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Modelli Sperimentali

Appunti integrati con articoli "JoVE | Peer Reviewed Scientific Video Journal - Methods and Protocols" dei principali modelli sperimentali.
Programma:
I. Introduzione ai modelli animali. Premesse e puntualizzazioni: la teoria dell’evoluzione, classificazione e filogenesi, il metodo scientifico. La scelta del modello e il protocollo di ricerca. Strategie per l'ideazione, stesura e valutazione... Vedi di più

Esame di Modelli sperimentali docente Prof. P. Palanza

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ESTRATTO DOCUMENTO

Il piccione come modello per l’apprendimento ....................................................................................................... 47

Il pappagallo ALEX ................................................................................................................................................... 47

MODELLI ANIMALI DA LABORATORIO ........................................................................................................................... 47

Il ratto, Rattus norvegicus ....................................................................................................................................... 47

Il topo, Mus musculus ............................................................................................................................................. 47

I grandi roditori ....................................................................................................................................................... 48

I carnivori ................................................................................................................................................................ 48

I primati ................................................................................................................................................................... 49

“ANIMALE CARE” – La scienza dell’animale da laboratorio .......................................................................................... 49

Fattori che influenzano la ricerca animale .............................................................................................................. 50

Responsabilità del team di ricerca .......................................................................................................................... 53

Gestione dell’animale da laboratorio (schema) ...................................................................................................... 53

Origine degli animali utilizzati nelle sperimentazioni ............................................................................................. 53

Background genetico .............................................................................................................................................. 54

 MODELLO ANIMALE: il topo, MUS MUSCULUS ..................................................................................................... 57

Sviluppo del topo ..................................................................................................................................................... 59

Il topo: un eccellente modello di sviluppo e patologia ............................................................................................ 63

Il genoma murino e modelli animali geneticamente modificati ............................................................................. 64

INTRODUZIONE AI MODELLI ANIMALI

Un MODELLO è un oggetto di imitazione, ossia qualcosa che somiglia in modo accurato a qualcos’altro.

Per ANIMALE si intende etimologicamente un organismo vivente animato. Biologicamente sono metazoi eucarioti

pluricellulari che si nutrono per ingestione. Si differenziano dagli altri metazoi per il modo di nutrimento (le piante si

nutrono per fotosintesi; funghi si nutrono per filtrazione).

Secondo la definizione dell’“American National Research Council Committee on Animal Models for Research and

Aging” un MODELLO ANIMALE è:

un animale in una condizione che permette di studiare i processi biologici e i comportamenti di base, o in cui può

essere studiato un processo patologico spontaneo o indotto, e nel quale il fenomeno assomiglia, almeno sotto un

certo punto di vista, allo stesso fenomeno nell’uomo o in altre specie animali”.

Vi è una stretta relazione tra i modelli animali (scienza di base) e la RICERCA CLINICA, lo SVILUPPO di TERAPIE e SERVIZI

SANITARI.

La scienza di base sviluppa modelli animali per nuove terapie e la comprensione di meccanismi alla base della fisiologia,

della patologia e del comportamento.

Perché usare gli animali nella ricerca? Animal Research.info

Gli animali sono impiegati nella ricerca quando vi sia una necessità di scoprire cosa accade nell'essere vivente nel suo

insieme, che è di gran lunga più complesso della somma delle sue parti. È difficile, e nella maggior parte dei casi

semplicemente non ancora possibile, sostituire nella ricerca l'uso di animali vivi con metodi alternativi.

Sono quattro le principali ragioni per cui gli animali sono utilizzati nella ricerca:

 Far crescere la comprensione scientifica

Accrescere la conoscenza scientifica attraverso la ricerca biologica di base ci aiuta a capire come funzionano gli esseri viventi

e a mettere a frutto quella comprensione a beneficio degli esseri umani e degli animali. Lo studio degli animali rappresenta

una parte importante di questo processo di ricerca. Molti processi cellulari di base sono uguali in tutti gli animali, e l'organismo

degli animali è come quello degli esseri umani nel senso che loro espletano molte funzioni vitali come respirazione, digestione,

movimenti, vista, udito e riproduzione. Per poter curare le malattie, medici e scienziati devono capire come funziona un

organismo sano. Questo, a sua volta, porta ad una comprensione di ciò che succede all'organismo quando si ammala e come

lo si può guarire.

Una buona parte della conoscenza dell'anatomia umana e delle funzioni dell'organismo deriva dai risultati scientifici della

ricerca sugli animali. Mettere a confronto specie differenti e studiarne differenze e similarità, è un modo per acquisire una

comprensione profonda. Perfino gli animali semplici possono essere utilizzati per studiare sistemi biologici complessi, come il

sistema nervoso e il sistema immunitario, che seguono la stessa organizzazione e le stesse funzioni di base in tutti gli animali.

Per esempio, si è imparato molto sulla funzione dei neuroni dallo studio dell'assone del calamaro gigante. Le informazioni

derivanti da questo tipo di lavoro possono essere applicate sia agli animali superiori che agli esseri umani.

 Gli animali come modelli per lo studio delle malattie

Gli esseri umani e gli animali hanno in comune centinaia di malattie, di conseguenza gli animali possono fungere da modelli

per lo studio delle malattie umane. Per esempio, i conigli soffrono di arteriosclerosi (indurimento delle arterie), di enfisema e

difetti della nascita, come spina bifida. I cani si ammalano di cancro, soffrono di diabete, cataratte, ulcere e disturbi della

coagulazione, come l'emofilia; ciò fa di essi i candidati naturali per la ricerca su detti disturbi. I gatti soffrono di alcune delle

stesse insufficienze visive degli esseri umani.

Dai suddetti modelli si apprende come la malattia incide sull'organismo, come risponde il sistema immunitario, chi ne sarà

colpito e anche altro. I modelli animali, oltre a favorire la comprensione delle malattie, permettono ai ricercatori di esplorare

le potenziali terapie in un modo che sarebbe impossibile praticare nell'uomo. Lo studio dei meccanismi delle malattie nei

modelli animali porta direttamente allo sviluppo di tecnologie nuove e farmaci a benefico sia degli esseri umani che degli

animali.

Gli animali nei quali siano state indotte alterazioni per generare modelli animali di malattie umane sono definiti modelli

indotti. Per esempio, se chirurgicamente si danneggia una determinata sezione del midollo spinale nei topi, questo genera

dei sintomi uguali a quelli osservati in pazienti con simili danni al midollo spinale.

Questi modelli animali aiutano i ricercatori a comprendere ciò che avviene nell'organismo a seguito di questo tipo di danno,

infatti sono utilizzati per lo sviluppo di nuovi farmaci.

I recenti progressi nella tecnologia genetica hanno consentito lo sviluppo di animali transgenici, i quali con l'inserimento di

nuovi geni nel loro DNA, hanno potuto sviluppare delle malattie umane che generalmente non colpiscono gli animali in modo

naturale. In particolare, ciò ha consentito ai topi di modellare molte malattie umane che fino ad allora era stato difficile

2

studiare. Un esempio è lo studio dell’Alzheimer familiare in cui la proteina amiloide si deposita a livello neuronale: trasferendo

i geni malati umani nel topo è possibile ottenere un quadro clinico uguale all’uomo in cui nel cervello murino si accumuleranno

le stesse proteine.

 Sviluppare e sperimentare potenziali forme di trattamento

Una volta che i ricercatori approfondiscono la conoscenza di una determinata malattia, gli animali sono utilizzati per sviluppare

e compiere esperimenti per potenziali farmaci come parte integrante del processo di ricerca applicata. Per esempio, i farmaci

per il morbo di Parkinson sono stati sviluppati grazie all'utilizzo di modelli animali nei quali sono stati indotti sintomi simili a

quelli del Parkinson. Questi modelli costituiscono una parte essenziale dell'applicazione della ricerca biologica ai problemi

medici reali e consentono nuovi obiettivi finalizzati all'individuazione di modalità di intervento sulle malattie.

Acquisire dati attraverso gli studi sugli animali è necessario prima che nuove tecniche terapeutiche e procedure chirurgiche

possano essere testate sull'uomo. Gli strumenti di diagnostica come scanner, impianti di pacemaker cardiaci o di anca

artificiale, sono sicuri ed efficaci solo perché sono stati sviluppati e testati sugli animali. Molte tecniche chirurgiche come

interventi chirurgici a cuore aperto e trapianti cardiaci, si avvalgono di metodi e strumentazione sviluppati utilizzando gli

animali.

 Proteggere la salute pubblica, quella degli animali e dell'ambiente

Per i farmaci nuovi sono necessari gli esperimenti, in quanto i ricercatori devono quantificare tanto gli effetti benefici quanto

quelli dannosi, che un composto può avere sull'organismo nel suo complesso. Un farmaco inizialmente viene testato in vitro

con l'utilizzo di tessuti e organi isolati, ma per ciò che concerne la parte legale ed etica deve essere testato anche su un

modello animale idoneo prima che possano essere avviati gli studi clinici sull'uomo.

I test sugli animali forniscono dati su efficacia e sicurezza. Oltre ad individuare potenziali problemi di sicurezza, stabiliscono

anche le dosi da somministrare a volontari e pazienti durante gli studi sull'uomo. I test sugli animali, inoltre, sono utili per

proteggere consumatori, lavoratori e ambiente dagli effetti dannosi delle sostanze chimiche. Tutte le sostanze chimiche per

uso commerciale o personale devono essere testate, onde conoscere il loro effetto sull'uomo e sugli animali esposti ad esse.

Le sostanze chimiche che utilizziamo ogni giorno possono accumularsi nell'acqua, sul suolo o nell'aria circostante, perciò

occorre studiare approfonditamente il loro potenziale impatto sull'ambiente.

La TEORIA DELL’EVOLUZIONE –progenitore comune a tutti i viventi, filogenesi dell’uomo da altri animali –fornisce la

base razionale per l’uso di animali come modello per l’uomo

Infatti, la DISCENDENZA COMUNE (presenza di un ANTENATO COMUNE) spiega perché la ricerca biomedica negli

animali è applicabile nell’uomo. Infatti le funzioni di base delle cellule e degli organi sono le stesse negli animali e

nell’uomo perché filogeneticamente collegati.

 Non è possibile distinguere una cellula umana da una cellula animale al microscopio se non contando il numero di cromosomi

o utilizzando opportuni markers.

 La relazione tra i neuroni è stata scoperta nell’Aplysia, un modello animale che presenta un numero ridotto di neuroni: ciò

non sarebbe stato possibile nell’uomo data l’enorme complessità, mentre l’organismo semplice ha permesso di capirne il

funzionamento (i neuroni funzionano tutti allo stesso modo).

 La glicolisi è uguale in tutti gli organismi.

 A livello fisiologico ed anatomico, gli animali e gli uomini sono tanto più simili quanto più sono filogeneticamente (ed

evolutivamente) vicini.

 Mutazione del gene kit: riguarda un gruppo di cellule che migra dalla cresta neurale e va a formare alcune zone di epidermide.

La manifestazione fenotipica, con macchie non pigmentate di forma caratteristica su addome e fronte, è la stessa nell’ uomo

e nel topo (gene conservato).

Questo è un esempio che giustifica il fatto di poter modificare un gene che è alla base di una disfunzionalità patologica in topo

e utilizzare i risultati per comprendere la malattia nell’ uomo.

 I processi nelle prime fasi di sviluppo embrionale sono gli stessi, soprattutto nei mammiferi e in generale nei vertebrati. Infatti

l’embrione umano, in un momento molto precoce, è difficilmente distinguibile da embrioni di altre specie.

 L’utilizzo degli animali nella ricerca permette lo studio di più generazioni, dato il loro breve ciclo vitale. Inoltre, è

possibile controllare l’ambiente in cui vivono per ridurre al minimo le variabili sperimentali:

un buon esperimento dipende da quanto si riesce a controllare le variabili (sia esterne che interne, come la genetica) che

interferiscono con la variabile principale che lo sperimentatore sta valutando.

 La ricerca animale non può essere sostituita da modelli computazionali, studi “in vitro” o colture cellulari, perché

questi ultimi non possono duplicare le interazioni complesse. Tuttavia, la ricerca deve essere supportata e

integrata con modelli computazionali in modo tale da ridurre il numero di sperimentazioni sugli animali.

I RISULTATI ottenuti dagli studi sugli animali sono applicabili all’uomo. 3

In pratica tutti i farmaci, le attrezzature e le procedure mediche sono state sviluppate tramite ricerca sugli animali.

Il cane Kodi ha subito due operazioni di sostituzione dell’anca. Le tecniche chirurgiche utilizzate erano state testate su

animali di laboratorio e sono ora utilizzate sia negli animali che nell’uomo.

Alcune pietre miliari della ricerca biomedica ottenute utilizzando animali

- Koch e il Bacillus antracis (1877) infettivologia

- Jenner e il virus del vaiolo (1798) nasce il concetto di vaccino

- Pasteur e la rabbia (1885) nascita della profilassi

- Kohler e Milstein (1976) sviluppo degli anticorpi monoclonali

- Snell (1980) MHC e antigene H

Dal 1901 ad oggi 83 dei 109 Premi Nobel per la medicina hanno svolto ricerche utilizzando direttamente modelli

animali.

 Comprensione della suscettibilità e resistenza agli agenti microbici con sviluppo di sostanza antimicrobiche

 Diagnosi di malattie infettive (rabbia, febbre gialla)

 Conoscenza del funzionamento del sistema immunitario (istocompatibilità, immunodeficienza)

 Trapianti

 Sviluppo di vaccini (polio, vaiolo)

 Sviluppo di tecniche chirurgiche cardiache e cardiovascolari

 Sviluppo terapie anticancro

 Identificazioni dei disordini dismetabolici (diabete, insufficienza renale)

 Caratterizzazione dei disordini neurologici

 Meccanismi della memoria

I primi studi in ambito medico riguardavano le malattie infettive.

 Nel 1880, all’istituto di igiene di Berlino, Behring inietta siero sanguigno di una Cavia (Guinea Pig) infettato da

germi della difterite (o dal tetano) in un altro animale, rendendolo temporaneamente immune alla malattia: viene

quindi compreso che nel sangue esiste qualcosa che combatte l’infezione. Nel 1891, all’ospedale di Berlino, il

primo bambino viene salvato dal siero antidifterico di Behring (sieroterapia).

Dal 1979 ad oggi tutti i premi Nobel per la medicina coinvolgono ricerche su modelli animali, ad eccezione di Ohsumi,

Edwards nel 2010 (fecondazione in vitro), Barbara McClintock nel 1983 (genetica delle piante: scoperta dei trasposoni).

Nel 2016, Ohsumi ha vinto il Nobel per la scoperta dei meccanismi di autofagia, utilizzando come modello il lievito.

Studiando dei mutanti ha identificato 15 geni essenziali per questo processo.

Alcuni esempi di questi premi sono:

 

2015 nuova terapia (avermectina) contro le parassitosi. Youyou Tu ha scoperto una terapia contro la malaria:

ha cercato tutte le erbe utilizzate nella medicina tradizionale cinese per curare la malaria e analizzandole in

laboratorio ha isolato l’artemisinina.

 

2014 scoperto un insieme di cellule nell’ippocampo che registrano i movimenti del corpo nello spazio. Ad

esempio, se si fa percorrere un labirinto ad un ratto e poi si lava il piano per eliminare le tracce olfattive, l’animale

è comunque in grado di tornare indietro compiendo gli stessi movimenti (vengono registrati dal circuito neuronale

ippocampale). Nei primati questo sistema è sviluppato in modo diverso, più visivo.

 

2013 scoperta del meccanismo che regola il traffico di vescicole nelle cellule, cioè la via di secrezione operata

dall’apparato di Golgi (studiata in cellule di mammiferi, lievito e topo).

 

2011 scoperta della continuità dei meccanismi che attivano l’immunità innata (dalla Drosophila, al topo,

all’uomo), quali il gene Toll e i Toll-like receptors (legano antigeni attivando la risposta immunitaria che porta

all’infiammazione e all’eliminazione del microorganismo invasore). Inoltre, scoperta delle cellule dendritiche e del

loro ruolo nell’immunità adattativa (attivano i linfociti T che danno il via alla risposta immunitaria adattativa,

producendo una cascata di reazioni che formano gli Ab e le cellule killer).

