Riassunti genetica 51

Approfondimento sul trasferimento dell'informazione ereditaria: dal genotipo al fenotipo

L'evidenza di una relazione tra l'eredità di un carattere e l'eredità di un enzima consentì di ipotizzare l'esistenza di un collegamento tra fattori genetici e produzione di enzimi responsabili della manifestazione di caratteri. Si riteneva che il materiale genetico potesse controllare la manifestazione dei caratteri individuali regolando il metabolismo delle cellule, cioè presiedendo alla sintesi di proteine enzimatiche.

Altre prove dell'esistenza di una relazione tra materiale genetico e caratteri vennero fornite studiando le catene metaboliche che portano alla formazione dei pigmenti responsabili dei colori degli occhi in diversi tipi di Drosophila melanogaster e analizzando la trasmissione ereditaria in alcuni ceppi di Neurospora crassa della capacità di sintetizzare alcune sostanze necessarie per la crescita di questa muffa. Nel 1941, Beadle e Tatum elaborarono i risultati raccolti formulando l'ipotesi un gene-un enzima. Tuttavia, ciò non poteva confermare che la funzione primaria del materiale ereditario fosse la sintesi delle proteine, in quanto se è vero che tutti gli enzimi sono proteine, non si può di certo dire il contrario.

Nel 1949, Pauling e Itano studiarono la struttura primaria dell'emoglobina (proteina presente nei globuli rossi la cui funzione è quella di unirsi con l'ossigeno e assicurarne il trasporto e lo scambio) di individui sani e malati. Tale proteina è costituita da due catene polipeptidiche alfa e due catene polipeptidiche beta. Il confronto della composizione amminoacida dell'emoglobina di individui sani (Hb-A) con quella corrispondente alterata (Hb-S) evidenziò un solo cambiamento nella sequenza polipeptidica: nelle catene beta di quest'ultima, il sesto amminoacido è la valina e non l'acido glutammico. La conseguenza di quest'alterazione è la malattia ereditaria detta anemia falciforme.

Le ricerche successive condotte sulla trasmissione delle emoglobine alterate hanno permesso di concludere che la sintesi di catene polipeptidiche alfa e beta è fatta da alleli diversi. Infine, si è potuto quindi affermare che un gene rappresenti un'unità ereditaria funzionale costituita da una frazione della molecola di DNA che presiede alla sintesi di una particolare catena polipeptidica. Tale osservazione consentì di formulare l'ipotesi un gene-una catena polipeptidica.

Approfondimento sul dogma centrale della genetica molecolare

Una serie di esperimenti condotti usando sistemi acellulari permise di dimostrare che il DNA non è direttamente coinvolto nella sintesi proteica, ma che invece è l'RNA ad esserci coinvolto direttamente e di dedurre che la sintesi del DNA è legata al DNA. Fu infatti possibile promuovere la sintesi di proteine in vitro addizionando elementi amminoacidi come elementi costruttivi e ATP come fonte energetica. Quando a questi sistemi veniva aggiunto un enzima DNasico, la sintesi proteica si arrestava e poteva essere nuovamente attivata aggiungendo DNA. I risultati di altri esperimenti confermarono la validità della successione ipotizzata: DNA < RNA < proteine.

Nel 1959, Ochoa e collaboratori dimostrarono che la sintesi dell'RNA è catalizzata da un enzima, la RNA polimerasi, che agisce solamente in presenza di DNA. Nel 1960 fu dimostrato che i ribosomi, organelli cellulari composti da RNA e proteine, sono il luogo in cui avviene la sintesi proteica. A seguito di queste acquisizioni, risultò evidente che l'RNA è la molecola che funziona da mediatore mettendo in relazione l'informazione nella sequenza di basi del DNA con quella contenuta nella sequenza di amminoacidi delle proteine. La relazione tra DNA, RNA e proteine costituisce l'essenza di quello che viene definito il dogma centrale della biologia molecolare: DNA RNA > proteina.

Le molecole di RNA si formano sullo stampo del DNA (trascrizione) e l'RNA fa a sua volta da stampo per la sintesi delle proteine (traduzione). Ciò significa che l'informazione genetica contenuta nel DNA, sotto forma di una particolare sequenza di basi, viene prima copiata nell'RNA, impiegando come stampo uno dei due filamenti di DNA stesso ed in seguito tradotta in catena polipeptidica. Tuttavia, questa successione di eventi non è sempre valida in quanto alcuni geni codificano unicamente per RNA che non sono traducibili in proteine.

