Modelli animali e Patologia murina, Tecnologie per terapia genica e cellulare

10. MODELLI ANIMALI IN TERAPIA GENICA

I modelli animali usati in terapia genica sono:

 I modelli spontanei utilizzati per molti anni, si notavano infatti mutazioni identificate in zoo e stabu-

lari in animali che mostravano problemi che somigliavano a patologie umane

 I modelli indotti per mutagenesi con

o Mutazioni indotte tramite radiazioni

o Mutagenesi chimica (ENU etilnitrossiurea che porta mutazioni puntiformi somministrata attra-

verso l’acqua)

o Trasposoni (soprattutto in D. melanogaster

 Mutagenesi diretta (metodo preferito negli ultimi 30 anni)

o Uso di animali transgenici e KO

I sistemi sperimentali hanno tutti caratteristiche che possono essere usati nello studio di fenomeni pa-

tologici umani. Ad esempio il lievito di birra (S. Cervisiae) si può usare per studiare la divisione cellulare,

il ciclo cellulare e le mutazioni presenti nei tumori; C. elegans e D. melanogaster hanno neuroni simili

all’uomo e sono sistemi usati per studiare le malattie da espansione di triplette; Zebrafish è usato per lo

sviluppo dell’osso, molti geni sono simili all’uomo; Xenopus si studia per l’ovocita.

studio dello

Il modello animale più usato in assoluto è il topo. Si possono avere infatti:

 ’50)

Mutanti spontanei (ad esempio son stati analizzati gli effetti delle radiazioni negli anni

 Possono essere usati per mutagenesi tramite esperimenti di mutagenesi con ENU e ottenendo KO

tramite retrovirus o retrotrasposoni

 all’espressione di proteine tossiche

Possono esserci topi transgenici grazie

 Mutanti KO tramite ricombinazione omologa.

Il topo ha infatti una genetica ben conosciuta, il suo genoma è stato infatti completato già da molti anni. Ne

esistono diversi ceppi ottenuti tramite inbreed (ossia tramite accoppiamenti madre-figlio / figlio-madre o

tra fratelli) e quindi hanno una predisposizione per diverse patologie (un esempio è il C57BL6 che ha pre-

disposizione per l’aterosclerosi). La manipolazione delle ES (embrionali staminali è ormai standardizzata) e

le metodologie per l’analisi del fenotipo sono estremamente sofisticate non si controllano quindi solo i fenotipi

macroscopici ma si studia anche il comportamento e le caratteristiche parallele osservate in patologie umane

come l’autismo, la schizofrenia. Inoltre viene studiata la biochimica clinica del topo attraverso tecniche di

imaging come TAC, PET e RMN. Il tempo di riproduzione dei topi è relativamente breve. Essendo un mam-

geneticamente simile all’uomo.

mifero è

Non è sufficiente stabilire una nuova mutazione, bisogna creare un nuovo ceppo dove la mutazione sia stabil-

mente inserita e trasmessa alla progenie. La mutazione somatica deve diventare quindi un tratto mendeliano.

Gli animali modificati geneticamente possono essere ottenuti:

 direttamente nel genoma dell’ovocita fertilizzato

Inserendo sequenze di DNA esogeno

 Inserendo sequenze di DNA esogeno per ricombinazione omologa nel genoma di cellule embrionali

Sono utilizzati anche topi transgenici e vengono utilizzati transgeni con promotore tessuto-specifico per simu-

lare epatite o carcinoma epatico. Per il KO l’integrazione è fatta mediante ricombinazione omologa, non in

maniera casuale.

Lo sviluppo embrionale utilizza geni omologhi ai geni utilizzati nell’uomo. L’ablazione di un gene può pro-

vocare una patologia simile a quella provocata dalla mutazione del gene ortologo (uguale ma in un organismo

differente) nell’uomo. La risposta e la tossicità in seguito a terapia sono predittive della reazione che si osser-

verà nell’uomo.

Le cellule ES (Embrionic Stem cells) sono cellule pluripotenti derivati dall’inner mass della blastocisti.

Queste cellule sono capaci di differenziare in differenti tipi cellulari e di contribuire alla linea germinale.

Vengono quindi modificate affinché ci siano fenomeni di ricombinazione omologa e le cellule positive per

questo evento (riconosciute tramite marcatori) vengono iniettate nella blastocisti del topo recipiente e parteci-

peranno allo sviluppo dell’embrione. Il topo che si sviluppa è un topo chimerico: i tessuti derivano dal topo

recipiente e dalle cellule ES iniettate. La mutazione del topo chimerico verrà quindi trasmessa alla sua proge-

nie.

Alcuni modelli di malattie genetiche sono: fibrosi cistica, sindrome di Di George, acondroplasia, atassia spino-

cerebellare.

Altri modelli murini sono: diabete dell’adulto non dipendente da insulina (ottenuto con inattivazione parziale

di due geni), aterosclerosi (ottenuta con topo transgenico per Apo B e inattivazione di un gene), poliposi

familiare del colon (ottenuta con mutazione di un gene ed espressione di particolari alleli di un secondo gene).

COME OTTENERE UN TOPO KNOCK-OUT

 Il gene di interesse è inserito in cellule pluripotenti (ES) precedentemente prelevate e fatte crescere in

vitro

 Il gene, per omologia di sequenza, una volta entrato nel nucleo potrà essere sostituto a quello originario

attivo tramite ricombinazione omologa

 Si selezionano tramite marker di selezione le cellule la cui trasposizione è andata a buon fine

 Le cellule sono inserite nella blastocisti di una femmina di topo adulto e si fa sviluppare l’animale

Knock-Out.