 

2009 scoperta dei telomeri e della telomerasi (invecchiamento), in protozoi, topo, rana. 4

 

2008 scoperta dell’HPV che causa il cancro alla cervice uterina e dell’HIV. Sono stati utilizzati criceti, topi mucche

per il primo e topo, scimmie e scimpanzé per il secondo. Gli scimpanzé sono gli animali sperimentali principali per

l’AIDS, in quanto il topo è resistente.

 

2007 utilizzo delle cellule staminali embrionali di topo per introdurre modificazioni in specifici geni: creazione

di topi transgenici o knockout. Inoltre, conservatività dei geni Hox nello sviluppo della ghiandola mammaria in

risposta alla gravidanza (se mutati in cellule adulte si ottengono tumori). (Capecchi)

 

2006 scoperta degli interfering RNA in C. elegans (RNA a doppio filamento).

 2004 scoperta di una famiglia multigenica (circa 1000 geni famiglia poliallelica) che codifica per recettori

olfattivi, altamente conservata durante l’evoluzione. Studiati su Aplysia, Drosophila, topi.

 

2001 scoperta del sistema di regolazione cdk/ciclina che regola gli step del ciclo cellulare, nel riccio di mare,

rana, xenopus, vongola.

 

2000 studi sulla trasduzione del segnale nel sistema nervoso, dovuta al legame con dopamina e serotonina, su

Aplysia e topo. Inoltre, trasmissione sinaptica lenta tra i neuroni, cioè la base neurale di apprendimento e memoria

in lumaca di mare e Aplysia.

 

1973 scoperte riguardanti l’organizzazione di schemi di comportamento individuali e sociali (etologia). Le api

hanno la forma di linguaggio più complessa dopo l’uomo, perché sanno comunicare in modo astratto. Inoltre, sono

stati fatti studi sull’istinto e sull’imprinting, da cui deriva la teoria dell’attaccamento (sviluppo psicologico del

neonato) e studi sul rapporto tra moduli fissi in azione e stimoli segnale, studiando le oche, spinarelli e uccelli.

Tinbergen evidenziò come la ricerca comportamentale abbia senso nell’ambito dello stress, dell’autismo e delle

malattie umane.

 

1986 Rita Levi-Montalcini e Stanley Cohen per la scoperta dell’NGF (Nerve Growth Factor) in topo, pulcino e

serpente.

 

1975 interazione tra virus che causano tumore e il materiale genetico della cellula, in scimmie, cavallo, gallina

e topo. (Dulbecco)

 

1957 scoperta di composti sintetici che hanno un’azione sul sistema vascolare e muscolo scheletrico, in cane e

coniglio.

Altri studi che vantano un premio Nobel riguardano:

- L’ossido nitrico e la protezione del sistema vascolare nel coniglio.

- La scoperta dei Prioni come cause di alcune malattie neurovegetative in pecore, capre e mucche.

- Interazioni tra virus e sistema immunitario in topi.

Effetti pratici della ricerca animale

 Penicillina: la scoperta più importante della medicina è la penicillina da parte di Fleming. Nel 1939 è stato fatto il

primo test terapeutico sul modello animale: veniva iniettato lo pneumococco nei topi e si vedeva che quelli trattati

successivamente con penicillina sopravvivevano. Il trial clinico furono i feriti della seconda guerra mondiale: la

morte per polmonite è scesa all’1% rispetto al 18% della I guerra mondiale.

 Poliomielite: la poliomielite è una malattia che causa paralisi e morte, soprattutto nei bambini. Due ricercatori

provarono che era una malattia infettiva in grado di trasmettersi alle scimmie e successivamente, altri

svilupparono il vaccino tramite esperimenti su scimmie e pulcini.

 Insulina: nel 1921 Banting e Best estraggono l’insulina dai cani e provano che contrasta i sintomi del diabete in

cani a cui era stato asportato il pancreas.

 Mortalità infantile: studi su pecore hanno dimostrato l’efficacia degli steroidi per trattare la sindrome da distress

respiratorio negli infanti prematuri, mentre studi su ratti, topi, cani e pecore hanno permesso la comprensione e

il trattamento della sindrome da morte improvvisa infantile (SIDS).

 Fibrosi cistica: malattia genetica che causa la morte di giovani adulti. Modelli murini hanno permesso di

comprendere i processi biochimici coinvolti e vengono anche utilizzati per testare la terapia genica.

 Ipertensione: grazie a studi su ratti, gatti e cani è stato possibile correlare questa patologia al funzionamento

renale e sviluppare trattamenti. Lo studio sui cani, invece, ha permesso di comprendere l’influenza del sistema

nervoso centrale sulla pressione sanguigna e lo sviluppo di farmaci adeguati (cervello – ipofisi – tiroide –

regolazione della pressione). 5

 Obesità: è un fattore di rischio per l’insorgenza di diabete mellito, ipertensione, ictus, infarto e alcuni tipi di cancro.

Negli stati uniti è epidemica: il 64% degli adulti sono sovrappeso e 25% sono obesi. L’utilizzo di modelli murini

(topo ob/ob a cui manca il recettore della leptina) e di ratti di Zucker obesi aiuta a fare luce sulle cause

dell’eccessiva alimentazione, l’importanza dei recettori leptinici e sui modi in cui l’obesità porta allo sviluppo delle

malattie.

 AIDS: i trattamenti anti-AIDS hanno notevolmente aumentato l’aspettativa di vita e la qualità della vita dei pazienti.

Sono in corso studi sulle scimmie per produrre i vaccini.

 Cecità: studi sui cani hanno permesso di sviluppare una potenziale cura che in futuro potrebbe restituire la vista a

persone e cani affetti da amaurosi congenita di Leber (distrofia della retina).

 Dipendenza da droghe: gli studi su animali hanno permesso di comprendere come l’utilizzo continuo di droghe

cambia il cervello, consentendo così lo sviluppo di cure.

 Malattie da prioni: (es mucca pazza) non c’è una cura ma gli studi permettono di comprendere meglio le patologie

portando comunque a dei benefici sia per gli umani che per gli animali.

 Ictus: uccide oltre 150.000 persone all’anno negli stati uniti e causa disabilità che possono includere paralisi,

incapacità di parlare, perdita della vista e perdita delle funzioni cognitive. I trattamenti, uno dei quali permette di

recuperare le funzionalità perdute, sono stati studiati in conigli e ratti.

 Disordini psichiatrici: le sperimentazioni animali hanno permesso di trovare farmaci per la cura della depressione,

disturbi di ansia e schizofrenia.

Modelli più in voga

 Per la distrofia di Duchenne si studiano le cellule staminali di cane e topo.

 Topi geneticamente modificati (transgenici e knockout) sono usati per lo sviluppo di modelli di patologie, basandosi

su geni murini equivalenti: fibrosi cistica, arteriosclerosi, SLA, tumorigenesi, xenotrapianti, ecc.

 I roditori (topi, ratti, criceti) sono l’assoluta maggioranza delle specie utilizzate, più del 90% del numero totale degli

animali.

 Il topo (Mus musculus domesticus) è il più utilizzato: piccolo, meno costoso e più facilmente manipolabile del ratto,

ottima genetica.

 Il rimanente 10% è costituito da pesci, conigli, uccelli, cani, gatti, maiali, pecore, galline, insetti (Drosophila), vermi

(C. elegans), anfibi (rane), primati non umani e altri. Vengono utilizzate anche specie non animali come Arabidopsis

thaliana.

 L’armadillo è usato come modello per la lebbra in quanto la sua temperatura corporea è abbastanza bassa da favorire

la crescita del batterio Mycobacterium leprae. Grazie ad esso è stato sviluppato un vaccino sperimentale. Nell’uomo,

la lebbra si sviluppa alle estremità, dove la temperatura corporea è inferiore.

Quando si usano i modelli animali

- Dopo accurato esame della letteratura e confronto con i dati delle ricerche precedenti

- A seguito di simulazioni al pc o ricerche su cellule o colture tissutali

- Dopo aver scritto e sottoposto a comitato etico il protocollo di ricerca

- Dopo addestramento su cura, manipolazione e uso degli animali

- Prima di esperimenti clinici sull’uomo (bench to bed side dal tavolo di laboratorio al letto del paziente)

Chi si deve occupare degli animali per la ricerca

- Istituti di ricerca

- Scienziati e loro staff di ricerca

- Veterinari, tecnici di laboratorio, stabularisti e altro personale

- Agenzie di governo locale, nazionale ed europeo

- Organizzazioni scientifiche

- Malati presenti e futuri

Quesito sperimentale e ipotesi di lavoro

- Quale modello? quale animale? Come imposto l’esperimento?

- Protocollo e autorizzazione

- Esperimento metodo scientifico (osservazioni ipotesi esperimento/osservazioni conclusione (può generare un’altra ipotesi)

teoria scientifica)

- Analisi dei dati

- Primariamente, finanziamento della ricerca la ricerca sugli animali è molto costosa 6

EVOLUZIONE E FILOGENESI

Nell’utilizzo di modelli sperimentali, risulta indispensabile una conoscenza biologica, evolutiva e filogenetica

dell’animale.

La TEORIA DELL’EVOLUZIONE rappresenta il principio unificante della biologia.

L’evoluzione come è stata proposta da Darwin (poi rivista in chiave genetica), risolve due problemi fondamentali della

biologia:

- Disegno apparente: evidente ad ogni livello dell’organizzazione biologica, spiega il motivo per cui determinate

strutture biologiche sono “disegnate” in un certo modo. Infatti, la teoria dell’evoluzione spiega che le diverse

strutture biologiche sono il frutto di un adattamento graduale nel tempo (selezione naturale), tutto ciò in

contrasto con la teoria del Creazionismo.

Il disegno apparente evolve tramite un processo di selezione naturale nel corso del tempo, in cui gli individui con le

caratteristiche più adatte a sopravvivere e riprodursi proseguono la specie.

- Diversità biologica: incredibile e caotica varietà di organismi. Secondo la teoria dell’evoluzione la diversità

biologica evolve gradualmente tramite il processo della speciazione (processo di accumulo graduale di

variazioni).

Charles Darwin sviluppò la teoria dell’evoluzione a bordo della “Beagle” in un lungo viaggio durato 5 anni dalla Gran

Bretagna al Sud America, Isole Galapagos, Nuova Zelanda, Tasmania, Australia e Sud-Africa.

Secondo la teoria dell’evoluzione di Darwin le popolazioni naturali hanno un potenziale riproduttivo illimitato, tuttavia

nell’ambiente le risorse sono limitate. Ciò creerà un impedimento per la riproduzione e in particolare esiste una lotta

per l’esistenza e una competizione per l’accesso alle risorse tra gli individui.

Negli individui, inoltre, esiste una variabilità dal punto di vista genetico nei tratti che influenzano la sopravvivenza e la

riproduzione. Per tale motivo vi sarà una SELEZIONE NATURALE ossia una selezione degli individui che hanno maggiori

capacità di sopravvivenza e riproduzione. Tali caratteristiche determinano un successo riproduttivo differenziale, ossia

l’ereditarietà di caratteri che ne aumentano la sopravvivenza.

L’evoluzione quindi per selezione naturale può essere riassunta in variazione, eredità e riproduzione differenziale.

La chiave della selezione naturale risulta quindi il successo riproduttivo differenziale a causa di variazioni ereditarie

(tutti hanno antenati, ma non tutti lasciano discendenti).

Nonostante ciò, la teoria di Darwin della selezione naturale non riusciva a spiegare la CODA del PAVONE.

Questa struttura infatti, di scarsa utilità pratica e energeticamente dispendiosa, rende l’animale visibile ai predatori e

lento: risulta quindi un fattore negativo di selezione naturale.

Darwin spiegò quindi la presenza di questa struttura introducendo la SELEZIONE SESSUALE: esistono caratteri che sono

selezionati perché consentono un vantaggio in termini di accoppiamento, in termini di competizione tra i maschi (es.

corna dei cervi) o migliorando le capacità riproduttive (es. coda del pavone maschio).

La riproduzione rappresenta quindi la chiave dell’evoluzione: in particolare nella teoria della selezione sessuale, i

maschi competono per l’harem mentre le femmine scelgono il partner riproduttivo (salvo alcune eccezioni).

Ciò può essere spiegato dal tipo di gameti prodotti nei due sessi: nel maschio l’individuo produce gameti piccoli,

numerosi, energicamente poco dispendiosi e mobili mentre nella femmina, vi è la produzione di gameti grandi, sessili,

tendenzialmente immobili, ricco di citoplasma ed energeticamente dispendiosi.

Questa differenza si ripercuote sull’investimento parentale e quindi sull’allevamento della prole.

La selezione sessuale ha giocato un ruolo importante anche nell’evoluzione dell’uomo, perché più rapida rispetto alla

selezione naturale: infatti, la selezione sessuale agisce direttamente sul successo in termini di accoppiamento e

spiegherebbe la rapida evoluzione del cervello.

Secondo l’ipotesi darwiniana, il mutamento è continuo e graduale e le nuove specie appaiono per l’accumulo continuo

di variazioni e l’interposizione di barriere riproduttive. Dal punto di vista genetico, un processo evolutivo parte da

mutazioni casuali a carico del DNA che inducono cambiamenti nel genotipo e quindi nel fenotipo. Ciò induce variabilità

nella popolazione a diversi adattamenti: individui più adatti, sottoposti a pressioni selettive, trasmettono i geni alle

generazioni successive causando cambiamenti nelle frequenze alleliche nel pool genico. Ulteriori pressioni selettive e

successive generazioni possono portare quindi alla nascita di una nuova specie: questa, in base alle sue caratteristiche

di riproduttive e di sopravvivenza potrà andare incontro ad evoluzione o estinzione (successo/insuccesso

nell’ambiente). 7

L’evoluzione non segue in realtà un percorso graduale come definito da Darwin ma può essere definita in uno stato di

“equilibrio punteggiato” ossia grandi stasi evolutive e improvvise cambiamenti.

La relazione evolutiva presente tra le specie può essere seguita in modo ottimale da un punto di vista biochimico-

molecolare. È possibile misurare il tempo evolutivo (ritmo di speciazione) attraverso un’analisi delle proteine, in

particolare del DNA. Mediante analisi di sequenze di amminoacidi e relative posizioni della proteina nelle diverse

specie è possibile ottenere la differenza tra le diverse specie definita come tempo di speciazione.

Ad esempio l’antenato comune risale a circa 26 milioni di anni fa. La divergenza uomo/scimpanzé è di 1,6 e ciò vuol dire che il

98.3% di DNA è uguale; poi uomo/topo 80% di geni in comune e uomo/pomodoro solo il 20%.

La datazione non è precisa ma può cambiare in base alle tecniche utilizzate o in base al gene. Attualmente per la

datazione viene utilizzato il DNA; tuttavia, la misurazione è imprecisa e varia a seconda dell’utilizzo di DNA

mitocondriale o genomico.

Mediante esperimenti di genomica comparativa è possibile confrontare i DNA di più vertebrati.

In un esperimento del 2009 sono stati confrontati i DNA di 44 vertebrati diversi: si nota la separazione tra ominidi e scimpanzé a

circa 6 milioni di anni fa (tuttavia i fossili situano questa separazione prima).

Le differenze nelle sequenze nucleotidiche del DNA rappresentano una prova delle relazioni filogenetiche tra l’uomo

e diverse specie. In particolare tra l’uomo e lo scimpanzé vi è una % di divergenza in una sequenza di DNA selezionata

pari a 1,7 mentre tra uomo e topo vi è una % di divergenza pari a 19,8. Notiamo quindi una sorprendente conservazione

genica (ciò che cambia è l’espressione genica).

A livello cromosomico, tra i cromosomi umani e quelli di uno scimpanzé vi è una notevole analogia.

Tuttavia nonostante la vicinanza dal punto di vista genetico, lo scimpanzé non è un ottimo modello di studio poiché potrebbe

creare confusione.

Classificazione dei viventi

I viventi sono classificati in 5 regni: animali, piante, funghi, monere e protisti. I viventi sono classificati come: dominio,

regno, phylum, subphylum, classe, ordine, famiglia, genere, specie.