Secondo questo modello, l'accoppiamento specifico delle basi azotate costituisce il meccanismo alla base del trasferimento dell'informazione genetica da una molecola di DNA ad una di RNA (trascrizione). Successivamente, l'RNA serve da stampo per porre nella giusta sequenza gli amminoacidi nelle relative catene polipeptidiche (traduzione). Il trasferimento dell'informazione genetica dal DNA all'RNA può essere bidirezionale poiché alcune volte è reversibile. Ad esempio, nei retrovirus, l'RNA subisce una retrotrascrizione che origina un filamento di DNA. Il trasferimento dell'informazione genetica dall'RNA alla proteina è invece irreversibile e quindi sempre unidirezionale.

I processi di trascrizione e traduzione avvengono in tre sedi: citoplasma, plastidi e mitocondri. La sintesi delle proteine a partire dagli RNA trascritti nel nucleo avviene nel citoplasma in corrispondenza del reticolo endoplasmatico, mentre la sintesi delle proteine relative agli RNA trascritti nei plastidi e nei mitocondri avviene direttamente in questi organelli. Il DNA nucleare dà origine a una quantità e qualità di prodotti genici (mRNA e proteine) assolutamente preponderante rispetto al DNA mitocondriale e a quello plastidiale. In quest'ultimi sono localizzati geni responsabili della sintesi di proteine coinvolte rispettivamente nella respirazione e nella fotosintesi.

Approfondimento sulla trascrizione dell'RNA

La trascrizione è un processo di trasferimento dell'informazione genetica da una molecola di DNA ad una molecola di RNA. Nel caso in cui entrambi i filamenti di DNA servissero come stampo per la sintesi dell'RNA, ogni gene consentirebbe la formazione di due diversi tipi di RNA. Esperimenti genetici hanno confermato che un gene codifica per una singola catena polipeptidica e che solo uno dei due filamenti di DNA è trascritto nel corrispondente RNA.

La successione di basi contenuta nella doppia elica di DNA guida la sintesi di un filamento di RNA in direzione 5'>3'. Il filamento di DNA che viene usato come stampo per la sintesi dell'RNA è il cosiddetto filamento stampo orientato in direzione 3'>5'. La molecola di RNA prodotta ha pertanto la stessa sequenza dell'altro filamento di DNA chiamato filamento senso, con la differenza che nucleotidi con base U, cioè uracile, sostituiscono quelli con base T, cioè timina.

La sintesi di RNA è catalizzata dall'RNA polimerasi, un enzima che unisce i nucleotidi trifosfati ATP, GTP, CTP, UTP (NTP) in catene polinucleotidiche. In presenza di ioni bivalenti come Mn²⁺ o Mg²⁺, la RNA polimerasi catalizza la formazione di legami fosfodiesterici tra ribonucleotidi in direzione 3'>5' secondo la reazione (NTP) <RNA polimerasi> NMP + PP_i (la reazione è a pagina 200 ma è n+1 così). La reazione è reversibile ma in vivo è spostata verso destra poiché il pirofosfato inorganico, cioè PP_i formatosi, viene idrolizzato. Prima che la trascrizione possa incominciare, la doppia elica del DNA deve essere pertanto denaturata e srotolata: nei procarioti ciò viene realizzato dalla RNA polimerasi stessa, mentre negli eucarioti è provocato da proteine specifiche che si legano al DNA nel punto di inizio della trascrizione.

La trascrizione, così come la traduzione, si realizzano durante tutto il ciclo cellulare, nonostante i processi siano ridotti durante la fase mitotica. L'RNA polimerasi inizia la trascrizione in corrispondenza di una sequenza nucleotidica specifica detta promotore, differente tra procarioti ed eucarioti. Negli eucarioti sono presenti tre singole classi di RNA polimerasi riconducibili a tre gruppi di geni, ognuna delle quali interviene durante la trascrizione di un tipo specifico di RNA. In particolare, la sintesi dell'RNA prende avvio in una parte di DNA localmente denaturato e srotolato, detto bolla di trascrizione, originatosi per azione della RNA polimerasi stessa.

