Modelli Sperimentali

2. SCELTA DI UN MODELLO

La scelta di un modello richiede quindi una pianificazione meticolosa.

È necessario definire:

 il problema di base,

 il substrato, ossia il tipo di cellule, tessuti, organi da studiare,

 la specie o il ceppo opportuno,

 i fattori decisivi, quali la disponibilità, l’adattamento, l’“animal care”, la strumentazione, la bibliografia, la perizia tecnica,

il costo, la valutazione

• dei metodi alternativi; operare quindi considerazioni scientifiche, pratiche ed etiche.

Nella scelta di un modello animale è importante valutare il substrato di base (cellule, tessuto, organo,…), l’interazione

fra organi e sistemi, l’utilizzo di un modello sano o malato, in accrescimento, adulto o vecchio e se maschio o femmina

(o entrambi). I problemi scientifici fondamentali sono risolti nel sistema più semplice e più

accessibile in cui può essere esaminato il problema. Questi organismi sono

definiti ORGANISMI MODELLO.

Caratteristiche degli Organismi Modello

La disponibilità di strumenti tecnici per le analisi

Una massa critica di ricercatori che studiano quel modello (idee, metodi,

strumenti e ceppi possono essere condivisi e confrontati).

COME scegliere un organismo modello?

Dipende da quale domanda sperimentale viene posta.

Quando si studiano fenomeni fondamentali della biologia molecolare è

conveniente utilizzare gli organismi più semplici, unicellulari o lieviti,

Domande sullo sviluppo o sulla neurobiologia o su patogenesi complesse

richiedono organismi più complessi- piante, animali.

I modelli animali sono scelti in base alla somiglianza in caratteristiche

biochimiche e di sviluppo

• Fisiologia/comportamento: conigli, cani, scimmie, uccelli, ratti, topi.

• Sviluppo: topi, rane, galline-pulcini, pesci, ricci di mare, drosophila,

nematode (C. elegans)

• Genetica: topi, ratti, zebrafish, Drosophila, nematode, lievito, batteri. 13

Scelta di un modello animale

PRIMA di tutto il PI –principal investigator – deve aver considerato le alternative all’uso di animali vivi nel suo

esperimento, come previsto dalla normativa europea.

La scelta più ovvia di specie e modello animale per una specifica ricerca può basarsi sulla letteratura scientifica:

utilizzare lo stesso modello utilizzato dagli altri ricercatori per la stessa ricerca.

La ricerca però progredisce velocemente, in particolare per quanto riguarda modelli animali geneticamente modificati

e quindi è opportuno considerare attentamente le alternative.

Vi possono essere differenti tipi di modelli animali:

 Modelli animali SPONTANEI, sono quelli che manifestano malattie o funzionalità di base che si verificano

spontaneamente nell’animale e corrispondono alle stesse malattie o condizioni nell’uomo (es. mutazioni

genetiche spontanee).

 Modelli animali INDOTTI: lo sperimentatore induce in qualche modo la patologia o distruggendo un organo (es.

pancreas → diabete) oppure utilizzando animali geneticamente modificati (adesso pratica sperimentale indotta

più utilizzata).

 Modelli animali TRANSGENICI: ingegneria genetica e tecnologia di manipolazione embrionale (topi, ma anche

pesci).

 Modelli animali NEGATIVI: refrattarietà a certe malattie e quindi cerco di capire perché quell'animale non sviluppa

quell'infezione, quella patologia, quel tipo di cancro.

 Modelli ORFANI, condizioni naturali che non hanno corrispettivo umano (storicamente: scrapie nelle pecore, ora

diventata modello per encefalopatia spongiforme umana).

Modelli animali SPONTANEI

Sono modelli in cui l’animale acquisisce spontaneamente (mutazione spontanea) una malattia che somiglia a una

malattia umana (oppure mostra una funzionalità d’organo e sistema simile). Sono modelli spontanei NATURALI, ossia

presenti in natura che sono esempi di funzionalità d’organo e sistema simile all’uomo.

•Cani Doberman Pincher: presentano una conformazione vascolare a livello cerebrale che li porta a sviluppare il

morbo di von Willebrand

• Topi NZW x NZB F1: sono ceppi inbred (inincrociati) in cui si sviluppano spontaneamente malattie autoimmuni (lupus

eritematoso e artrite reumatoide)

• Criceto, topo, cani Golden retriever: sono ottimi modelli per la distrofia muscolare.

• Ceppi di topi e ratti (es. ratti BB e topi NOD) presentano vulnerabilità al diabete, legato ad una malattia autoimmune

con formazione di autoanticorpi nei confronti delle cellule di Langherans.

• Gerbilli: sono animali fossori che vivono in ambienti molto poveri e difficili. Sono indicati nello studio dell’epilessia

poiché presentano un circuito del corpo calloso con una particolare conformazione. ob

Un esempio di mutazione spontanea è quella che avviene a livello del gene strutturale per la LEPTINA (Lep ). Questa

mutazione è stata trovata in un ceppo di topi del “Jackson Lab” che presentavano un enorme aumento di peso. Infatti

la mutazione a livello di questo gene induce una malattia dovuta al difetto di leptina o al suo recettore: la leptina

infatti è un segnale che viene inviato al cervello per bloccare il comportamento alimentare (segnale di “sazietà”).