Esempio: dominio (esempio: eucariote); regno (esempio: animale); phylum (esempio: cordati); subphylum (esempio: vertebrati);

classe (esempio: mammiferi); ordine (esempio: carnivori); famiglia (esempio: felidae); genere (esempio: panthera); specie

(esempio: panthera pardus).

Per l’UOMO: dominio degli eucarioti, regno animali, phylum cordati, subphylum vertebrati, classe mammiferi, ordine primati,

famiglia ominidi, genere Homo, specie Homo sapiens.

Origine della vita

Esistono tre teorie sull’origine della vita:

- CREAZIONISMO ipotesi secondo la quale un creatore (Dio) abbia creato il mondo e l’uomo.

- PANSPERMIA ipotesi secondo la quale la vita sia giunta sulla terra dall’universo.

- EVOLUZIONISMO L’origine della vita sulla terra è dovuta a sintesi abiotica di materia organica presente sulla Terra

primitiva con successivo processo di selezione prima chimica, poi biologica.

Nel tempo la variabilità tra le specie influenza la prevalenza nel tempo: ciò è rilevante nel determinare il tempo di

differenziazione tra le varie specie animale, perché rappresenta la misura della somiglianza.

La teoria dell’Evoluzione – progenitore comune a tutti i viventi, filogenesi dell’uomo da altri animali –fornisce quindi

la base razionale per l’uso di animali come modello per l’uomo.

FILOGENESI:

Tempo (milioni di anni fa) Evento

4500 origine della terra per condensazione materia cosmica

4000 rocce più antiche

4000-3600 comparsa della vita

3500 fossili cellule procariote (senza nucleo)=batteri

1500 fossili cellule eucariote (con nucleo)

1000 organismi pluricellulari (comparsa metazoi)

500 evoluzione e proliferazione di piante e animali, conquista delle terre emerse

(Precambriano)

L’origine della vita sulla Terra risale a 3600-4000 milioni di anni fa in base alla scoperta di fossili di cellule batteriche

(3500 milioni di anni fa). Infatti, si pensa che sicuramente prima ci sarà stata una prima cellula da cui è partito il

8

processo evolutivo. Dal punto di vista chimico, anche se si è riusciti a simulare in laboratorio i primi eventi, non è

ancora noto come fa il DNA a originarsi spontaneamente, cioè come si forma una molecola capace di determinare i

caratteri. Probabilmente si pensa che sia stato l’RNA la prima molecola esistente che ha funzionato come stampo di

proteine, dato che è dotato di autocatalisi.

Nell’albero filogenetico degli animali dopo i batteri vi sono i fossili di cellule eucariote che risalgono a 1 milione e mezzo

fa e poi eucarioti pluricellulari; da ultimo 500 anni fa la grande evoluzione e proliferazione di piante e animali e la

conquista delle terre emerse. È bene sapere, inoltre, che trascorsero centinaia di milioni di anni prima che le

concentrazioni di ossigeno fossero sufficienti per permettere l’evoluzione degli eucarioti.

Gli animali si originarono nei mari del Precambriano più di 600 milioni di anni fa. Caratteristiche peculiari degli animali

sono: organismi eucarioti, le cellule non presentano parete cellulare, sono eterotrofi e si nutrono per ingestione.

I primi animali furono gli invertebrati: si svilupparono da forme coloniali di protozoi (unicellulari aggregati insieme);

successivamente vi fu la specializzazione degli aggregati cellulari con differenziamento di strutture per la locomozione,

l’alimentazione, la riproduzione fino allo sviluppo del sistema nervoso.

L’intero albero filogenetico degli animali presenta diversi phylum: in ordine di comparsa abbiamo spugne, meduse,

ctenofori, vermi piatti, nematodi, rotiferi ecc.

Questi sono racchiusi in 3 grandi pattern di sviluppo: acelomati, pseudocelomati e celomati (dove in embriogenesi

precoce si forma una cavità interna).

I celomati si dividono a seconda dei piani di sviluppo precoce in protostomi, in cui la bocca si sviluppa dalla bocca

primitiva e nei deuterostomi, in cui la bocca si sviluppa dove si sviluppa l’ano. Questo è un piano di sviluppo

fondamentale rilevante nella scelta di un modello. I geni che organizzano i pattern di sviluppo sono molto importanti

perché sono conservati nel tempo e determinano vincoli filogenetici- evolutivi importanti.

All’interno di questi phylum c’è una grande variabilità. L’uomo fa parte dei deuterostomi nel phylum dei cordati;

l’uomo quindi è un sottophylum vertebrati di questo phylum.

I vertebrati derivano da invertebrati detritivori con accentuato sviluppo corporeo. Sono decisamente mobili,

presentano una colonna vertebrale con strutture muscolari ossee specializzate per il movimento (appendici). Inoltre,

hanno evoluto delle strategie alimentari e sviluppato centri sensoriali specializzati e cefalizzazione.

  

Echinodermi urocordati cefalocordati vertebrati

Un animale è definito CORDATO in base alla presenza in almeno una fase della sua vita di: tasche branchiali, coda,

muscolatura metamerica e un sostegno longitudinale del corpo.

L’uomo fa parte dei cordati perché in una fase specifica dello sviluppo vi è una particolare struttura presente allo stato

embrionale: presenta un sistema assile di sostegno longitudinale (ovvero notocorda con un tubo neurale superiore e

un tubo digerente Inferiore), una coda metamerica e la formazione di fessure branchiali della faringe.

I vertebrati presentano una colonna vertebrale di tessuto osseo o cartilagineo formato da elementi metamerici ossei

e muscolari che danno sostegno e capacità di movimento ampia; hanno un sistema nervoso centrale cefalico racchiuso

in una teca ossea o cartilaginea; infine, hanno arti articolati con la colonna vertebrale.

La storia evolutiva dei vertebrati si segue meglio rispetto a quella degli invertebrati perché hanno tessuto osseo e quindi lasciano

fossili.

Il gruppo dei vertebrati è molto omogeneo basti notare la somiglianza nelle fasi iniziali tra gli embrioni di pesce, pollo,

uomo, lucertola e cane. Ciò significa che il piano di sviluppo dei vertebrati risulta estremamente conservato: ossia vi

1

sono dei geni (geni Hox ) che determinano lo sviluppo degli schemi corporei negli animali.

Analizzando l’albero evolutivo dei vertebrati, i passi importanti nell’evoluzione dei vertebrati sono caratterizzati da:

1. AGNATI, ovvero pesci che non hanno la bocca articolata (non hanno mascella, mandibola ecc); il grande passo

successivo è l’evoluzione della bocca; questa deriva dalle trabecole ossee che mantengono le fessure branchiali

dell’embrione. Si evolvono poi i primi pesci, ovvero GNATOSTOMI che presentano la bocca articolata.

11 Geni scoperti nel modello animale Drosophila melanogaster. Questi geni, nelle fasi precoci embrionali determinano il destino

delle diverse parti del corpo; sono geni identici nei vertebrati e in Drosophila, presentano lo stesso nome. La loro funzione è stata

valutata mediante mutazioni su questi geni che inducevano la comparsa di fenotipi mutanti 9

2. Successivamente, da un pesce pre-adattato in grado di respirare anche fuori d’acqua si origineranno gli ANFIBI.

Questi, attraverso lo sviluppo dei polmoni, degli arti (tetrapodi) e dell’orecchio medio saranno in grado di vivere sulla

terra ferma (PASSAGGIO ALLE TERRE EMERSE).

3. Gli anfibi, risultano tuttavia molto dipendenti dall’acqua. Il successivo affrancamento dall’acqua indurrà la comparsa

dei RETTILI. Questi presenteranno squame (annesso dermico che previene la disidratazione cutanea) e saranno in

grado di riprodursi sulla terra grazie allo sviluppo del sacco amniotico a protezione dell’embrione.

4. Dopo la grande era dei dinosauri si sono originati direttamente gli UCCELLI e poi da una linea di piccoli rettili si sono

evoluti i MAMMIFERI. Uccelli e mammiferi hanno in comune l’omeotermia cioè l’indipendenza dall’ambiente esterno

ed una maggiore efficienza metabolica.

Gli uccelli presentano una specializzazione per il volo attraverso un alleggerimento della struttura ossea e lo sviluppo

di piume direttamente dalle squame.

I mammiferi presentano una serie di adattamenti peculiari: sono eterodonti, vivipari, presentano una ghiandola

mammaria per la nutrizione dei cuccioli, hanno cure parentali e una raffinata regolazione endocrina. Inoltre

presentano un sistema nervoso centrale sviluppato da cui origina un comportamento complesso.

Il mammifero primitivo ancestrale ha vissuto nella stessa era dei dinosauri: sono relegati alle ore notturne, sono pochi

e insettivori. Solo dopo l’estinzione dei dinosauri c’è stata la grande evoluzione dei mammiferi diffondendosi nelle

varie nicchie ecologiche. L’albero evolutivo dei mammiferi mostra come dal mammifero primitivo ancestrale si sono

differenziate le diverse specie: in particolare opossum e successivamente topi, primati, insettivori e carnivori.

5. Successivamente all’evoluzione dei mammiferi, vi è stata la comparsa dei PRIMATI. Questi derivano dall’antenato

comune; infatti non sono specializzati e mantengono alcune caratteristiche quali la pentadattilia per arrampicarsi.

Tuttavia, a differenza dei mammiferi presentano diverse caratteristiche che li differenziano da essi:

1. Evoluzione di arti:

 Hanno il pollice opponibile, mano prensile

 Mantengono la pentadattilia primitiva

 Hanno dita mobili e articolate

 Hanno un equilibrio sviluppato

 Hanno dimensioni corporee piccole

2. Miglioramento della vista (da laterali, gli occhi si posizionano nella parte anteriore):

 Hanno la visione dei colori

 Hanno la visione stereoscopica, percezione della profondità

 C’è una protezione ossea per gli occhi

 Hanno una riduzione dell’apparato olfattivo

3. Sono onnivori, hanno una dentatura poco specializzata e assenza di specializzazioni alimentari.

2

Queste sono caratteristiche che differenziano enormemente i primati dagli altri mammiferi .

I primati conservano la pentadattilia, presentano arti estremamente articolati e atti ad arrampicarsi, un enorme

miglioramento della vista con gli occhi posti anteriormente al cranio che permettono una sovrapposizione dei campi

visivi (ciò permette una maggiore coordinazione spaziale ed un aumento della percezione dei colori). Inoltre

presentano delle variazioni nell’organizzazione del cervello con riduzione del senso olfattivo.

L’antenato comune dei primati si è sviluppato in diversi sottordini:

- Sottordine Prosimi: Lemuri

- Sottordine Tarsioide: Tarsi

- Sottordine Antropoidei: antenato comune degli antropoidi, da cui derivano le scimmie del nuovo mondo e le scimmie

del vecchio mondo, e l’antenato comune degli ominoidi da cui deriva la famiglia degli Ominoidi (Gibboni, Oranghi,

gorilla, scimpanzé fino ad arrivare all’uomo).

La superfamiglia OMINOIDEI comprende le grandi scimmie antropomorfe e gli uomini. Include le famiglie: Ilobatidi

(gibboni); Pongidi (scimpanzé, gorilla, oranghi) e Ominidi (la specie umana attuale e i suoi antenati estinti).

2 Nella messa a punto di un esperimento, risulta indispensabile conoscere queste caratteristiche prima di intraprendere un

esperimento. Ad esempio se in un esperimento sulla percezione usassi un mammifero, questo sarà modello povero perché si

basano sull’olfatto mentre i primati si basano principalmente sulla vista. 10

La storia che porta all’ homo sapiens sapiens inizia da:

- Ardipithecus ramidus 4,4 milioni di anni fa, probabilmente era bipede e aveva denti e cranio ancora primitivi.

- Australopitecine (4-1,2 milioni di anni fa): bipedi e con un inizio di sviluppo di massa encefalica;

- homo habilis (2,4-1,5 milioni di anni fa): sviluppo corporeo e un aumento dell’encefalo;

- homo erectus (1,8-300.000 anni fa): scoperta del fuoco;

- homo sapiens (500.000 anni fa);

- homo sapiens neanterthalensis (230.000-30.000 anni fa)

- homo sapiens sapiens (120.000 anni fa)

Attualmente ci sono due ipotesi sull’evoluzione dell’Homo Sapiens: si pensa, infatti che l’homo sapiens sia derivato

dalle varie popolazioni di Homo erectus presenti in Africa, Asia e Europa: ciò farebbe pensare all’origine delle razze

umane. Secondo un'altra ipotesi invece, si pensa che l’Homo Sapiens derivi dall’Homo erectus africano. Tutt’ora non

è ancora chiaro lo sviluppo dell’Homo Sapiens dai fossili. Mediante analisi di DNA mitocondriale (viene ereditato dalla

madre al figlio ma solo le femmine sono in grado di tramandarlo) delle popolazioni umane attuali, è stata osservata

una massima variabilità geneteica in Africa ed una derivazione di tutte le popolazioni attuali dal DNA mitocondriale

africano. La stessa analisi è stata effettuata su DNA monogenitoriale (Y: viene trasmesso da padre al figlio maschio) e

ha dimostrato una massima variabilità in Africa.

Dal punto di vista genetico, si afferma che c’è più differenza tra due africani che tra un africano e un europeo, quindi non esistono

razze nella specie umana.

La scoperta dell’Australophitecus “Lucy” ha dimostrato che questi erano presenti circa 3,2 milioni di anni fa. Erano

bipedi e in base alla lunghezza del femore è stata ipotizzata un’altezza pari ad 1 metro circa. Presentavano la postura

eretta, un cervello piccolo, falangi curve ed un’alimentazione onnivora basata sulla raccolta di vegetali e piccoli animali

(come gli insetti).

In ambito evolutivo, oltre al BIPEDISMO vi è un aumento della grandezza del cranio (ENCEFALIZZAZIONE)

dall’Australophitecus all’Homo sapiens con una velocità di evoluzione massima dall’Homo erectus all’Homo sapiens (1

milione di anni). Allo stesso tempo vi è una riduzione della dentatura (perdita del terzo molare) a causa di variazioni

nell’architettura del cranio.

Inoltre, l’Homo Sapiens risulta l’unico ad avere il mento come rafforzamento della parte masticatoria. Questi

cambiamenti della dentatura sono naturalmente, frutto di un adattamento a condizioni ambientali diverse.

Punto essenziale nel capire l’evoluzione umana è capire quando emerge la parola e la capacità di pensiero astratto complesso. A

tal proposito non è possibile lo studio dei fossili tuttavia è possibile studiare le impronte dell’encefalo all’interno della scatola

cranica che tuttavia non permettono uno studio funzionale. La certezza di un linguaggio evolutivo si ha dalle pitture rupestri,

dimostrazione di pensiero complesso astratto risalenti a 40000 anni fa.

L’evoluzione del genere Homo di corpo, encefalo e genoma è avvenuta nel tempo poiché soggetti a pressioni selettive.

Omologia e analogia

Omologia e analogia rappresentano due concetti molto importanti nella FILOGENESI e nell’EVOLUZIONE e quindi nello

studio di modelli sperimentali.

• OMOLOGIA: strutture omologhe sono strutture che hanno funzioni diverse e quindi differente morfologia, che

derivano da un piano di formazione comune (stessa derivazione embrionale).

Esempio: arti dei vertebrati presentano forme diverse ma stessa struttura di base.

Esempio: Encefalo stessa struttura nei vertebrati tuttavia il cervello umano presenta un aumento delle cellule corticali all’interno

di circonvoluzioni.

• ANALOGIA: le analogie sono un segno di evoluzioni convergenti ossia di specie che non hanno antenati comuni

vicini ma che occupando ambienti e nicchie ecologiche simili assumono conformazioni simili.