La RNA polimerasi non richiede un innesco e può quindi incominciare la sintesi delle nuove catene ribonucleotidiche in assenza di un primer di DNA. Il nucleotide successivo da inserire nella fase di allungamento è selezionato dalla stessa RNA polimerasi. Anche lo srotolamento e il riavvolgimento della doppia elica di DNA sono catalizzati dalla RNA polimerasi. La trascrizione si arresta in corrispondenza di un'altra sequenza nucleotidica specifica detta terminatore.

Il processo di trascrizione può essere diviso in tre fasi distinte:

• Fase iniziale della trascrizione che coincide con l'inizio della trascrizione e richiede il riconoscimento e il legame dell'RNA polimerasi a una regione del DNA verso l'estremità 5', corrispondente al promotore.
• Fase di allungamento del filamento di RNA durante la quale l'RNA polimerasi catalizza l'estensione delle catene ribonucleotidiche.
• Fase finale che coincide con la terminazione della trascrizione e richiede il riconoscimento di una regione di DNA a valle del gene, cioè verso l'estremità 3', corrispondente al terminatore.

Approfondimento sui tipi di acidi ribonucleici e di RNA polimerasi

L'RNA è costituito da singoli filamenti ribonucleotidici. In alcuni tratti, nel caso in cui dovesse verificarsi la complementarietà tra basi azotate, i filamenti di RNA possono ripiegarsi assumendo una struttura a doppia elica per la formazione di legami a idrogeno.

Nell'espressione genica sono coinvolti tre tipi di acidi ribonucleici: RNA ribosomiale (rRNA), RNA di trasferimento (tRNA) e RNA messaggero (mRNA). Gli RNA ribosomiali sono componenti strutturali e funzionali dei ribosomi, insieme a numerose proteine. Questi acidi ribonucleici costituiscono gli organelli citoplasmatici dove avviene la sintesi proteica. Negli eucarioti esistono quattro tipi di RNA ribosomiali denominati 5S, 5,8S, 18S, 28S (25S nelle piante) codificati da geni che nel loro insieme costituiscono l'rDNA.

Nelle piante, le frazioni 5S, 18S, 25S sono codificate da geni raggruppati nella regione dell'organizzatore nucleolare, mentre la frazione 5S è codificata da geni che non fanno parte dell'organizzatore nucleolare. Nei procarioti invece esistono tre tipi di RNA ribosomiale indicati con le sigle 5S, 16S, 23S. I ribosomi sono organelli di forma ovoidale costituiti da due subunità: quella più grande è grande il doppio rispetto a quella più piccola ed entrambe le subunità contengono RNA e proteine nel rapporto di circa 2:1. Per convenzione, tali subunità sono distinte in funzione della loro velocità di sedimentazione espressa con il valore S. Così nei batteri e in generale nei procarioti, si hanno le subunità 30S e 50S che insieme formano un ribosoma 70S. Negli eucarioti, la subunità minore è quella 40S e risulta costituita da 33 proteine e dalla frazione 18S dell'RNA ribosomiale, mentre la subunità maggiore è quella 60S ed include 49 proteine e tre tipi di RNA ribosomiale 5S, 5,8S e 28S (25S nelle piante). Le due subunità si associano nel citoplasma per formare un ribosoma 80S attivo durante la traduzione.

I geni che codificano l'RNA ribosomiale sono organizzati in copie ripetute in serie e separate da spaziatori. L'RNA ribosomiale è comunque molto uniforme negli organismi sia per dimensione che per composizione nucleotidica. L'informazione genetica contenuta nella sequenza di nucleotidi del DNA e trascritta nell'RNA messaggero può essere tradotta in sequenza di amminoacidi grazie all'intervento di RNA di trasferimento, che rappresentano quindi specifiche molecole adattatrici con la funzione di trasferire gli amminoacidi fino al filamento di mRNA che funge da stampo durante la sintesi proteica. Crick fu il primo a ritenere che la posizione di un amminoacido all'interno di una catena polipeptidica fosse determinata dal legame tra l'mRNA e un tRNA unito ad uno specifico amminoacido.

