Riassunti Miglioramento genetico

MICROPROPAGAZIONE

La micropropagazione consiste nella moltiplicazione di piante su larga scala tramite la coltura di espianti, in condizioni di sterilità, usando substrati di composizione nota e usufruendo di opportune condizioni ambientali controllate (luce, temperatura, umidità). La micropropagazione può avvenire per: - propagazione per germogli ascellari. Questo metodo è quello più generalmente applicabile ed affidabile della propagazione in vitro. I materiali di partenza di tale metodo sono: Coltura di germogli: questa coltura è avviata da meristemi di germogli che sono moltiplicati grazie alla ripetuta formazione di rami ascellari. I germogli che si sono appena formati sono utilizzati come espianti oppure vengono fatti radicare. Gli espianti di partenza sono gli apici dei germogli laterali o principali che sono stati sezionati da gemme dormienti. Gli espianti di maggiori dimensioni rispetto a quelli piccoli hanno una migliore capacità di sopravvivenza.quando trasferiti in vitro; un avvio dell'acrescita più rapida; la presenza di più gemme ascellari. Però di contro più grande è l'espiante più difficile è sterilizzarlo. Coltura di nodi singoli o multipli l'espianto di partenza è un apice di germoglio, una gemma laterale o una porzione di germoglio che porta uno o più gemme. I germogli non ramificati sono fatti crescere fino alla formazione di diversi nodi separati. In fase di moltiplicazione si interviene per superare la dominanza apicale in modo tale da promuovere la schiusura delle gemme laterali. Le gemme ascellari germogliate sono fatte crescere, sezionate ed usate per nuove subcolture o fatte radicare per produrre plantule. Tale metodo è il più semplice perché richiede che avvenga solo l'accrescimento dei germogli. Entrambi i metodi dipendono dalla precoce stimolazione della crescita dei germogli ascellari, in modo tale da superare la dominanza apicale.Dominanza del meristema del germoglio apicale.

Fasi del ciclo della micropropagazione:

Fase 0: detta della selezione del materiale vegetale. In questa fase si deve scegliere con attenzione una o più piantine stock. Queste devono essere tipiche della varietà ed esenti da ogni sintomi di malattia. Per avere un buon materiale di partenza può essere vantaggioso trattare le piante scelte per ridurre il livello di contaminazione degli espianti, e tramite questi pre-trattamenti la crescita e la morfogenesi in vitro possono essere migliorati. Nella scelta della piantina sono coinvolti diversi fattori come:

1. La parte di pianta da cui prelevare il materiale;
2. Il genotipo;
3. Le condizioni fisiologiche della pianta;
4. La posizione del materiale sulla pianta;
5. Le dimensioni dell'espianto.

Altri fattori importanti riguardano lo stato fisiologico della pianta madre come: lo stadio di sviluppo; le riserve di carboidrati nel fusto e nelle foglie; le sostanze nutritive.

disposizione e gli ormoni in circolo.

FASE 1 detta stabilizzazione della coltura asettica in questa fase le piante dato che crescono in un ambiente esterno sono infestate da funghi,batteri e animali.Lo scopo di questa fase è la sterilizzazione degli espianti e l’allestimento dellacoltura asettica.Per liberare le piante dai contaminanti si effettua sostanzialmente in tutte lespecie allo stesso modo ossia si utilizzano etanolo e ipoclorito di sodio con loscopo di eliminare funghi e batteri.Sotto cappa a flusso luminare gli espianti vengono trasferiti all’ambientecoltura, a cui segue la crescita.Tale fase è considerata soddisfacente se un adeguato numero di espianti èsopravvissuto senza essere contaminato. Successivamente le piante all’internodei vasi di coltura (piastra petri) vengono posti in camera di crescita incondizione di luce, T e umidità controllate.In tale fase è fondamentale saper distinguere le formazioni del callo

dallecontaminazioni.

FASE 2 detta moltiplicazione
Lo scopo di questa fase è quello di indurre la produzione di nuovi propaguli che quando separati dalla coltura aumentino il numero di piante intere.
I propaguli sono germogli ascellari di nuova derivazione, embrioni somatici e organi proagativi.
I germogli ottenuti sono sottoposti a successive subcolture usando substrato di crescita nuovo in maniera tale da stimolare la formazione del maggior numero possibile di germogli ascellari.
Il substrato di crescita per le subcolture (germogli che anziché fatti diventare pianta vengono utilizzati per ottenere nuovi germogli destinati a far aumentare il numero di piante) è determinante per ottenere livelli soddisfacenti di produzione e per far ciò il substrato di crescita deve essere ricco in citochinine e auxine.
I germogli ottenuti da questa fase che non sono utilizzati per effettuare le subcolture sono destinati alla successiva fase.

FASE 3 detta allungamento dei germogli
i

Germogli piccoli non sono ancora capaci di sopportare la crescita fuori in ambiente esterno (ex vitro). In questa fase i germogli vengono fatti allungare prima di tentare la radicazione. L'allungamento è indotto introducendo nel substrato le gibberelline. Altre volte è sufficiente effettuare un ciclo di 4-6 settimane su substrato senza ormoni. Sempre in questa fase si allevano piante monocauli (monofusto) poiché diventano capaci di realizzare la fotosintesi.