Esempio: ali di pipistrello e di una farfalla: sono completamente diverse tuttavia sono entrambe costituite da membrare rette da

strutture ossee o cheratina che le tengono tese. 11

IL QUESITO SCIENTIFICO

Di fronte ad un fenomeno biologico possiamo porci diversi tipi di questioni, ossia vi possono essere due diversi livelli

di spiegazione:

 CAUSE PROSSIME (How questions)

Questioni sulle cause prossime (o immediate) che sono alla base del funzionamento di un sistema biologico ossia la

ricerca dei meccanismi, gli stimoli che causano un processo biologico e in che modo un animale compie le sue funzioni

metaboliche, fisiologiche e comportamentali. Solitamente riguardano la biologia molecolare, biologia cellulare,

l’endocrinologia e la biologia dello sviluppo.

 CAUSE REMOTE o ULTIME (Why questions)

Un processo biologico ha una causa ultima o remota, ovvero il significato adattativo, la funzione in termini di

sopravvivenza e riproduzione dell’organismo che ha “causato”, nel corso dell’evoluzione.

IL METODO SCIENTIFICO, SCELTA DEL MODELLO e il PROTOCOLLO DI RICERCA, STRATEGIE PER L’IDEAZIONE,

STESURA E VALUTAZIONE CRITICA DI UN QUESITO SCIENTIFICO

IL METODO SCIENTIFICO

Il metodo scientifico serve per rispondere ad un quesito

scientifico.

È un metodo ipotetico-deduttivo ossia:

 IPOTETICO:

Osservazione dei fenomeni conduce all’ipotesi per

spiegarne la causa/e. Le ipotesi sono possibili cause

Es. Non c’è luce nella stanza perché

1) ipotesi = manca la corrente

2) ipotesi= è bruciata la lampadina.

 DEDUTTIVO:

Uso del ragionamento deduttivo per verificare l’ipotesi. Si

effettua una PREVISIONE

se manca la corrente accendendo l’interruttore

generale la luce dovrebbe ritornare

Attraverso un ESPERIMENTO si verifica l’ipotesi; in

presenza di più ipotesi si parte da quella più semplice e con

maggiore probabilità di essere vera (Rasoio di Occam).

L’ipotesi deve essere verificabile con il metodo scientifico

(limiti della scienza). Le ipotesi possono essere escluse

(principio di falsificabilità - Popper) ma anche quella che

risulta “vera” non può mai essere confermata con certezza

assoluta.

Un ragionamento esclusivamente deduttivo, a differenza di un metodo ipotetico-deduttivo, può condurre in errore.

Da una premessa o principio (es. assioma, teorema) possiamo giungere alla risoluzione di un caso particolare.

Aristotele e il sillogismo: Tutti i mammiferi sono vivipari => un gatto è un mammifero => perciò il gatto è viviparo

Tuttavia questo principio non può essere esteso: basti pensare che secondo un metodo deduttivo animali vivipari come vipere e

molti squali risulterebbero mammiferi.

Ciò significa che se la premessa è sbagliata si raggiungono conclusioni errate.

La scienza osserva e riporta l’esperimento e quindi la verità senza sottostare ad alcuna autorità. La scienza risponde

esclusivamente al risultato sperimentale e al giudizio dei pari che appunto giudicano tale risultato; in ciò vi è anche la

sua forza, la continua esposizione al giudizio.

Il METODO SCIENTIFICO o SPERIMENTALE è un metodo democratico perché basato sul rifiuto totale del principio di

autorità, sulla condivisione delle conoscenze e dei metodi da cui queste scaturiscono. 12

Il METODO SPERIMENTALE è applicabile ad:

- una ricerca DESCRITTIVA: determinazione quantititativa e studio delle relazioni causa effetto.

Es: stima delle persone che muoiono ogni anno per problemi cardiaci; relazione causa-effetto fra tasso colesterolo e

problemi cardiaci.

- una ricerca SPERIMENTALE: conduzione di esperimenti per dimostrare le relazioni causali: utilizzo di MODELLI

SPERIMENTALI.

In una ricerca sperimentale si procede attraverso la formulazione di ipotesi, la scelta dell’animale, la preparazione del

protocollo sperimentale e quindi la valutazione dei dati e la stesura di una relazione.

1. FORMULAZIONE DELL’IPOTESI

Dai risultati di una ricerca descrittiva o di altre ricerche sperimentali si raccolgono informazioni necessarie per

sviluppare ipotesi di lavoro.

Popper: nessuna ipotesi o teoria può essere dimostrata vera, mentre alcune possono risultare false, se non siamo in

grado di falsificare una teoria possiamo provvisoriamente accettarla

Risultano indispensabili nella formulazione dell’ipotesi una profonda conoscenza generale, un’approfondita ricerca

bibliografica e immaginazione e creatività.

2. SCELTA DI UN MODELLO

La scelta di un modello richiede quindi una pianificazione meticolosa.

È necessario definire:

 il problema di base,

 il substrato, ossia il tipo di cellule, tessuti, organi da studiare,

 la specie o il ceppo opportuno,

 i fattori decisivi, quali la disponibilità, l’adattamento, l’“animal care”, la strumentazione, la bibliografia, la perizia tecnica,

il costo, la valutazione

• dei metodi alternativi; operare quindi considerazioni scientifiche, pratiche ed etiche.

Nella scelta di un modello animale è importante valutare il substrato di base (cellule, tessuto, organo,…), l’interazione

fra organi e sistemi, l’utilizzo di un modello sano o malato, in accrescimento, adulto o vecchio e se maschio o femmina

(o entrambi). I problemi scientifici fondamentali sono risolti nel sistema più semplice e più

accessibile in cui può essere esaminato il problema. Questi organismi sono

definiti ORGANISMI MODELLO.

Caratteristiche degli Organismi Modello

La disponibilità di strumenti tecnici per le analisi

Una massa critica di ricercatori che studiano quel modello (idee, metodi,

strumenti e ceppi possono essere condivisi e confrontati).

COME scegliere un organismo modello?

Dipende da quale domanda sperimentale viene posta.

Quando si studiano fenomeni fondamentali della biologia molecolare è

conveniente utilizzare gli organismi più semplici, unicellulari o lieviti,

Domande sullo sviluppo o sulla neurobiologia o su patogenesi complesse

richiedono organismi più complessi- piante, animali.

I modelli animali sono scelti in base alla somiglianza in caratteristiche

biochimiche e di sviluppo

• Fisiologia/comportamento: conigli, cani, scimmie, uccelli, ratti, topi.

• Sviluppo: topi, rane, galline-pulcini, pesci, ricci di mare, drosophila,

nematode (C. elegans)

• Genetica: topi, ratti, zebrafish, Drosophila, nematode, lievito, batteri. 13

Scelta di un modello animale

PRIMA di tutto il PI –principal investigator – deve aver considerato le alternative all’uso di animali vivi nel suo

esperimento, come previsto dalla normativa europea.

La scelta più ovvia di specie e modello animale per una specifica ricerca può basarsi sulla letteratura scientifica:

utilizzare lo stesso modello utilizzato dagli altri ricercatori per la stessa ricerca.

La ricerca però progredisce velocemente, in particolare per quanto riguarda modelli animali geneticamente modificati

e quindi è opportuno considerare attentamente le alternative.

Vi possono essere differenti tipi di modelli animali:

 Modelli animali SPONTANEI, sono quelli che manifestano malattie o funzionalità di base che si verificano

spontaneamente nell’animale e corrispondono alle stesse malattie o condizioni nell’uomo (es. mutazioni

genetiche spontanee).

 Modelli animali INDOTTI: lo sperimentatore induce in qualche modo la patologia o distruggendo un organo (es.

pancreas → diabete) oppure utilizzando animali geneticamente modificati (adesso pratica sperimentale indotta

più utilizzata).

 Modelli animali TRANSGENICI: ingegneria genetica e tecnologia di manipolazione embrionale (topi, ma anche

pesci).

 Modelli animali NEGATIVI: refrattarietà a certe malattie e quindi cerco di capire perché quell'animale non sviluppa

quell'infezione, quella patologia, quel tipo di cancro.

 Modelli ORFANI, condizioni naturali che non hanno corrispettivo umano (storicamente: scrapie nelle pecore, ora

diventata modello per encefalopatia spongiforme umana).

Modelli animali SPONTANEI

Sono modelli in cui l’animale acquisisce spontaneamente (mutazione spontanea) una malattia che somiglia a una

malattia umana (oppure mostra una funzionalità d’organo e sistema simile). Sono modelli spontanei NATURALI, ossia

presenti in natura che sono esempi di funzionalità d’organo e sistema simile all’uomo.

•Cani Doberman Pincher: presentano una conformazione vascolare a livello cerebrale che li porta a sviluppare il

morbo di von Willebrand

• Topi NZW x NZB F1: sono ceppi inbred (inincrociati) in cui si sviluppano spontaneamente malattie autoimmuni (lupus

eritematoso e artrite reumatoide)

• Criceto, topo, cani Golden retriever: sono ottimi modelli per la distrofia muscolare.

• Ceppi di topi e ratti (es. ratti BB e topi NOD) presentano vulnerabilità al diabete, legato ad una malattia autoimmune

con formazione di autoanticorpi nei confronti delle cellule di Langherans.

• Gerbilli: sono animali fossori che vivono in ambienti molto poveri e difficili. Sono indicati nello studio dell’epilessia

poiché presentano un circuito del corpo calloso con una particolare conformazione. ob

Un esempio di mutazione spontanea è quella che avviene a livello del gene strutturale per la LEPTINA (Lep ). Questa

mutazione è stata trovata in un ceppo di topi del “Jackson Lab” che presentavano un enorme aumento di peso. Infatti

la mutazione a livello di questo gene induce una malattia dovuta al difetto di leptina o al suo recettore: la leptina

infatti è un segnale che viene inviato al cervello per bloccare il comportamento alimentare (segnale di “sazietà”).

Sappiamo che nel topo il sistema dell’alimentazione è super regolato ossia si regola in base alle quantità di grasso da

assumere indipendentemente dalla quantità di cibo. Una mutazione del gene della leptina produrrà quindi un topo

super grasso con una predisposizione al diabete.

Trasferendo questo gene in un altro ceppo (C57ABL6) produrrà diabete. Di natura non porta ad una forma severa di

diabete.

Un altro esempio di mutazione è la mutazione al recettore della leptina; questa, è stata trovata spontaneamente in

questo ceppo inbred e produce obesità accompagnata da diabete molto pronunciato.

Modelli animali INDOTTI

Sono modelli in cui la condizione sperimentalmente indotta somiglia ad una condizione presente nella specie umana.

• Ratti in cui viene indotto il diabete con trattamento con streptozootocina (agente tossico per le cellule pancreatiche)

• Primati in cui viene indotto un simil-parkinson tramite somministrazione di MPTP (1-metl-4-fenil-1,2,3,6-

tetraidropiridina)

• Topi-ratti in cui viene indotta una condizione ansiosio-depressiva tramite Stress sociale cronico

• Topi geneticamente modificati. 14

Modelli animali TRANSGENICI

Sono modelli in cui viene indotta un’alterazione del genoma tramite tecniche di manipolazione del DNA (modelli

utilizzati: topi, zebrafish e ratti). I modelli animali transgenici possono essere:

 Transgenico (classico): organismo che porta un gene “estraneo” che è stato deliberatamente inserito nel suo

genoma (gain of function).

 Knock-out: sostituzione di un segmento di gene per ricombinazione omologa che normalmente porta ad un allele

non funzionale o nullo.

 Knock-in: simile a Knock out, ma allele mutante non funzionante o parzialmente funzionante.

Questi modelli possono aiutare a capire le basi genetiche della vulnerabilità individuale alle malattie, suscettibilità e

resistenza.

Un esempio di modelli transgenici sono i ceppi murini per il Morbo di Huntington in cui avviene l’inserzione dell’esone

1 del gene HD (R6/1, R6/2, R6/5 etc.).

Animali transgenici: DNA artificiale all'interno del loro genoma

Tipo Sito integrazione Fenotipo / Funzione

Transgenico classico random - guadagno di funzione dipendente dal transgene

- perdita di funzione nel caso il sito di integrazione è

un gene

- particolare fenotipo che può essere rilevato

esclusivamente nello stato omozigote

Knock-out integrazione mirata nel gene Perdita di funzione del gene "Knocked-out"

da non esprimere

Knock-out tessuto specifico Knock out ad un tempo specifico di sviluppo o in uno

specifico tessuto

Knock-in target / random Totale o parziale guadagno di funzione

Modelli animali NEGATIVI

Sono modelli che sono resistenti ad una particolare malattia. Sono utilizzati per capire i meccanismi di immunità.

• Opossum resistenti alla rabbia

• Macachi Rhesus resistenti all’epatite B

• Wood rat immune al morso di serpente

• Squali resistenti al cancro

• Gerbilli resistenti alle radiazioni

Un esempio è la resistenza dei topi alla schistosomiasi, una patologia molto rilevante in Africa che interessa l’uomo (trasmissione

nei corsi d’acqua)

Modelli animali ORFANI

Sono modelli in cui si sviluppano malattie animali che non hanno corrispettivo nell’uomo. Un esempio è il virus visna

nelle pecore.

_______________________________________________________________________________

Fattori da considerare nella scelta di un modello

Nella scelta di un modello animale vi sono da considerare diversi fattori tutti importanti per il successo del programma

di ricerca:

 Appropriatezza del modello per lo studio in questione.

 Aspetti genetici del modello

 Modelli naturali vs. modelli prodotti sperimentalmente– es. Modelli di patologie spontanee o indotte.

 Risposte dell’animale alle procedure

 Aspetti ambientali importanti per quel modello animale

 Information di base disponibile sull’animale e lo specifico modello sperimentale utilizzato.

 Disponibilità della specie (allevamenti tecnico-scientifici, commerciali, prelievo da ambiente naturale…)

 Numero di animali necessario in relazione al disegno sperimentale e all’analisi statistica

 Distribuzione in classi di età e sesso

 Ciclo vitale e durata di vita del modello animale 15

 Dimensione corporea del modello animale

 Costi sia del modello animale che del mantenimento e gli interventi durante l’esperimento.

 Strutture (“Facilities”) necessarie per allevare in modo appropriato gli animali.

 Alcuni modelli animali richiedono sia strutture particolari di allevamento che cure particolari.

Nella scelta della specie/ceppo oltre alla presenza del substrato è importante valutare: disponibilità, adattamento,

docilità, strumentazione, animal care e valutazione etica del modello.

VALIDITÀ DEI MODELLI ANIMALI PER PATOLOGIE O FUNZIONI UMANE

• FACE VALIDITY (validità di forma): somiglianza fenotipica tra risposte fisiologiche o comportamentali negli animali e

nell’uomo. Per validità di forma si intende il grado di analogia, nel caso di patologie ossia quanto i sintomi osservati

nel modello animale somiglino a quelli del paziente.

• PREDICTIVE VALIDITY (validità predittiva): quanto il modello risponda alle stesse manipolazioni terapeutiche

utilizzate in clinica. In pratica riguarda la sensibilità del modello animale a farmaci di provata efficacia ma non ad altri

agenti. Indica, cioè, quanto la risposta al trattamento con un farmaco sia simile a quella riscontrata nella pratica

clinica.

• CONSTRUCT VALIDITY (validità di costrutto): stabilisce il grado di coerenza tra modello animale e razionale teorico

della malattia o del processo funzionale (Omologia dei meccanismi).

Ad esempio alcune risposte comportamentali difensive nell’uomo e in alcuni vertebrati (soprattutto mammiferi)

condividono gli stessi substrati neurali (omologia dei meccanismi).

3. PREPARAZIONE DEL PROTOCOLLO SPERIMENTALE

L’ ipotesi viene quindi verificata tramite una serie di esperimenti e/o osservazioni. Gli esperimenti e le osservazioni

devono essere ripetibili. L’informazione fattuale che risulta da questi esperimenti e osservazioni sono i dati.

Una parte importante di un esperimento è il controllo, che è un set up replicato identico all’esperimento, eccetto per

if fattore che viene sottoposto a verifica.

In una procedura sperimentale vi possono essere differenti variabili:

- VARIABILI INDIPENDENTI: differenza tra le due condizioni in esame

- VARIABILI DIPENDENTI: la variabile misurata per valutare l’effetto della variabile indipendente

- VARIABILI CONFONDENTI: ad esempio il ritmo circadiano del parametro ormonale.

