Modelli animali e Patologia murina, Tecnologie per terapia genica e cellulare

Modelli animali in terapia genica

I modelli animali usati in terapia genica sono:

• Modelli spontanei: utilizzati per molti anni, si notavano infatti mutazioni identificate in zoo e stabulari in animali che mostravano problemi che somigliavano a patologie umane.
• Modelli indotti per mutagenesi:
  • Mutazioni indotte tramite radiazioni
  • Mutagenesi chimica (ENU etilnitrossiurea che porta mutazioni puntiformi somministrata attraverso l’acqua)
  • Trasposoni (soprattutto in D. melanogaster)
• Mutagenesi diretta (metodo preferito negli ultimi 30 anni)
• Uso di animali transgenici e KO

I sistemi sperimentali hanno caratteristiche che possono essere usate nello studio di fenomeni patologici umani. Ad esempio, il lievito di birra (S. Cervisiae) si può usare per studiare la divisione cellulare, il ciclo cellulare e le mutazioni presenti nei tumori; C. elegans e D. melanogaster hanno neuroni simili all’uomo e sono usati per studiare le malattie da espansione di triplette; Zebrafish è usato per lo sviluppo dell’osso, molti geni sono simili all’uomo; Xenopus si studia per l’ovocita.

Il modello animale più usato in assoluto è il topo. Si possono avere infatti:

• Mutanti spontanei (ad esempio sono stati analizzati gli effetti delle radiazioni negli anni '50)
• Possono essere usati per mutagenesi tramite esperimenti di mutagenesi con ENU e ottenendo KO tramite retrovirus o retrotrasposoni
• Possono esserci topi transgenici grazie all'espressione di proteine tossiche
• Mutanti KO tramite ricombinazione omologa

Il topo ha una genetica ben conosciuta, il suo genoma è stato completato già da molti anni. Ne esistono diversi ceppi ottenuti tramite inbreeding (ossia tramite accoppiamenti madre-figlio / figlio-madre o tra fratelli) e quindi hanno una predisposizione per diverse patologie (un esempio è il C57BL6 che ha predisposizione per l’aterosclerosi). La manipolazione delle ES (embrionali staminali) è ormai standardizzata e le metodologie per l'analisi del fenotipo sono estremamente sofisticate. Non si controllano quindi solo i fenotipi macroscopici ma si studia anche il comportamento e le caratteristiche parallele osservate in patologie umane come l’autismo, la schizofrenia. Inoltre, viene studiata la biochimica clinica del topo attraverso tecniche di imaging come TAC, PET e RMN. Il tempo di riproduzione dei topi è relativamente breve. Essendo un mammifero, è geneticamente simile all’uomo.

Non è sufficiente stabilire una nuova mutazione; bisogna creare un nuovo ceppo dove la mutazione sia stabilmente inserita e trasmessa alla progenie. La mutazione somatica deve diventare quindi un tratto mendeliano.

Gli animali modificati geneticamente possono essere ottenuti:

• Inserendo sequenze di DNA esogeno direttamente nel genoma dell’ovocita fertilizzato
• Inserendo sequenze di DNA esogeno per ricombinazione omologa nel genoma di cellule embrionali

Sono utilizzati anche topi transgenici, e vengono utilizzati transgeni con promotore tessuto-specifico per simulare epatite o carcinoma epatico. Per il KO, l’integrazione è fatta mediante ricombinazione omologa, non in maniera casuale.

Lo sviluppo embrionale utilizza geni omologhi ai geni utilizzati nell’uomo. L’ablazione di un gene può provocare una patologia simile a quella provocata dalla mutazione del gene ortologo (uguale ma in un organismo differente) nell’uomo. La risposta e la tossicità in seguito a terapia sono predittive della reazione che si osserverà nell’uomo.

Le cellule ES (Embrionic Stem cells) sono cellule pluripotenti derivate dall’inner mass della blastocisti. Queste cellule sono capaci di differenziare in differenti tipi cellulari e di contribuire alla linea germinale. Vengono quindi modificate affinché ci siano fenomeni di ricombinazione omologa e le cellule positive per questo evento (riconosciute tramite marcatori) vengono iniettate nella blastocisti del topo recipiente e parteciperanno allo sviluppo dell’embrione. Il topo che si sviluppa è un topo chimerico: i tessuti derivano dal topo recipiente e dalle cellule ES iniettate. La mutazione del topo chimerico verrà quindi trasmessa alla sua progenie.