Secondo questa ipotesi nota come ipotesi dell'adattatore, il tRNA avrebbe svolto sia la funzione di riconoscimento di una determinata sequenza di mRNA, sia di trasferimento di uno specifico amminoacido nei ribosomi. Nel 1958, Hoagland e collaboratori dimostrarono l'esistenza di almeno un tRNA specifico per ogni amminoacido, mentre nel 1962 fu provato che la sequenza delle basi contenute nell'mRNA è riconosciuta dal tRNA.

Gli RNA di trasferimento rappresentano sia nei procarioti che negli eucarioti il 10-15% dell'RNA totale della cellula. Questo tipo di acidi ribonucleici è costituito da molecole molto piccole, formate da 75-90 nucleotidi con una dimensione pari a circa 4S. La molecola dei tRNA è costituita da lunghi tratti a doppia elica formatisi per ripiegamento del filamento singolo su se stesso con l'instaurarsi di legami ad idrogeno tra basi complementari. Ogni molecola assume una caratteristica struttura secondaria per la presenza di tre anse o lobi senza appaiamento di basi. Tale struttura è detta a trifoglio.

Nelle piante, il primo RNA di trasferimento sequenziato fu quello per la fenilalanina. In tale molecola sono state individuate sei distinte basi azotate inusuali: 2-metiladenosina, diidrouridina, 2'-O metilguanosina, ribotimidina, pseudouridina, e N6-isopenteniladenosina. Generalmente, i vari tRNA sono sintetizzati come precursori, con nucleotidi addizionali ad entrambe le estremità che poi vengono rimossi durante il processo di maturazione. Tutti gli RNA maturi presentano comunque una sequenza di CCA all'estremità 3' e una G all'estremità 5'.

Le differenze a carico della sequenza nucleotidica della regione variabile che può presentare basi diverse da A, G, C, e U, come ad esempio l'inosina, la pseudouridina, la diibrouridina (D), e la ribotimidina (T), determinano la capacità di un particolare tipo di tRNA di legarsi ad un amminoacido specifico. Le basi insolite derivano da modificazioni delle basi azotate tipiche dell'RNA durante il processamento del tRNA finale. Una delle parti più importanti di un tRNA è il braccio accettore situato all'estremità del 3', al quale si attacca un particolare amminoacido. Inoltre, ognuna delle tre anse di cui è dotato ciascun tRNA svolge un ruolo essenziale.

Una prima ansa posizionata verso il 5', denominata ansa D per la presenza di diidrouridina, riconosce un enzima specifico che catalizza l'unione del tRNA con l'amminoacido. Una seconda ansa posizionata verso il 3', denominata ansa TψC, costituisce il sito di unione con il ribosoma. L'ansa centrale include invece una sequenza di tre nucleotidi detta anticodone, molto importante perché durante la traduzione è quella che si appaia con una sequenza complementare dell'mRNA chiamata codone.

Per assumere la sua configurazione finale, ogni molecola di tRNA subisce un ulteriore ripiegamento assumendo una struttura terziaria molto più compatta. Le aminoacil-sintetasi caricano i tRNA legandovi l'amminoacido appropriato. In una prima fase, l'aminoacil-sintetasi, in presenza di ATP, attiva l'amminoacido mediante la formazione di un legame ad alta energia con l'AMP, determinando la liberazione di pirofosfato inorganico: aa+ATP < sintetasi >> aaAMP+PP_i. In una seconda fase, l'aminoacil-sintetasi favorisce la formazione di un legame covalente tra l'amminoacido attivato e il ribosio situato all'estremità 3' del tRNA nel braccio accettore con la conseguente liberazione di AMP: aaAMP+tRNA <<< sintetasi >>> aa tRNA+AMP (la reazione è comunque consultabile nel libro a pagina 205 stessa cosa anche per la reazione prima di questa).

Nella maggior parte delle specie esistono 20 aminoacil-sintetasi diverse, un enzima specifico per ognuno degli amminoacidi. Per questo motivo, ogni aminoacil-sintetasi prende il nome dall'amminoacido che unisce al tRNA. Le molecole di RNA messaggero sono costituite da un singolo filamento di lunghezza variabile che passa dal nucleo, dove è stato prodotto sullo stampo del DNA attraverso la trascrizione, al citoplasma.

Gli RNA procariotici spesso contengono le regioni codificanti di uno o più geni e vengono per questo motivo detti multigenici. Invece, la maggioranza degli mRNA eucariotici contiene la regione codificante di un singolo gene.