Una volta scelto il modello animale più appropriato per il programma di ricerca (che sia un ceppo di topo

immunodepresso che richiede uno stabulario barrierato e cure speciali o un convenzionale animale di allevamento

come il maiale), il ricercatore deve valutare le possibili variabili (i fattori non sperimentali) che possono influenzare il

risultato dello studio.

È importante identificare questi fattori e controllarli a tutti i livelli dell’esperimento in modo che non aumentino la

variabilità o non compromettano l’esperimento.

Molti fattori possono influenzare la risposta di un modello animale in un esperimento e possiamo raggrupparli in

diverse categorie:

 Fattori Animali

Make-up Genetico; Inbred vs. outbred vs. mutanti vs. geneticamente modificati; Età, sesso, stato riproduttivo

Flora Microbica; Ritmi Biologici; Presenza di stress/distress; malattie; Malattia conclamata; Infezioni latenti (sub-

cliniche o silenti); Condizioni particolari legate al genotipo.

Alcuni fattori animali vengono pre-selezionati dallo sperimentatore in relazione al disegno sperimentale (es. eta’,

sesso, stato riproduttivo, stato metabolico). E’ molto importante valutare lo stato di salute e benessere del

modello animale, poiché organismi malati (conclamati o latenti) possono interferire significativamente con i

risultati sperimentali.

 Fattori fisici / ambientali

 Allevamento, cura e manipolazione

 Fattori di manipolazione sperimentale

Il PROTOCOLLO DI RICERCA viene messo a punto partendo da fatti e deduzioni che hanno portato all’ipotesi. Nel

protocollo sono formulate le ipotesi di lavoro, viene effettuata una previsione che poi andrà verificata. Il protocollo di

ricerca presenta un disegno schematico dell'esperimento con una definizione degli elementi operativi e misure, una

16

descrizione dei fattori di stress per l'animale, del numero animali da impiegare. Inoltre sono indicate la modalità di

raccolta dei dati e analisi e soprattutto i costi e il personale impiegato.

All’interno del DISEGNO SCHEMATICO DELL’ESPERIMENTO sono definiti i gruppi di trattamento e controllo, l’ipotesi

nulla: non esistono differenze fra i gruppi di trattamento e controllo, analisi statistica; sono identificate le unità

sperimentali (il singolo animale, la nidiata). Inoltre, è definita la variabilità entro individui (errori analitici e variabilità

intrinseca, la standardizzazione), riduzione dell’errore (blocking, bias e randomizzazione) e replicazione e replicabilità.

Indispensabile è la STANDARDIZZAZIONE (Ambientale, Genetica, Nutrizionale, Microbiologica)

ERRORI COMUNI NEL DISEGNO SPERIMENTALE sono mescolare o scambiare i ceppi di animali, errata identificazione

dell’animale, errori nel pesare o trattare gli animali, registrazione sbagliata dei dati, variazioni nella temperatura, ciclo

luce-buio, dieta, lettiera, o tipo di gabbia, aumento nel rumore ambientale e modifiche nella dieta.

4. VALUTAZIONE DEI DATI E RELAZIONE FINALE

L’ESTRAPOLAZIONE DEI DATI si basa sull’omologia tra differenti specie animali e tra animali e uomo. L’estrapolazione

è qualitativa e quantitativa. Quando possibile occorre condurre verifica dei dati con studi sull’ uomo, quando non

possibile, i.e. studi di tossicità, usare più specie animali di cui almeno uno di non roditori.

Test di tossicità acuta, subcronica e cronica Determinano l'effetto di un composto chimico sulla salute e la

mortalità durante vari periodi di esposizione

Test tossicità riproduttiva Valuta l'effetto di un composto chimico sulla fertilità e la

riproduzione

Test tossicità nello sviluppo Valuta la capacità di un composto chimico di causare anomalie a

livello embrionale, fetale o neonatale

Test di irritazione oculare e della pelle Misura l'abilità di un composto chimico di infiammare o irritare la

pelle o l'occhio

Test di ipersensibilità Misura la tendenza di un composto chimico a sviluppare rash e

risposte allergiche nel modello

Test di fototossicità Determina come un composto chimico viene attivato dalla luce del

sole e quindi la sua tossicità

Studi tossico-cinetici Esplora l'assorbimento, la distribuzione, il metabolismo e

l'eliminazione di un composto chimico

Test comportamentali Monitora gli effetti di un composto chimico sulle funzioni cognitive

nello sviluppo e nell'adulto

Principi delle tecniche di sperimentazione (le tre R)

I principi delle tecniche di sperimentazione umane sono stati definiti da Russel & Burch nel 1959. Questi,

comunemente chiamati le TRE “R”, sono ad oggi attualmente integrati nelle normative europee riguardanti l’utilizzo

di modelli animali. Queste, devono essere messe in atto dal ricercatore sempre e sono:

- REPLACEMENT, sostituzione di animali viventi con tecniche in vitro, modelli computerizzati, video, ecc.

- REDUCTION, diminuzione del numero di animali richiesti per un particolare esperimento.

- REFINEMENT, diminuzione nell’incidenza o severità delle procedure dolorose o angoscianti. 17

MODELLI ANIMALI SEMPLICI: GLI INVERTEBRATI

Gli invertebrati sono utilizzati come modelli per la genetica e lo sviluppo embrionale.

Si utilizzano nello studio di pathway altamente conservati dagli invertebrati all’uomo, come lo sviluppo e a livello della

comunicazione cellulare ossia a livello del funzionamento delle cellule e della loro comunicazione nella formazione

dei tessuti.

Sono modelli di funzione, di patologia e drug discovery.

 MODELLO ANIMALE: il NEMATODE, CAENORHABTIDIS ELEGANS

Il genoma umano contiene circa 20000-25000 geni che codificano per proteine (ne erano stati predetti 35000), un

numero pressoché identico al numero di geni (circa 19000) presenti nel genoma di Caenorhabditis elegans.

(la complessità non correla con il numero dei geni).

Caenorhabditis elegans fa parte del phylum dei nematodi.

Presenta diverse caratteristiche di interesse:

 Ciclo vitale breve: 2 settimane di vita

 una caratteristica fondamentale è la rapidità di generazioni: si può allevare molto facilmente in laboratorio e

in tempi brevi si possono ottenere molte generazioni.

 ha una lunghezza di 1,5 mm

 presenta meno di 1000 cellule somatiche (959 di cui 302 neuroni)

 19000 geni

 6 cromosomi

 2000 ceppi mutanti

 sono presenti due tipi sessualmente diversi di organismi: il maschio e l’ermafrodita

 3

per quanto riguarda la riproduzione è in grado di produrre un ampio numero di “self-progeny”

 riproduzione sessuale in modo da poter derivare stock genetici

 un numero limitato di cellule trasparenti che consentono di seguire lo sviluppo in diretta

Caenorhabditis elegans viene allevato su capsule Petri, nutrito con una semplice dieta di batteri (E. coli) ad una

temperatura di 25° C. Ciclo vitale:

Uovo - Stadio giovanile (L2) :12 ore

Stadio giovanile (L3) - adulto: 40 ore

Adulto (L4) – Morte: 15 gg

Se c’è carenza di cibo o un eccesso di popolazione, C. elegans può svilupparsi attraverso uno stadio larvale L3

alternativo: l’animale entra dunque in uno stato larvale DAUER, nel quale può restare per alcuni mesi, caratterizzato

da basso metabolismo, resistenza agli stress e interruzione dei processi di invecchiamento.

Durante lo stadio L4 gli ermafroditi producono lo

sperma e depongono le uova, ormai adulti. I maschi

possono comunque inseminare gli ermafroditi, i

quali utilizzeranno lo sperma del maschio

preferenzialmente (riproduzione sessuata e

asessuata).

C. elegans è composto da relativamente poche e ben

conosciute linee cellulari e rappresenta quindi un

importante modello animale di sviluppo.

Il pattern di segmentazione e l’origine di ogni singola

cellula del corpo del nematode adulto è stata

mappata.

Molte cellule vanno incontro a morte cellulare

programmata (apoptosi).

3 Self progeny: possibilità di incroci e autoincroci ottenendo una progenie identica 18

Grazie alla possibilità di seguire la crescita delle cellule (trasparente), è stato scoperto il meccanismo dell’apoptosi

durante l’embriogenesi. Infatti, si scoprì che non tutte le cellule che si formano nell’embrione faranno parte dell’adulto

ma alcune di esse vanno in apoptosi.

L’apoptosi ha un ruolo determinante nella MORFOGENESI ossia lo sviluppo della forma e della struttura di un

organismo, sia da un punto di vista evolutivo, sia dal punto di vista dello sviluppo ontogenetico del singolo organismo

a partire dalla cellula fecondata (sviluppo embrionale); in quest'ultimo caso, il processo è favorito dall'azione dei

morfogeni. La morfogenesi dà informazioni di posizione e promuove modificazioni cellulari; inoltre, agisce in modo

dipendente dalla concentrazione con una soglia di concentrazione. Ha una distribuzione asimmetrica (nell’ oocita o

precursore dell’uovo e nell’ embrione per secrezione e trasporto)

Il Pathway della morte cellulare è stato scoperto in C. elegans ed è sotto controllo.

Funzioni dell’apoptosi:

1) Eliminazione di strutture non più necessarie (esempio: regressione della coda nel girino)

2) Morfogenesi (apoptosi delle cellule poste tra le dita)

3) Controllo del numero delle cellule in un tessuto, in particolare il sistema nervoso

4) Omeostasi tissutale, e.g. rigenerazione/regressione del fegato

5) Eliminazione di cellule danneggiate, ad esempio cellule con DNA danneggiato da UV

6) Eliminazione di cellule potenzialmente pericolose ad esempio linfociti T o B che riconoscono autoantigeni

7) Eliminazione di cellule infettate da patogeni

C. elegans e la scoperta dei geni che regolano la morte cellulare programmata

Studi genetici in C. elegans hanno chiarito i meccanismi molecolari che regolano l’apoptosi.

Delle 1090 cellule somatiche generate durante lo sviluppo di C. elegans, 131 vanno incontro ad apoptosi. Inoltre la

fase in cui una data cellula muore e l’identità delle cellule che muoiono sono sempre le stesse.

Mutazioni specifiche hanno portato all’identificazione dei geni coinvolti nella regolazione dell’apoptosi.

Lo studio delle mutazioni indica che nonostante la morte cellulare programmata si verifichi in cellule di linee diverse,

tutte le cellule utilizzano la stessa via genetica. In C. elegans sono coinvolti nella morte cellulare 15 geni. Questi geni

controllano quattro processi: (1) scelta della morte cellulare, (2) adempimento della scelta (3), soffocamento delle

cellule morenti e (4) degradazione dei resti cellulari all’interno delle cellule stesse.

Per l’attuazione del programma di morte cellulare è necessaria l’espressione di ced-3 e ced-4; le mutazioni che

inattivano uno di questi geni portano alla sopravvivenza delle cellule che normalmente morirebbero.

L’espressione di ced-3 e ced-4 è controllata da ced-9.

Le mutazioni con acquisto della funzione che provocano un’espressione costitutiva o una sovraespressione di ced-9

impediscono la morte cellulare.

Al contrario, le mutazioni con perdita della funzione che inattivano ced-9 portano a mortalità embrionale, suggerendo

che ced-9 agisca inattivando ced-3 e ced-4 nelle cellule che sopravvivono.

In altre parole, ced-9 è un gene interruttore per l’apoptosi. Le cellule che esprimono ced-9 sopravvivono e quelle che

non l’esprimono muoiono.

Il gene ced-9 ha un omologo umano, bcl-2, un protooncogene che controlla l’apoptosi.

Il trasferimento del gene umano bcl-2 clonato in embrioni di C. elegans mutanti nulli per ced-9 impedisce l’apoptosi,

suggerendo che i nematodi e i mammiferi condividano una stessa via per questo processo e quindi che i geni

dell’apoptosi sono conservati nell’evoluzione.

Grazie a queste importanti scoperte sulla regolazione genica dello sviluppo e della morte cellulare programmata, è

stato assegnato il premio NOBEL per la medicina e la fisiologia nel 2002 a Brenner, Horvitz e Sulton.

Jove: An overview of the Model Organism: C.elegans

C. elegans è un organismo modello che ha rivoluzionato l’approccio negli studi genetici per comprendere come i geni regolano

l’attività cellulare. Infatti, grazie alla sua semplicità dal punto di vista genetico, un corpo trasparente e facili condizioni di crescita,

C. elegans rappresenta un modello ideale nello studio dello sviluppo embrionale, delle funzioni neuronali, crescita e

invecchiamento e nello studio delle basi molecolare di alcune patologie umane.

C. elegans, appartenente al phylum dei nematodi, è un organismo multicellulare con una lunghezza di circa 1 mm.

Presenta un corpo cilindrico, non segmentato e privo di appendici. Hanno un corpo trasparente e, dal punto di vista sessuale,

esiste come ermafrodita e maschio. Gli ermafroditi sono capaci di auto-riprodursi e di riproduzione sessuale con l’individuo

maschio. 19

C. elegans vive nel suolo con costanti livelli di ossigeno e umidità.

In laboratorio sono coltivati in capsule Petri (agarosio) con batteri E. coli.

Presenta un ciclo vitale rapido di circa 14 giorni. Presenta 4 diversi stadi, da L1 a L4, e maturano da un uovo ad un “verme” in

grado di deporre uova. Lo sviluppo dell’organismo è influenzato da diverse condizioni di temperatura e, in laboratorio, sono

coltivati a 15°C, 20 °C o 25 °C.

Caratteristiche che rendono C. elegans un ottimo organismo modello:

 economico e facile da coltivare in mezzo solido o liquido.

 Grazie alla sua trasparenza durante il ciclo vitale, è facile analizzare l’anatomia dell’organismo mediante microscopio. Questa

caratteristica è particolarmente importante nello studio dello sviluppo ed è stata indispensabile nella mappatura di ogni

singola linea cellulare. La trasparenza può essere seguita, in vivo, mediante marcatori fluorescenti come GFP (Green

Fluorescent Protein).

 È un organismo molto fertile: ogni ermafrodita depone circa 300 uova mediante “self-fertilization” e quindi risulta molto facile

ottenere grandi quantità di C. elegans. Inoltre, raggiungono la maturità sessuale in 3,5 giorni a 20°C.

 Sono facilmente manipolabili geneticamente. Analizzando le mutazioni, in base alle funzioni geniche, possono essere introdotte

mutazioni nei “vermi” grazie al trattamento con agenti chimici e l’esposizione ai raggi UV. Le analisi del genoma sono facili da

ottenere e i numerosi geni analizzati hanno permesso di constatare un loro coinvolgimento nei fenomeni biologici e nel

comportamento. Inoltre, il “C. elegans Genetic Center” (CGC) contiene un enorme numero di mutanti, disponibili per la

ricerca.

 C. elegans è stato il primo organismo pluricellulare con genoma completamente sequenziato. La sequenza completa e

mappatura dettagliata dei cromosomi ha rilevato la presenza di geni conservati tra l’uomo e l’organismo.

 In aggiunta a queste caratteristiche, la comunità scientifica ha sviluppato numerose risorse disponibili online per lo studio di

questo organismo.

Importanti scoperte grazie agli studi su C. elegans

Nel 1963, Brenner decide di stabilire C. elegans come organismo modello per effettuare studi sulle funzioni dei geni. Nel 1974

pubblica i risultati dei suoi screen genetici in cui mostra diversi fenotipi (corpo tozzo, movimenti non coordinati e mutanti). Nel

1976, Sulton, che lavorava con Brenner, pubblica la linea cellulare completa di C. elegans: questa, è stata ottenuta seguendo ogni

singola cellula (come questa si differenziasse e si dividesse). Sulton mostrò che le prime 5 divisioni cellulari producevano 6 cellule

promotori che differenziandosi danno vita a tutti i differenti tessuti dell’organismo. Nel 1986, Horvitz pubblicò i suoi primi studi

sulla scoperta dei geni della morte cellulare. Durante lo sviluppo, alcune cellule sono eliminate dall’attivazione di questi geni per

il normale sviluppo del verme e di altri organismi. I suoi lavori sulla morte cellulare programmata, o apoptosi, hanno prodotto un

grande impatto sulla comprensione e sullo sviluppo dei tumori e nelle patologie neurodegenerative.

