale da analizzare ed una finestra per la lettura del risultato,

contrassegnata dalla lettere T (test) e C (controllo). Nel sito S si mette il succo vegetale mentre la

barriera T e C sono due barriere per anticorpi, la T è specifica per il virus (antigene), mentre la C è

formata da anticorpi anti-anticorpi (riconoscono gli anticorpi per il virus).

Se il campione è negativo il risultato visivo sul test è solamente la banda in corrispondenza di C (test

andato a buon fine ma il campione risulta essere sano). Non avendo trovato il virus gli anticorpi per