Sappiamo che nel topo il sistema dell’alimentazione è super regolato ossia si regola in base alle quantità di grasso da

assumere indipendentemente dalla quantità di cibo. Una mutazione del gene della leptina produrrà quindi un topo

super grasso con una predisposizione al diabete.

Trasferendo questo gene in un altro ceppo (C57ABL6) produrrà diabete. Di natura non porta ad una forma severa di

diabete.

Un altro esempio di mutazione è la mutazione al recettore della leptina; questa, è stata trovata spontaneamente in

questo ceppo inbred e produce obesità accompagnata da diabete molto pronunciato.

Modelli animali INDOTTI

Sono modelli in cui la condizione sperimentalmente indotta somiglia ad una condizione presente nella specie umana.

• Ratti in cui viene indotto il diabete con trattamento con streptozootocina (agente tossico per le cellule pancreatiche)

• Primati in cui viene indotto un simil-parkinson tramite somministrazione di MPTP (1-metl-4-fenil-1,2,3,6-

tetraidropiridina)

• Topi-ratti in cui viene indotta una condizione ansiosio-depressiva tramite Stress sociale cronico

• Topi geneticamente modificati. 14

Modelli animali TRANSGENICI

Sono modelli in cui viene indotta un’alterazione del genoma tramite tecniche di manipolazione del DNA (modelli

utilizzati: topi, zebrafish e ratti). I modelli animali transgenici possono essere:

 Transgenico (classico): organismo che porta un gene “estraneo” che è stato deliberatamente inserito nel suo

genoma (gain of function).

 Knock-out: sostituzione di un segmento di gene per ricombinazione omologa che normalmente porta ad un allele

non funzionale o nullo.

 Knock-in: simile a Knock out, ma allele mutante non funzionante o parzialmente funzionante.

Questi modelli possono aiutare a capire le basi genetiche della vulnerabilità individuale alle malattie, suscettibilità e

resistenza.

Un esempio di modelli transgenici sono i ceppi murini per il Morbo di Huntington in cui avviene l’inserzione dell’esone

1 del gene HD (R6/1, R6/2, R6/5 etc.).

Animali transgenici: DNA artificiale all'interno del loro genoma

Tipo Sito integrazione Fenotipo / Funzione

Transgenico classico random - guadagno di funzione dipendente dal transgene

- perdita di funzione nel caso il sito di integrazione è

un gene

- particolare fenotipo che può essere rilevato

esclusivamente nello stato omozigote

Knock-out integrazione mirata nel gene Perdita di funzione del gene "Knocked-out"

da non esprimere

Knock-out tessuto specifico Knock out ad un tempo specifico di sviluppo o in uno

specifico tessuto

Knock-in target / random Totale o parziale guadagno di funzione

Modelli animali NEGATIVI

Sono modelli che sono resistenti ad una particolare malattia. Sono utilizzati per capire i meccanismi di immunità.

• Opossum resistenti alla rabbia

• Macachi Rhesus resistenti all’epatite B

• Wood rat immune al morso di serpente

• Squali resistenti al cancro

• Gerbilli resistenti alle radiazioni

Un esempio è la resistenza dei topi alla schistosomiasi, una patologia molto rilevante in Africa che interessa l’uomo (trasmissione

nei corsi d’acqua)

Modelli animali ORFANI

Sono modelli in cui si sviluppano malattie animali che non hanno corrispettivo nell’uomo. Un esempio è il virus visna

nelle pecore.

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Fattori da considerare nella scelta di un modello

Nella scelta di un modello animale vi sono da considerare diversi fattori tutti importanti per il successo del programma

di ricerca:

 Appropriatezza del modello per lo studio in questione.

 Aspetti genetici del modello

 Modelli naturali vs. modelli prodotti sperimentalmente– es. Modelli di patologie spontanee o indotte.

 Risposte dell’animale alle procedure

 Aspetti ambientali importanti per quel modello animale

 Information di base disponibile sull’animale e lo specifico modello sperimentale utilizzato.

 Disponibilità della specie (allevamenti tecnico-scientifici, commerciali, prelievo da ambiente naturale…)

 Numero di animali necessario in relazione al disegno sperimentale e all’analisi statistica

 Distribuzione in classi di età e sesso

 Ciclo vitale e durata di vita del modello animale 15

 Dimensione corporea del modello animale

 Costi sia del modello animale che del mantenimento e gli interventi durante l’esperimento.

 Strutture (“Facilities”) necessarie per allevare in modo appropriato gli animali.

 Alcuni modelli animali richiedono sia strutture particolari di allevamento che cure particolari.

Nella scelta della specie/ceppo oltre alla presenza del substrato è importante valutare: disponibilità, adattamento,

docilità, strumentazione, animal care e valutazione etica del modello.

VALIDITÀ DEI MODELLI ANIMALI PER PATOLOGIE O FUNZIONI UMANE

• FACE VALIDITY (validità di forma): somiglianza fenotipica tra risposte fisiologiche o comportamentali negli animali e

nell’uomo. Per validità di forma si intende il grado di analogia, nel caso di patologie ossia quanto i sintomi osservati

nel modello animale somiglino a quelli del paziente.

• PREDICTIVE VALIDITY (validità predittiva): quanto il modello risponda alle stesse manipolazioni terapeutiche

utilizzate in clinica. In pratica riguarda la sensibilità del modello animale a farmaci di provata efficacia ma non ad altri

agenti. Indica, cioè, quanto la risposta al trattamento con u