Nel 2002, Brenner, Sulton e Horvitz grazie ai numerosi studi su C. elegans, ottennero il premio NOBEL per la medicina e la fisiologia.

Nel 2006, Andrew Fire e Craig Mello conseguirono il premio NOBEL per la fisiologia e la medicina per i loro importanti lavori sull’

RNA interference (RNAi), un processo che comporta il silenziamento di geni mediante degradazione di specifiche molecole di

mRNA. La tecnologia RNAi è attualmente in fase di sviluppo per uso terapeutico.

Nel 2008, Martin Chalfie ha ricevuto il Premio Nobel per la Chimica per aver dimostrato che la proteina fluorescente verde (o GFP)

può essere espressa in C. elegans e utilizzata come reporter fluorescente. Da allora, GFP è espressa in tutti i principali organismi

modello.

Come organismo modello, C. elegans può essere usato per rispondere a molte importanti domande scientifiche.

Ad esempio, i vermi sono un modello animale molto conveniente per lo studio neurobiologia. Sebbene, vermi non hanno un

cervello per sé, hanno un sistema nervoso piuttosto sofisticato composto da 302 neuroni - quasi un terzo del totale delle 959

cellule trovate in un ermafrodita adulto.

I vermi rispondono agli stimoli ambientali, come la disponibilità di cibo, la densità di popolazione, o sostanze chimiche come

chemoattrattive.

Oltre agli studi di genetica, l’ablazione laser - che è, il taglio selettivo dei neuroni con raggi laser – e l’elettrofisiologia ci hanno

portato ad apprezzare come i neuroni possono funzionare e comunicare in organismi multicellulari. Infatti, tutta la connettività

del sistema nervoso in C. elegans è stato mappato.

I vermi sono anche una scelta ideale per studi sull'invecchiamento; infatti, la loro breve vita ha permesso ai ricercatori di condurre

studi genetici per la ricerca di geni della longevità. Anche se molti di questi geni sono conservati negli esseri umani, noi non

sappiamo ancora se o non influenzano la durata della vita nelle persone.

Ricerche su questo organismo hanno anche migliorato le nostre conoscenze sulle malattie umane. Reporter fluorescenti sono stati

utilizzati in vermi per imitare l'aggregazione, cioè, l'aggregazione di proteine mal ripiegate, come l’alfa-sinucleina. Questi aggregati

causano la degenerazione dei neuroni con conseguente deficit motori.

Screen genetici in C. elegans hanno contribuito a identificare i geni che impediscono la perdita di neuroni nelle malattie

neurodegenerative, come il Parkinson e Il morbo di Alzheimer. 20

RNA interference in C. elegans

Nel 1998, su C. elegans è stato scoperto il meccanismo dell’RNA interference (RNAi), RNA a doppio filamento che

regola l’espressione genica. Questo meccanismo è stato successivamente ritrovato in Drosophila, nel topo e nell’uomo

(dall’organismo più semplice al più complesso). La RNA interference (dall'inglese interferenza dell'RNA,

abbreviata comunemente come RNAi) è un meccanismo

epigenetico mediante il quale alcuni frammenti di RNA sono

in grado di interferire (e spegnere) l'espressione genica.

La RNAi si distingue da altri fenomeni di silenziamento

genetico, dal momento che in Caenorhabditis elegans è stata

osservata essere in grado di diffondere da cellula a cellula e

di essere ereditabile. Ciò è stato osservato anche nelle

piante, oltre che nei mammiferi ma, nell'ultimo caso con

minore efficienza, e solo nei primi stadi dello sviluppo

embrionale.

Si distingue quindi tra meccanismi coinvolgenti molecole a

doppio filamento, RNA interference in senso stretto, mediate

da molecole come Short interfering RNA e fenomeni

coinvolgenti miRNA, a singolo filamento.

La RNAi è un processo specifico e potente portato avanti

dalla cellula. Sebbene non tutti i dettagli del processo stesso

siano ancora chiari, sembra che il cosiddetto macchinario

dell'RNAi, una volta individuata una molecola di RNA a

doppio filamento (dsRNA), sia in grado di avviare il

meccanismo della RNAi.

1. Attraverso un enzima (chiamato Dicer), la sequenza di dsRNA è tagliata in frammenti di lunghezza minore (19-21

paia di basi).

2. Il breve frammento di dsRNA (chiamato short interfering RNA, o siRNA) si associa ad un complesso enzimatico

denominato RISC (dall'inglese RNA induced silencing complex, complesso silenziatore indotto dal Rna). RISC

reprime i geni in tre modi: inibendo la traduzione, modificando i promotori o determinando la digestione

dell’mRNA da trascrivere.

3. L'RNA a doppio filamento viene aperto, probabilmente da una elicasi: solo il filamento di RNA antisenso rimane

associato a RISC, mentre il filamento senso viene degradato.

4. La RISC è ora attiva: è in grado di scansire molti mRNA presenti nel citosol fino a trovarne uno complementare al

frammento di RNA antisenso associato al complesso stesso.

5. Se l'appaiamento tra siRNA e mRNA è perfetto (o quasi perfetto), una componente della RISC (detta argonaute

protein o Argo) è in grado di operare un taglio sull'mRNA. I due frammenti di mRNA risultanti, privo di cappuccio

al 5' uno e di coda di poliA al 3' l'altro, vengono così rapidamente degradati dalle RNAsi della cellula stessa.

Se l'appaiamento, invece, non è perfetto, si pensa che la RISC sia comunque in grado di inibire la traduzione del

gene. Sebbene il meccanismo di questo secondo evento non sia chiaro, sembra che possa essere molto diffuso

negli animali.

La scoperta dell’RNAi in C.elegans è significativa per due aspetti:

- RNAi appare essere universale

- L’investigazione sperimentale ha rivelato i meccanismi molecolari.

Jove: RNAi in: C.elegans

L’RNA interference, o RNAi, è una tecnica largamente usata in cui l’RNA a doppio filamento viene introdotto in un organismo,

causando il silenziamento di un gene bersaglio. La scoperta, valsa il Nobel, dell’RNA interference ha permesso ai ricercatori di

silenziare qualsiasi gene appartenente a C. elegans al fine di determinarne la sua funzione.

Attraverso la preparazione di piastre con E. coli, che esprimono il dsRNA per il gene bersaglio, siamo in grado di indurre RNAi in C.

elegans. Allo stadio larvale L4, i vermi vengono trasferiti alle piastre RNAi per poter deporre le uova. Nella fase di sviluppo

desiderato la progenie sono raccolti e ha segnato per fenotipi. 21

La tecnologia RNAi è spesso utilizzata in C. elegans per condurre screen genetici inversi, screen automatizzati ad alto rendimento,

e come strumento per lo studio processi di sviluppo.

Cominciamo mostrando prima come funziona RNA interferenza.

Nel caso di C. elegans, i vermi sono alimentati da batteri, che sono state trasformati con plasmidi che codificano per RNA a doppio

filamento complementare al gene che si desidera silenziare. Attraverso un meccanismo attualmente sconosciuto, una volta

ingerito il dsRNA entra nei tessuti di C. elegans.

Una volta all'interno della cellula, l'enzima Dicer scinde l'RNA a doppio filamento in RNA interferenti breve, o siRNA, (21-23

nucleotidi).

Successivamente, i siRNA associandosi con l'RNA induced silencing complex, noto anche come RISC, si srotola.

Poi, il complesso siRNA / RISC si lega all'mRNA di destinazione attraverso l’appaiamento delle basi complementari. Questo porta

alla degradazione dell'mRNA, silenziando così quel gene.

Prima di iniziare la procedura, i batteri che esprimono l'RNA a doppio filamento di interesse devono essere preparati.

In commercio sono disponibili biblioteche di batteri che contengono plasmidi dsRNA-Encoding per migliaia di geni.

Altrimenti, la sequenza del gene bersaglio deve essere clonato in un plasmide utilizzando tecniche di clonazione standard. Il

plasmide contiene un gene per la resistenza alla ampicillina, che può essere usato per selezionare per

colonie batteriche contenenti il plasmide.

Successivamente, sono utilizzate tecniche standard per la trasformazione del ceppo di batteri E. coli (DE3) attraverso un plasmide

codificante il dsRNA di interesse in modo tale da esprimere il doppio filamento di RNA.

Inoltre, è necessario utilizzare batteri trasformati con un plasmide vuoto come controllo.

È importante sottolineare che il ceppo di E. coli usato in questi esperimenti non presenta l’RNA polimerasi III, che altrimenti

digerirebbe l’RNA a doppio filamento.

Questo batterio contiene anche un gene inducibile IPTG per T7 DNA polimerasi, che trascrive il dsRNA nel plasmide. Infine, i batteri

(DE3) sono entrambi tetraciclina e carbenicillina resistenti, per mantenere l’espressione dell’RNA polimerasi III e prevenire la

crescita batterica indesiderata.

Successivamente, i batteri trasformati HT115 (DE3) vengono distribuiti su piastre di agar LB contenente 12,5 mg / ml di

tetraciclina e 25 ug / ml carbenicillina; quindi le piastre sono incubate per una notte a 37 ° C. La mattina seguente sulle piastre

saranno presenti le colonie batteriche. A questo punto, selezionare un singolo batterio per colonia e aggiungerlo al 1 ml di brodo

LB contenente 100 ug / ml di ampicillina per selezionare per i batteri contenenti il plasmide. Incubare per una notte a 37 ° C con

agitazione. Dopo la notte di incubazione, aggiungere 5 ml di brodo LB contenente 100 ug / ml di ampicillina alla cultura, e

incubare per 4-6 ore a 37 ° C. Una volta che i batteri sono pronti, le piastre per vermi RNAi devono essere preparate per

l'alimentazione. (piastre RNAi contengono: agar, acqua, carbenicillina, Worm medium mix e IPTG per indurre la DNA polimerasi

T7 nei batteri che trascrive il dsRNA nel plasmide). Aggiungere 0,5 ml di coltura batterica alle piastre RNAi e incubare una notte a

37 ° C, creando una distesa batterica.

Prima di aggiungere vermi alle piastre RNAi, è importante sincronizzare la fase di sviluppo del verme, in modo che qualsiasi

differenza osservata nel fenotipo non sia un artefatto della fase di sviluppo.

Per sincronizzare le fasi di sviluppo dapprima sterilizzare alla fiamma un’ansa di platino. Utilizzare l’ansa per per aggiungere i vermi

L4 per ogni piatto RNAi, e incubare una notte a 20 ° C, permettendo loro di diventare giovani adulti in grado di depositare le uova.

Successivamente, trasferire i giovani adulti su una nuova piastra RNAi e incubare per 6-8 ore a 20 ° C, durante il quale vengono

deposte le uova. Una volta che tutti gli adulti vengono rimossi, le uova saranno evolutivamente sincronizzate. Infine, lasciar

crescere i vermi su piastre RNAi fino a quando non hanno raggiunto la fase di sviluppo di interesse per l'analisi.

Successivamente alla fase di lavoro necessari per la visualizzazione (agar e immobilizzazione) si osservano i vermi al microscopio

in modo tale da confrontare i vermi che hanno avuto RNAi silenziamento genico con i controlli, e notare le differenze in termini di

dimensioni, stadio di sviluppo, la morfologia, i modelli di localizzazione delle proteine con tag fluorescenza, e altri potenziali

fenotipi.

Una delle più importanti applicazioni di RNA interferenza è la capacità di eseguire con facilità screen genetici inversi.

Uno screen genetico inverso è un approccio per scoprire la funzione del gene silenziando una collezione conosciuta di geni e

valutando quindi il risultato fenotipico.

Per esempio, i ricercatori possono utilizzare una libreria di batteri che esprimono dsRNA per quasi tutti i geni del genoma di C.

elegans.

Quindi, gli effetti fenotipici dell’RNAi knockdown di molti geni possono essere valutati, dando comprensione normale in vivo delle

funzioni geniche.

Screen genetici automatizzati sono screen genetici inversi con un estremamente elevato volume di produzione.Negli screen

genetici automatizzati, l’intero genoma di C. elegans può essere silenziato molto facilmente utilizzando la manipolazione

robotizzata delle migliaia di cloni batterici e utilizzando strumenti specializzati per l’analisi quantitativa. 22

Ad esempio, i vermi che esprimono un reporter fluorescente transgenico per il gene per il peptide anti-microbico NLP 29, sono

soggette al silenziamento mediante RNAi di migliaia di geni tramite alimentazione batterica.

Lo sviluppo di C. elegans è spesso studiato utilizzando RNAi. Gli scienziati possono usare RNA interference per abbattere qualsiasi

gene (o un insieme di geni) di interesse e valutare esattamente come quel gene influenza i processi durante lo sviluppo e / o i

tempi di sviluppo. Ad esempio, il silenziamento attraverso l’RNAi può rivelare i geni che ritardano lo sviluppo, se silenziato, o geni

coinvolti nello sviluppo degli organi.

________________________________________________________________

Una caratteristica importante per lo sperimentatore è la presenza di molte risorse riguardanti il modello.

Il WormBase è una piattaforma di risorse per il genoma e la biologia, specifica per C. elegans. E’ un MOD (model

organism database). Su questa piattaforma vi si trovano:

- Banca dati per reagenti stock genetici, vettori, cloni, sequenze, proteine, coppie di primer, transgeni

- Mappe genetiche

- Ampio set di dati genoma, loci, microarrays, interazioni, pattern di espressione, RNAi

- Letteratura

- Convegni, annunci, proposte di lavoro.

Tutti i principali organismi modello hanno un MOD:

- FlyBase Drosophila

- SGD Saccharomyces

- TAIR Arabidopsis

- MGD Mus

- RatDB Rattus

- PlasmoDB Plasmodium

C. elegans oltre ad essere un modello per l’embriogenesi e per la funzione neuronale, è diventato un modello molto

interessante per il Parkinson, l’Alzheimer e l’autismo. Ci sono dei geni che predispongono ai disordini dello spettro

autistico che vanno ad alterare la connessione neuronale: si vede molto bene in Caenorhabditis perché è trasparente.

È inoltre un modello per l’obesità: anche se non possiede il tessuto adiposo, si possono studiare la regolazione del

metabolismo e il surplus energetico.

 MODELLO ANIMALE: il MOSCERINO DELLA FRUTTA, DROSOPHILA MELANOGASTER

È il modello più antico e tradizionale su cui sono state fatte moltissime scoperte in diversi ambiti dalla genetica alla

patologia. Un esempio è la scoperta del meccanismo cellulare della nocicezione (percezione del dolore): il recettore è

una proteina codificata da un gene specifico altamente conservato, che è stato successivamente ricercato e trovato

nel topo e nell’uomo. È un modello molto importante nello sviluppo farmaceutico di nuovi analgesici.

Utilizzando il calore come stimolo dolorifico è stata vista l’attivazione dei centri del dolore grazie a questo gene. Il

knockout, invece, determina l’attivazione dei centri visivi, uditivi e olfattivi come conseguenza dell’esposizione al

calore.

Presenta diverse caratteristiche fondamentali: è un insetto piccolo e facile da allevare in laboratorio; presenta pochi

cromosomi (2n = 4; 3 autosomi e 1 sessuale); mutanti conosciuti, mutazioni di sviluppo che determinano lo schema

corporeo di un organismo identificate.

È stato dimostrato che la maggior parte dei geni che formano gli organi e le parti del corpo hanno una controparte

diretta nei mammiferi, incluso l’uomo; inoltre, tutti gli animali condividono un toolkit comune di geni per

l’organizzazione dello schema corporeo.

Drosophila melanogaster è un invertebrato che appartiene al phylum degli artropodi. L’antenato comune con l’uomo

è molto lontano tuttavia sono conservati numerosi geni.

Presenta un ciclo vitale rapido che permette l’osservazione della Ciclo vitale (2 settimane circa):

longitudinalità e della trasnsgenerazionalità degli effetti: inoltre, Embrione – larva (1° stadio) : 1 giorno

questo rappresenta un’ottima carattiristica per contenere i costi di Larva (1° stadio) – larva (2° stadio): 1 giorno

mantenimento. Larva (2° stadio) – larva (3° stadio): 1 giorno

La presenza di diversi stadi è molto interessante perché le Larva (3° stadio) – pupa: 2,5 – 3 giorni

trasformazioni fenotipiche sono regolate da segnali cellulari Pupa – adulto: 3,5 – 4,5 giorni

geneticamente controllati su cui è possibile intervenire.