11. ELEMENTI DI PATOLOGIA MURINA

l’analisi patogenica di malattie umane, per analisi dell’effetto dell’abla-

Si usano organismi modello per

o di gruppi di geni sullo sviluppo dell’animale, l’effetto

zione di un gene per analizzare di terapie innovative.

geneticamente simile all’uomo.

Il topo è stato scelto perché è un mammifero, quindi è Lo sviluppo embrio-

nale utilizza geni omologhi a quelli utilizzati difatti se viene sostituita la proteina murina con una di origine

umana lo sviluppo del topo avverrà comunque. L’ablazione di un gene può provocare una patologia simile a

quella provocata dalla mutazione del gene ortologo nell’uomo. La risposta e la tossicità in seguito a terapia

sono predittive (ma non identiche). La genetica del topo è ben conosciuta ed i ceppi son ben caratterizzati e la

stabulazione è poco costosa.

CEPPI INBREED

I ceppi inbreed sono il risultato di 20 generazioni di accoppiamenti fratello/sorella. Sono virtualmente

identici ad ogni topo dello stesso ceppo e sono classificati mediante una combinazione di lettere e numeri.

Alcuni ceppi sono ad esempio:

 BALB/c che sono topi albini usati per scopi immunologici. Le femmine di questo ceppo sono docili

mentre i maschi sono estremamente aggressivi e son pessimi breeders (fanno pochi cuccioli)

 C57BL/6 sono topi neri utilizzati per studi genetici. Sono molto resistenti, ottimi breeders e resistenti

alle radiazioni

Alcuni ceppi aumentano la predisposizione a determinati fenotipi patologici, i C57BL/6 ad esempio hanno

una stria lipidica aterosclerotica. in quanto c’è comunque

In genere non bisogna mai cambiare fornitore, presenza di sottoceppi. Di solito è

preferibile usare le femmine per i vari esperimenti in quanto sono meno aggressive e possono essere spostate

di gabbia, mentre invece i maschi son molto territoriali.

Dopo la generazione di un KO bisogna riportare in ceppo puro e per fare ciò sono necessarie 10 generazioni.

Si riporta in ceppo puro perché questo può avere la predisposizione per una certa malattia. Se si studia una

mutazione in ceppo puro saranno necessari meno animali in quanto ci sarà minore variabilità genetica in-

traindividuale (cosa che invece non accade negli outbreeds dove essendoci più variabilità intraindividuale

bisognerà utilizzare più animali).

Nomenclatura per ceppi transgenici

I ceppi sono identificati mediante una combinazioni di numeri e lettere. Se il ceppo è transgenico la nomen-

clatura cambia. Seguirà al nome del ceppo: metodo di inserzione, in parentesi il nome del gene, numero

della linea fondatrice, ed il codice del laboratorio.

Nomenclatura per ceppi KO

Seguono al nome del ceppo: il gene distrutto, il metodo, il numero della linea fondatrice ed il codice del

laboratorio.

COMPORTAMENTO GENERALE

I topi possono mordere. Tra i topi ci sono fenomeni di Barbering (o fenomeni di dominanza) per cui se in una

gabbia sono presenti 5 topi 1 sarà dominante, 1 sottomesso (si riconoscerà dalle chiazze di pelo mancanti) e 3

grosso perché l’accesso al cibo è

intermedi. Il topo dominante sarà più regolato da fenomeni sociali. In genere

devono avere sempre a disposizione cibo (tranne che negli studi di malattie metaboliche) in quanto si autore-

golano, sono essenzialmente animali notturni con ciclo sonno-veglia di 12 ore. Formano il nido con il cotone

e sono estremamente termosensibili.

RIPRODUZIONE ED ACCOPPIAMENTO

La performace riproduttiva è misurata tramite alcuni parametri:

 Incroci produttivi

 Inizio di fertilità

 Cucciolata

 Numero di cucciolate

 Fecondità relativa

ACCOPPIAMENTO E GRAVIDANZA

La maggior parte delle femmine sono fertili entro la 6-8 settimana di vita, entro la 5-6 settimana vengono

separati i maschi dalle femmine della cucciolata. Il ciclo mestruale compare ogni 4-6 giorni, ad esempio i

L’accoppiamento avviene tramite il

C57BL/6 si accoppiano ogni 4 giorni. metodo della rotazione, ossia si

dispongono in 4 gabbie diversi 4 topi maschi e 4 femmine vengono rotate nelle 4 gabbie ogni 4 giorni, in

questo modo se un maschio è sterile si ovvia al problema. Dopo che l’accoppiamento è avvenuto la femmina

viene posta da sola in una gabbia in quanto gli altri topi potrebbero mangiare i cuccioli. Nella prima cuccio-

lata gli inbreed mangiano i cuccioli.

L’accoppiamento di solito avviene di notte, la mattina è possibile identificare un plug che verifica l’avve-

nuto accoppiamento (è importante sapere il momento specifico per studi sugli embrioni in quanto devono

giorni dall’avvenuto accoppiamento è possibile pal-

essere sacrificati in un momento specifico), dopo 10-12

pare gli embrioni sulla pancia della madre. La gestazione dura all’incirca 18-22 giorni (dipende dal ceppo).

La presenza di un maschio estraneo porta la femmina incinta ad aborto spontaneo, se invece il maschio è dello

stesso ceppo non è riconosciuto come estraneo perché sono tutti identici. Se un maschio è presente nella gabbia

può mangiare tutti i cuccioli al momento della nascita.

PERIODO POST-NATALE

I topi nascono con occhi ed orecchie chiuse. I peli appaiono dopo 2 giorni, le orecchie si aprono a 3-5 giorni

mentre gli occhi a 14, possono mangiare cibi solidi dopo 16 giorni, ma vengono lasciati con la madre fino a

21 giorni e vengono separati da essa a 4 settimane in quanto se vengono separati prima diventano cattivi

breeders. Il