FASE 4 detta radicazione: raramente nella fase 3 si formano radici avventizie quindi è necessario adottare una procedura di radicazione usando substrati speciali. In questo caso nel substrato si aumentano le auxine e diminuiscono le citochinine. Altri fattori importanti per la radicazione sono il genotipo della pianta e i cicli luce-buio. In alcuni laboratori per ridurre i costi si prelevano dall'ambiente in vitro i germogli e si fanno eradicare in condizioni ex vitro.

FASE 5 detta acclimatamento

È il trasferimento dall'ambiente in vitro a quello ex vitro, ed è una fase critica che può provocare gravi perdite. I germogli che si sono sviluppati in coltura hanno minor quantità di cera rispetto alle piante cresciute in serra; gli stomi delle foglie prodotte in vitro possono essere incapaci di una completa chiusura in condizioni di bassa umidità e quindi i tessuti vegetali perdono acqua rapidamente quando spostati in ambienti esterni (ex vitro). L'acclimatamento deve essere graduale evitando sbalzi termici e ponendo particolare attenzione alla salute delle piante che sono suscettibili agli attacchi parassitari, e devono essere mantenute in condizioni di costante modificazione. SUPERAMENTO DEI LIMITI DELLA MICROPROPAGAZIONE I limiti sono: - STERILIZZAZIONE DEGLI ESPIANTI e per superare tale limite si utilizza l'enzima (enzima che taglia la parete cellulare dei batteri); e nuovi antibiotici e antimicotici ad ampio spettro; - BASSO INDICE DI

PROLIFERAZIONE IN VITRO e per superare tale limite si effettua una migliore formulazione del substrato in cui si hanno differenti fonti di carbonio, nuovi agenti solidificanti (M-gel) e nuove miscele di fitoregolatori.

SCARSA CAPACITÀ MORFOGENETICA DEI TESSUTI ADULTI e per superare questo si utilizza: la doppia rigenerazione che consiste nella formazione di masse pro embrionali da foglioline di gemme avventizie prodotte in vitro. Queste masse producono embrioni i quali si moltiplicano in maniera indefinita; l'immersione temporanea in cui i germogli sono immersi nel substrato liquido di proliferazione per pochi minuti, più volte al giorno, in questo modo i germogli crescono in maniera rapida, sono più numerosi e si hanno meno rischi di contaminazione.

DIFFICOLTÀ DI RADICAZIONE e per superare tali limite si usano: nuove miscele di auxine, la micorrizazione e la tecnica del doppio strato solido/liquido che consiste nell'aggiungere substrato liquido sopra

quello solido al termine della fase di radicazione.

RIDUZIONE DEI COSTI semplificando le procedure, automatizzando il lavoro, utilizzando luce naturale nelle camere di crescita o luci LED.

VANTAGGI E SVANTAGGI DELLA MICROPROPAGAZIONE

I VANTAGGI sono:

• Richiesta di poco spazio e poco tempo per aumentare di molto il numero di piantine; la produzione può continuare per tutto l'anno;
• Produzione di cloni di piante difficili da propagare;
• Ottenimento di piante sane certificate virus esenti;
• Le piante possono ottenere caratteristiche di pregio;
• Il materiale prodotto vegetativamente si può conservare per molto tempo e questo materiale non ha bisogno di trattamenti fitosanitari, irrigazione ecc..

Gli SVANTAGGI sono:

• Richiesta di manodopera qualificata con attrezzatura specializzata che aumentano i costi;
• Sono necessari metodi specifici diversi per ogni specie o varietà;
• La fase di acclimatamento è molto critica;
• Si può avere la comparsa di variazioni.

somaclonali. L'uso delle coltura in vitro ha dato un forte impulso al miglioramento genetico delle piante poiché la possibilità di rigenerare una pianta completa partendo da una singola cellula ha permesso l'applicazione di diverse tecniche innovative come: ibridazione somatica mediante fusione di protoplasti (cellule senza parete cellulare); coltura di antere per l'ottenimento di aploidi; e l'induzione e sfruttamento della variabilità somaclonale.

- morfogenesi (organogenesi e embriogenesi somatica)

COLTURA IN BIOREATTORI

Il bireattore è un sistema fisico/termico di contenimento in cui le cellule si mantengono in coltura nelle condizioni ambientali e nutrizionali più idonee, allontanando i contaminanti.

In questo sistema chiuso, le cellule crescono secondo una curva di crescita sinusoidale in cui abbiamo una fase iniziale stazionaria poiché esse si devono acclimatare all'ambiente; un fase di crescita logaritmica ed un ultima

Nella crescita in vitro disorganizzata i tessuti mancano di una struttura amorfa, ehanno solo un limitato numero di cellule rispetto a quelle che si trovano nelle pianteintegre. I tipi di coltura più comuni sono: - ; - ; - ; - . (sinonimo di sospensione cellulare) Ponendo l'espianto in un substrato con auxine e una citochinina si può indurre laproliferazione di un ammasso di cellule indifferenziate denominato callo, esso è un ammasso informe, biancastro composto da cellule simili, non differenziate e pertantoprivi di tessuti e strutture vascolari. Esso può rigenerare piante intere per organogenesi o embrio