Dal punto di vista sessuale, è un organismo con riproduzione sessuale con una determinazione cromosomica del sesso.

La determinazione del sesso nell’uomo è stata scoperta grazie a studi condotti su Drosophila. 23

L’introduzione della Drosophila come organismo modello (1908) la si deve a Thomas Morgan e i suoi collaboratori alla

Columbia University. Morgan necessitava di scegliere un animale d’elezione per effettuare esperimenti di mutagenesi

al fine di comprendere meglio come funzionasse l’eredità genetica mendeliana. Insieme ai i suoi collaboratori mise

frutta marcescente sul davanzale del laboratorio e, tra le creature che furono catturate, la Drosofila divenne il modello

animale per le ricerche.

Grazie appunto alle ricerche di Morgan sono state prodotte le prime mappe genomiche in Drosophila. Caratteristiche

utili che hanno portato alla scelta di questo organismo come modello animale sono state:

 un’elevata fecondità (una femmina può deporre fino a 600 uova in 10 giorni)

 ciclo vitale rapido

 Quattro cromosomi (due grandi autosomi, una piccola X, e un piccolissimo quarto cromosoma)

 

Cromosomi politenici Un cromosoma politenico è un cromosoma gigante. I cromosomi politenici si formano in

seguito a vari cicli di replicazione che producono molte copie (anche centinaia) di cromatidi fratelli che rimangono

uniti.

La formazione dei cromosomi politenici ha la funzione di aumentare il volume cellulare ma può anche comportare un vantaggio

metabolico dato che l'elevato numero di copie di geni permette un alto livello di espressione genica. In Drosophila

melanogaster, per esempio, i cromosomi delle ghiandole salivari delle larve subiscono numerosi cicli di endoreplicazione, e

questo consente di produrre grandi quantità di secreto prima dell'impupamento.

Al microscopio i cromosomi politenici mostrano caratteristici pattern di bande chiare e scure che possono essere utilizzati per

identificare riarrangiamenti cromosomici e delezioni. Bande scure corrispondono spesso alla cromatina inattiva, mentre bande

chiare si trovano di solito in aree con una maggiore attività trascrizionale.

Questa caratteristica peculiare ha permesso la costruzione di mappe genomiche.

Nel 1910, Morgan e i suoi collaboratori grazie ai suoi esperimenti fu in grado di dimostrare la I e la II legge di Mendel

(geni localizzati sui cromosomi e segregazione indipendente) in cui mostra la corrispondenza tra i fattori mendeliani

ereditari ed una localizzazione cromosomica.

Il contributo decisivo per dimostrare la collocazione dei geni sui cromosomi venne dato dagli esperimenti di incrocio

sul moscerino della frutta Drosophila melanogaster, i quali dimostrarono che alcuni caratteri ereditari dipendono

dal sesso (si trovano sui cromosomi sessuali). La peculiarità dei caratteri legati al sesso è il fatto che portano

informazioni ereditarie le quali non seguono le leggi mendeliane.

I moscerini infatti presentavano soltanto quattro paia di cromosomi e la loro riproduzione era notevolmente rapida.

Il primo passo di questo esperimento fu individuare la caratteristica peculiare della Drosophila: grandi occhi di un

rosso brillante. Iniziarono l'esperimento effettivo incrociando gli stessi moscerini fra loro, e, un giorno, dopo varie

generazioni, comparve un moscerino che presentava occhi bianchi. Il soggetto, classificato come “mutante”, venne

fatto incrociare con una femmina con occhi rossi e, di conseguenza, tutta la generazione F1 nacque con gli occhi

rossi. Dunque il fenotipo “occhi bianchi” sembrava essere recessivo. Morgan poi incrociò tra loro i moscerini della

generazione F1, tuttavia nella generazione F2 i dati furono diversi dalle aspettative, in quanto non si manifestò il

rapporto atteso (3:1) tra i fenotipi dominante e recessivo. Inoltre tutti gli individui con gli occhi bianchi erano

maschi. Sulla base degli esperimenti effettuati venne formulata la seguente ipotesi: “il gene codificante per il colore

degli occhi è presente solo sul cromosoma sessuale femminile X”.

L'allele per il carattere occhi-bianchi deve essere recessivo dal momento che tutti i moscerini F1 avevano gli occhi

rossi. Una femmina eterozigote, perciò, avrebbe occhi rossi, e questa è la ragione per cui non c'erano femmine

occhi-bianchi nella generazione F2. Invece, un maschio con un cromosoma X che possiede l'allele per occhi-bianchi

dovrà sempre essere occhi-bianchi, dal momento che non è presente nessun altro allele. Ulteriori incroci

sperimentali, dimostrarono che l'ipotesi di Morgan era corretta. Dimostrarono inoltre che i moscerini con il

carattere occhi-bianchi hanno maggiori probabilità di morire prima di raggiungere la maturità rispetto ai moscerini

con il carattere occhi-rossi. Ciò suggerisce che l'allele con il carattere occhi-bianchi presenta anche altri effetti e

spiega perché il numero dei moscerini con il carattere occhi-bianchi era inferiore all'attesa sia nella generazione F2

sia nel testcross. Questi esperimenti introdussero il concetto di caratteri legati al sesso; i risultati convinsero

Morgan e molti altri genetisti che l’ipotesi di Sutton era corretta: i geni sono posti sui cromosomi. Le prove

conclusive della localizzazione fisica del gene, tuttavia, vennero fornite da una successiva serie di esperimenti.

In questo modo, Morgan dimostrò non solo che i geni sono situati sui cromosomi ma anche che l’eredità trasmessa

dai cromosomi che determinano ha delle modalità ereditarie diverse rispetto agli autosomi. 24

Con la scoperta del crossing over cominciò ad essere chiaro non solo che i geni sono portati dai cromosomi, ma anche

che debbono essere localizzati in punti particolari o loci dei cromosomi. Inoltre, risultò anche evidente che gli alleli di

ogni gene debbono occupare loci corrispondenti su cromosomi omologhi, altrimenti lo scambio di parti di cromosomi

darebbe luogo a un caos genetico piuttosto che a uno scambio preciso di alleli. Via via che furono studiati altri caratteri,

fu chiaro che la percentuale di ricombinazione tra due geni qualunque, per esempio quelli per il colore del corpo e la

lunghezza delle ali, era differente dalla percentuale di ricombinazione tra altri due geni come quelli per il colore del

corpo e la lunghezza delle zampe. Inoltre, come gli esperimenti di Morgan avevano dimostrato, queste percentuali

erano fisse e prevedibili.

Fu A. H. Sturtevant, allora studente nel laboratorio di Morgan, a intuire che la percentuale di ricombinazione avesse

probabilmente qualcosa a che fare con la distanza fisica tra i loci genici, cioè con le loro distanze relative lungo i

cromosomi. Questo concetto aprì la via alla costruzione delle prime "mappe" cromosomiche.

I presupposti di Sturtevant erano che:

1) i geni fossero disposti sui cromosomi in una serie lineare;

2) geni vicini fossero separati da crossing over meno frequentemente di geni più lontani;

3) dovesse quindi essere possibile, determinando la frequenza di ricombinazione, tracciare la sequenza dei geni

lungo i cromosomi e conoscere la distanza relativa tra essi.

Nella figura per esempio si può notare

come in un crossing over, la probabilità

di una rottura e riunione di un

filamento con il suo omologo tra A e C

dovrebbe essere superiore alla

probabilità che lo stesso evento si

verifichi tra qualche punto tra C e D,

semplicemente perché la distanza tra A

e C è maggiore e vi sono perciò più

probabilità che avvenga il crossing

over.

Nel 1913 Sturtevant cominciò a costruire mappe cromosomiche usando i dati ottenuti dagli studi di crossing over nei

moscerini della frutta. Come unità di misura standard egli scelse arbitrariamente la distanza sulla mappa che avrebbe

dato, in media, una ricombinazione ogni 100 uova fecondate. Per esempio, due geni con una ricombinazione del 10%

sarebbero distanti 10 unità, quelli con l'8% di ricombinazione sarebbero distanti 8 unità.

Con questo metodo Sturtevant e altri genetisti hanno costruito mappe cromosomiche localizzando un certo numero

di geni e di mutanti in Drosophila. Sebbene il metodo di Sturtevant di mappatura dei cromosomi sia stato oggi

sostituito da tecniche molto più precise, questi studi sono stati di fondamentale importanza nella storia della genetica;

essi confermarono non solo che i geni sono localizzati sui cromosomi, come Sutton aveva ipotizzato, ma anche che

occupano posizioni fisse in sequenza lineare. Inoltre, i dati raccolti con questi lavori costituiscono un preciso "atlante"

dei cromosomi di Drosophila, un punto di riferimento preziosissimo per i moderni ricercatori.

Nel 1930, sono state costruite le prime mappe genetiche che identificavano le posizioni relative di molti geni sui

cromosomi. Le distanze tra i geni associati erano mappate tramite le frequenze di ricombinazione (crossing-over).

Questo ha permesso di comprendere che i cambiamenti strutturali del gene (mutazioni) sono responsabili di anomalie

fenotipiche. I cromosomi furono mappati prima dell’introduzione del sequenziamento, che poi ha confermato

l’accuratezza di queste mappe.

“Genetic screens”:

Per ottenere delle mappe genomiche si nutrono i maschi adulti con agenti mutageni e poi si accoppiano con femmine

normali. Successivamente si ricercano i mutanti e si effettua un controllo dei cromosomi e successivi incroci per capire

qual è il gene implicato nella mutazione. Questa è stata la dimostrazione che l’alterazione genica portava ad

un’alterazione del prodotto.

Esempi di mutazioni: ali rudimentali, ali incurvate, doppio segmento toracico, ali vestigiali, mutanti comportamentali,

mutanti che non apprendono, che non hanno memoria a breve o lungo termine, mutazioni della locomozione, ecc. 25

Per determinare la mappa fisica del genoma della Drosophila è risultata indispensabile una caratteristica peculiare di

4

questo organismo: i cromosomi politenici . Infatti, Bridges identificò 5000 bande sui quattro cromosomi giganti e

stabilì una correlazione tra bande e posizione dei loci genici (marcati attraverso la ricombinazione, cioè valutando la

percentuale dei ricombinanti).

Un secondo metodo per determinare la mappa fisica del genoma di Drosophila consiste nell’utilizzo dei cromosomi

balancer che contengono inversioni; in questo caso, l’inversione è messa in correlazione con la posizione.

I cromosomi balancer non ricombinano con il cromosoma omologo nativo, perciò è possibile mantenere moscerini che

contengono mutazioni recessive letali e studiare il prodotto del gene.

Il genoma della Drosophila contiene circa 14000 geni, con poca ridondanza.

Uno dei problemi dello studiare la base genetica delle malattie e delle funzioni nei mammiferi è che hanno una grande ridondanza

genica. Ad esempio, si possono avere topi knockout per un gene codificante per una proteina essenziale che sono praticamente

normali, mentre se la proteina viene bloccata con un farmaco nell’adulto l’effetto si vede (ciò è dovuto alla ridondanza: i geni

rimasti recuperano la funzione).

Nei “modelli semplici” come Drosofila e Zebrafish c’è poca ridondanza, quindi non ci sono geni che possono andare a

recuperare la funzione mancante. Per questo motivo sono i primi modelli utilizzati per lo studio della funzione del gene

e del prodotto nell’organismo prima di passare a modelli più complessi (come i mammiferi).

Jove: An introduction to Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster conosciuta anche come il moscerino della frutta, è un piccolo insetto che si trova comunemente sulla

frutta marcescente. Drosophila è ampiamente utilizzato come organismo modello per la ricerca scientifica e lo studio di questo

organismo ha fornito importanti informazioni sulla genetica eucariotica e sulle malattie umane.

Drosophila hanno tre principali segmenti corporei - testa, torace e addome – nonché una singola coppia di ali, e tre coppie di

gambe. Sono organismi lunghi tra i 2 e i 4 mm e pesano circa 1 mg. Le femmine sono in genere più grandi dei maschi. Moscerini

della frutta wild-type presentano grandi occhi rossi, e corpi gialli o marrone chiaro con strisce nere sull'addome. Il ciclo di vita di

Drosophila dura circa 2 settimane, ed è composto da 4 fasi principali: l'embrione, larva, pupa e adulto. La vita media di Drosophila

è tra 60-80 giorni, tuttavia la durata può essere influenzata da fattori quali la temperatura o il sovraffollamento. I moscerini della

frutta sono presenti in tutti i continenti tranne in Antartide. Più spesso si trovano nei climi tropicali, ma possono adattarsi a climi

più freddi spostandosi al chiuso.

Drosophila può sopravvivere in un intervallo di temperature compreso tra i 12 e i 35 ° C. Nel laboratorio, sono mantenute in

incubatori con temperatura fissa a 25 ° C e 60% di umidità, condizioni ideali per la sopravvivenza e la fertilità. La tipica dieta per

Drosophila sono i microrganismi, come il lievito, presenti su frutta e verdura molto mature e marciume. Tuttavia, in laboratorio

viene utilizzato un composto contenente farina di mais, melassa, agar, zucchero, lievito e acqua.

Questo organismo presenta diverse caratteristiche tali da renderlo tra i più utilizzati come modello sperimentale. In primo luogo,

le piccole dimensioni della mosca li rendono facili sia da maneggiare che da anestetizzare. Inoltre necessitano di attrezzature poco

costose per la loro crescita e mantenimento in laboratorio. Grazie al loro ciclo vitale breve, sono necessarie circa 2 settimane dal

momento in cui avviene l'accoppiamento per generare nuova prole adulta. Le femmine sono estremamente fertili e possono

deporre centinaia di uova al giorno. Pertanto, gli esperimenti con le mosche possono essere condotti in modo rapido e con un

numero molto elevato di campioni.

Drosophila è un organismo facile da studiare, perché dal punto di vista genetico sono semplici in confronto ai mammiferi. Il

genoma di Drosophila comprende solo quattro cromosomi con circa 14.000 geni. Le mosche hanno una limitata ridondanza

genetica. Per ridondanza genetica si intende che più di un gene è responsabile di una certa funzione biologica. Ad esempio, i topi

possono avere tre copie di un gene che causa un particolare fenotipo. Quando un gene è mutato, gli altri possono compensare la

funzione di questo gene in modo tale da non portare a nessun cambiamento evolutivo o fisiologico osservabile. Ciò significa che

un esperimento di mutagenesi nei topi fornisce meno informazioni; al contrario nelle mosche, data la poca ridondanza e quindi

un'unica versione del gene, è possibile ottenere informazioni sulla funzione del gene poiché se questo mutato provoca variazioni

nel fenotipo.

Inoltre, sono stati sviluppati vari metodi per indurre mutazioni genetiche, compresi i raggi X, o irraggiamento UV, e ricombinazione

omologa.

Le mosche sono un ottimo modello di organismo grazie alle loro sorprendenti somiglianze genetiche con gli esseri umani e gli altri

mammiferi. Circa il 50% dei geni dei moscerini sono omologhi ai geni dei mammiferi, il che significa il gene ha origine da un

antenato comune. Inoltre, il 75% dei geni umani correlati a patologia hanno ortologhi, o geni con funzioni simili, nel moscerino.

Su Drosophila sono state effettuati numerosi studi e esperimenti che hanno condotto ad importanti scoperte.

4 Cromosomi politenici: Endoreplicazione in assenza di mitosi genera cromosomi ingranditi in alcuni tessuti 26

Nel 20esimo secolo, il moscerino fu utilizzato per primo come organismo modello nel laboratorio di Thomas Hunt Morgan. Nel

1910, Morgan scoprì una mosca con carattere “occhi bianchi” tra una collezione di mosche dagli occhi rossi. Utilizzando la

microscopia, osservò delle bande di cromosomi, e vide che queste erano presenti anche nelle mosche dagli occhi bianchi.

Con questi esperimenti confermò la teoria cromosomica dell'ereditarietà per il quale ha vinto il premio Nobel nel 1933.

Nel 1927, uno degli studenti di Thomas Hunt Morgan, Hermann Muller, scoprì che i raggi X possono indurre mutazioni genetiche.

Muller ha vinto il premio Nobel nel 1946 per la sua scoperta.

Durante gli anni '70 e '80, Ed Lewis, Christiane Nusslein-Volhard, e Eric Wieschaus effettuarono diversi screen genetici per

identificare un certo numero di geni essenziali durante lo sviluppo. Essi hanno identificato alcuni dei geni che stabiliscono gli assi

dorso-ventrale e antero-posteriore dell'embrione, nonché i geni coinvolti nella segmentazione, che specificano il piano del corpo.

Hanno vinto il premio Nobel nel 1995.

Nel 1990, Jules Hoffmann utilizzò Drosophila per la ricerca sull'immunità innata, la prima linea di difesa contro gli agenti patogeni,

come i batteri. Scoprì i recettori Toll e ha dimostrato la loro importanza nel rilevamento e la difesa contro gli agenti patogeni.

Emociti embrionali sono cellule in grado di riconoscere e rispondere ai patogeni nell'embrione di Drosophila. Hoffman ha vinto il

premio Nobel nel 2011 per il suo lavoro sull’immunità innata su Drosophila, e condiviso il premio con Bruce Beutler e Ralph

Steinman per il loro lavoro sull'immunità innata nei mammiferi.

Lavori su Drosophila hanno molte applicazioni importanti, che vanno dalla genetica alla patologia umana.

Ad esempio, l'identificazione e la caratterizzazione dei geni che regolano lo sviluppo in Drosophila è stata molto importante per la

comprensione della genetica umana.

Il gene Drosophila "senza occhi" è essenziale per lo sviluppo della mosca. I geni omologhi nei mammiferi “senza occhi” hanno

molte somiglianze funzionali, in tal modo che la comprensione dello sviluppo dell'occhio in Drosophila potrebbe avere importanti

implicazioni nella comprensione dello sviluppo dell'occhio umano e delle patologie.

Attualmente sono svolte numerose ricerche su Drosophila per la comprensione delle malattie neurologiche umane. Ad esempio,

l'espressione di un gene umano coinvolto nella malattia di Parkinson nella mosca, porta ad una perdita di neuroni nel tempo e un

accumulo di aggregati proteici che si conclude con una diminuzione della capacità locomotoria.

La ricerca in tempo reale ha portato inoltre ad importanti conoscenze dello sviluppo e della funzione del cuore umano. Molti geni

associati alla funzione cardiaca sono conservati (mosche e uomo), o simili agli esseri umani.

Drosophila melanogaster: informazioni posizionali durante lo sviluppo

Ogni cellula del corpo diviene un certo tipo cellulare sulla base della sua posizione relativa.

Ogni cellula riceve informazioni posizionali che le indicano dove andare e cosa diventare: può rispondere con divisione,

migrazione, differenziazione o morte (apoptosi). La posizione/organizzazione spaziale è indispensabile nello sviluppo

Ci sono due meccanismi principali per comunicare le informazioni di posizione:

- Morfogeni (sostanze morfogeniche)

- Adesione cellulare (comunicazione intercellulare)

In Drosophila melanogaster sono stati identificati i geni coinvolti nello sviluppo e sono divisi in diverse categorie: ad

esempio i geni materni riguardano le prime fasi dello sviluppo mentre i geni dello zigote riguardano la segmentalità i

geni gap suddividono l’embrione e una loro mutazione causa un gap nella segmentazione del moscerino; i geni “pair

rule” stabiliscono delle paia di segmenti; i geni per la polarità stabiliscono l’asse antero-posteriore di ogni segmento.

Nella drosophila, ma anche in tutti i vertebrati, esistono quattro fasi generali per la formazione del corpo:

- Organizzare il corpo lungo 4 assi (geni OMEOTICI - Hox)

- Organizzare piccole regioni

- Organizzare per produrre parti del corpo

- Cambiamento morfologico e differenziazione delle cellule bisogna sempre tenere a mente che tutte le cellule hanno

lo stesso genoma.

Il differenziamento è un processo dovuto alla regolazione differenziale dell’espressione genica ossia certi geni sono

espressi in specifiche fasi dello sviluppo in un particolare tipo di cellula.

Jove: Drosophila Development and Reproduction (da fare)

Drosophila melanogaster è ampiamente utilizzato come organismo modello nello studio dello sviluppo e della

riproduzione. Infatti l’organismo nel suo ciclo vitale si sviluppa in diverse fasi e ciò fornisce una piattaforma unica per

la ricerca evolutiva processo noto come il ciclo di vita e di ogni fase fornisce una piattaforma unica per la ricerca

evolutiva.

Il ciclo di vitale della Drosophila si distingue in 4 fasi principali di sviluppo: embrione, larva, pupa e adulto.

L'embrione è un uovo fecondato, di circa 0,5 mm e di forma ovale. Subito dopo la fecondazione, l'embrione subisce

una rapida divisione mitotica senza crescita. 27

Il nucleo dello zigote subisce nove cicli di divisione nucleare, ma non subisce citochinesi, formando una cella multi-

nucleata chiamata blastoderma sinciziale. Poiché tutti i nuclei del blastoderma sinciziale condividono un citoplasma

comune, le proteine possono diffondere liberamente, formando gradienti morfogenici, che sono importanti per

stabilire il programma di sviluppo del corpo e dei singoli organi e tessuti del moscerino.

Dopo la divisione nucleare, i 10 nuclei migrano verso la periferia del blastoderma sinciziale. Successivamente alla 13°

divisione nucleare, che si verifica circa 3 ore dopo la fecondazione, 6000 nuclei del blastoderma sinciziale diventano

individualizzati formando il blastoderma cellulare. Questo, contiene un monostrato di cellule e si trasforma in una

struttura multistrato complessa, in un processo noto come gastrulazione.

Durante la gastrulazione, avvengono dei cambiamenti di forma cellulare e delle invaginazioni del monostrato, fino a

creare l'endoderma, mesoderma ed ectoderma.

L'endoderma produce l'intestino, il mesoderma dà origine ai muscoli e il cuore, e l'ectoderma dà origine a l'epidermide

ed il sistema nervoso centrale.

Dopo 24 ore, gli embrioni si schiudono come larve. Queste, sono di colore bianco con corpi segmentati vermiformi.

Essi si muovono strisciandosi alla ricerca di cibo umido costantemente, portando ad una rapida crescita. il progresso

delle larve avviene attraverso tre fasi: il primo stadio per 24 ore, secondo stadio per altre 24 ore, e terzo stadio per 48

ore. Tra ogni stadio avviene una trasformazione.

Quando è pronto per la pupazione, il terzo stadio lascia la fonte di cibo per legarsi ad una superficie stabile, come ad

esempio il lato di una provetta. In questo stadio sono immobili, hanno un corpo inizialmente morbido e bianco che

man mano si indurisce e vira verso il marrone. Nell’arco di 4 giorni i tessuti larvali degenerano per formare i tessuti

dell’adulto. La schiusa segna la fine della fase della pupa e l’inizio della fase adulta. 8 ore dopo la schiusa, gli adulti

diventano sessualmente attivi e cominciano ad accoppiarsi dando vita ad un nuovo ciclo vitale.

Il ciclo di vita completo dura circa 10 giorni a 25 ° C, ma può essere influenzata dalla temperatura. Ad esempio, a 18 °

C il ciclo di vita è di circa 19 giorni e a 29 ° C solo 7 giorni.

Durante lo sviluppo, un'attenta regolazione genetica stabilisce la formazione del corpo e dei singoli tessuti e organi.

È importante sottolineare che la creazione dell'asse antero-posteriore definisce l’orientamento della testa e della coda

dell'organismo, ed è regolata da diversi gruppi di geni.

In primo luogo i geni ad effetto materno derivano dall’ovocita e sono ereditati dalla femmina. Sono imposrtanti nel

blastoderma sinciziale perché nelle prime fasi stabiliscono la porzione anterioere e posteriore dell’embrione. In

particolare il gene bicoid definisce la parte anteriore dell’embrione compresa testa e torace mentre il gene nanos

definisce la parte posteriore compresa l’addome.

In secondo luogo, i geni di segmentazione, che sono regolati da geni ad effetto materno, includono i geni gap e geni

pair-rule. I geni Gap stabiliscono il piano segmentato del corpo lungo l’asse antero-posteriore suddividendo

l’embrione. I geni pair-rule sono espressi in un motivo a righe perpendicolare all’asse antero-posteriore che divide

ulteriormente l’embrione in segmenti più piccoli. In seguito, i geni di polarità del segmento sono in grado di stabilire il

destino delle cellule all’interno di ciascun segmento. Infine i geni omeotici sono responsabili della definizione di

particolari strutture anatomiche, come ali e gambe.

È interessante notare che l’ordine dei geni presenti sul cromosoma, riflette il modo in cui essi sono espressi lungo

l’asse antero-posteriore.

Drosophila sono organismi estremamente fertili in grado di produrre migliaia di progenie. Le femmine depongono

centinaia di uova al giorno, anche dopo l’accoppiamento. Sono organismi che presentano un dimorfismo sessuale ossia

che la femmina è fenotipicamente distinta dal maschio. In particolare i maschi sono più piccoli rispetto alle femmine

e presentano un colore più scuro dei genitali esterni così come un pigmento più scuro sui loro addomi inferiori.

I maschi presentano anche una serie di setole sulle loro zampe anteriori utilizzati per agganciare la femmina durante

l’accoppiamento. Queste differenze fenotipiche rendono molto facile la distinzione tra i maschi e le femmine, e ciò è

molto utile negli studi genetici.

Un altro strumento comunemente usato nella ricerca su Drosophila è il sistema UAS-GAL4 che permette ai ricercatori

di esprimere o silenziare (Knock-out) un gene in un tessuto specifico. GAL4 è un fattore di trascrizione del lievito che

è attivato da un promotore specifico del tessuto e UAS è la sequenza Upstream di attivazione che controlla

l’espressione del gene di interesse. 28

Drosophila melanogaster: i geni omeotici

Una delle più grandi scoperte che riguarda la Drosophila è l’identificazione dei geni omeotici (Homeobox) che

controllano e regolano il programma che determina il differenziamento esclusivo di ciascun segmento; i geni omeotici

interagiscono in schemi intrecciati in modo complicato. L’ identità (e lo sviluppo) di particolari segmenti è determinata

da questi geni specifici.

Molti di essi codificano per fattori di trascrizione che agiscono su altri geni omeotici oltre, che su altri loci bersagli e

come risultato, una mutazione in un gene omeotico l’influenza l’espressione di altri geni omeotici. La conseguenza è

che l’aspetto finale di un mutante dipende non soltanto dalla perdita della funzione di un gene omeotico, ma anche

dal modo in cui altri geni omeotici cambiano il loro schema spaziale in risposta alla sua perdita. Le mutazioni omeotiche

“trasformano” parte di un segmento o di un intero segmento in un altro tipo di segmento e possono, ad esempio,

provocare lo sviluppo di un segmento dell’addome come un altro segmento, far sviluppare zampe al posto di antenne

o ali al posto di occhi.

Tali geni non creano schemi de novo, ma modificano destini cellulari che sono determinati da geni come quelli della

polarità segmentale, scambiando la serie di geni che funziona in una posizione particolare.

Il Bithorax e l’Antennapedia sono mutanti antichi, trovati nel 1915 nel laboratorio di Morgan.

Nel 1983 sono stati isolati due cluster di geni sul cromosoma 3:

 Bithorax complex (ANT-C)3 geni che determinano la parte terminale posteriore. Normalmente ci sono ali sul

secondo segmento toracico e due altere sul terzo; nel mutante anche il terzo segmento ha le ali e non presenta

altere.

 Antennapedia complex (BX-C) 5 geni che determinano la parte anteriore; quando mutati, crescono zampe

invece di antenne.

Due loci complessi sono coinvolti nella regolazione dello sviluppo del corpo dell’insetto adulto. I loci complessi ANT-C

e BX-C forniscono nel loro insieme un continuum di funzioni che specificano le identità di tutte le unità segmentate

della mosca; ognuno di esse contiene parecchi geni omeotici.

Il complesso bithorax è caratterizzato da parecchi gruppi di mutazioni omeotiche che colpiscono lo sviluppo del torace,

e che provocano cambiamenti morfologici importanti nell’addome.

Quando è deleto l’intero complesso, l’insetto muore durante lo sviluppo embrionale tardivo, ma esistono

mutazioni all’interno del complesso che non sono letali, ma cambiano il fenotipo di certi segmenti. Un caso

estremo di trasformazione omeotica porta alla creazione di una mosca con un doppio torace e quindi con 4 ali.

Un caso estremo di trasformazione omeotica del complesso antennapedia è la creazione di una mosca che ha le zampe

al posto delle antenne.

La Drosophila ha 8 geni omeotici.

Tutti hanno un’architettura simile, costituita da un segmento breve di 180 basi simili in sequenza, chiamata Homeobox.

Le sequenze Homeobox sono quelle che regolano l’attività del gene e si trovano anche in altri geni non omeotici ma

altamente regolati (bicoidi).

Nei fattori di trascrizione regolatori esistono due domini: uno in cui la proteina si lega al DNA (homeodomain) e uno

per una piccola molecola effettrice (es. zinc finger).

I geni omeotici codificano per proteine omeotiche che hanno la funzione di fattori di trascrizione e quindi vanno a

modificare l’attività di altri geni.

Attivano la trascrizione di geni specifici che promuovono modificazioni dello sviluppo.

La sequenza homeobox codifica per omeodomini prl per DNA binding.

I geni omeotici, dopo la loro scoperta in Drosophila, sono stati ritrovati in tutti gli animali; infatti, in tutti gli animali

esiste un gruppo omologo di geni omeotici.

I geni Hox dei vertebrati sono omologhi a quelli che controllano lo sviluppo in organismi più semplici, come la

Drosophila (ce n’è anche uno nelle spugne).

I geni omologhi sono derivati evolutivamente dallo stesso gene ancestrale e hanno sequenze simili di DNA. Più si

avanza come complessità strutturale e più copie dei geni Hox sono presenti.

Nel topo seguono la regola di colinearità e hanno un ruolo chiave nel pattern dell’asse anteroposteriore.

In generale, in tutti i vertebrati sono fondamentali per determinare la polarità anteroposteriore e la segmentazione

della colonna vertebrale.

I moscerini hanno solo un complesso antennapedia e uno bithorax, che sono colineari sullo stesso cromosoma. 29


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DESCRIZIONE APPUNTO

Appunti integrati con articoli "JoVE | Peer Reviewed Scientific Video Journal - Methods and Protocols" dei principali modelli sperimentali.
Programma:
I. Introduzione ai modelli animali. Premesse e puntualizzazioni: la teoria dell’evoluzione, classificazione e filogenesi, il metodo scientifico. La scelta del modello e il protocollo di ricerca. Strategie per l'ideazione, stesura e valutazione critica di un quesito scientifico.
2. Specie animali utilizzate nella ricerca biomedica. Panoramica dei principali modelli animali: Invertebrati (C. elegans; D. melanogaster; Aplysia). Vertebrati (zebrafish, il pulcino, roditori, primati) – caratteristiche del modello e traslazionalità del dato.
3.Le specie di laboratorio: anatomia, fisiologia, etologia. procedure sperimentali. Linee guida comunitarie sull'uso degli animali nella ricerca, Legislazione e le 3 R.. Il benessere degli animali di laboratorio. Linee outbred, Ceppi inbred e ceppi geneticamente modificati.
4. “Case studies”: Analisi di alcuni modelli animali di funzionalità e di patologia (differenziazione sessuale; psicopatologie e dipendenze; disordini metabolici; patologia cardiovascolare; neuroscienze cognitive).


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in biotecnologie mediche, veterinarie e farmaceutiche (Facoltà di Farmacia, di Medicina e Chirurgia e di Medicina Veterinaria)
SSD:
Università: Parma - Unipr
A.A.: 2017-2018

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Prior92Pierl di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Modelli sperimentali e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Parma - Unipr o del prof Palanza Paola.

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