Riassunti di Biologia Molecolare Modulo 3 - Il codice genetico e la Regolazione dell'Espressione Genica

Università di Catania LUIGI FIORENTINO Facoltà di Scienze Biologiche, L-13

MODULO 3

MODULO 3: Il codice genetico – mutazioni soppressore. Regolazione dell’espressione genica –

regolazione dell’inizio della trascrizione nei procarioti: il modello dell’operone ed il fago lambda - La

Regolazione traduzione-dipendente dell’mRNA e della stabilità delle proteine.

Meccanismi di regolazione trascrizionale negli eucarioti – fattori di trascrizione – i domini di legame

al DNA - la trasduzione del segnale – regolazione della struttura della cromatina – silenziamento

genico. Tecniche di Biologia molecolare: l’elettroforesi di macromolecole biologiche – sonde

d’ibridazione – il clonaggio genico – le librerie: genomiche e a DNA – la PCR – il Sequenziamento.

Capitolo 14: Il Codice Genetico Il cuore centrale del

Dogma della biologia è

certamente il concetto

secondo il quale

l’informazione a

partire dell’alfabeto a

quattro lettere (le basi

azotate) della catena

polinucleotidica del

DNA venga “tradotto”

in un linguaggio a 20

lettere (gli aminoacidi)

che costuiscono le

componenti

fondamentali di

qualsiasi catena

polipeptidica. Il codice

genetico prevede

proprio questo: è la

modalità mediante la

quale l’informazione

presente nelle

sequenze codificanti

del DNA venga letta a triplette di nucleotidi (o codoni).

Come abbiamo visto, la traduzione di informazioni genetiche nelle sequenze di amminoacidi si

svolge sui ribosomi ed è mediata da speciali molecole adattatrici note come tRNA o RNA tranfer i

quali riconoscono gruppi di tre nucleotidi consecutivi, i codoni. Con quattro possibili nucleotidi in

3

), valore

ciascuna posizione del codone, il numero totale di permutazioni di queste terzine è 64 (4

senz’altro superiore al numero di aminoacidi esistenti in natura. La cosa del tutto sorprendente è

che 61 delle 64 possibili terzine specificano per un amminoacido mentre soltanto tre codoni

costituiscono i codoni di stop. Ciò significa che esistono codoni sinonimi, ossia triplette diverse ma

codificanti per lo stesso aminoacido da ciò si può intuire che ogni aminoacido è specificato da più

di un codone, prerogativa del codice genetico chiamata degenerazione del codice (genetico). 318

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Prendendo come esempio i codoni, UUU e UUC essi infatti sono codoni sinonimi della

fenilalanina, mentre la serina è codificata da i sinonimi UCU, UCC, UCA, UCG, AGU e AGC.

Il codice genetico sebbene si presenti, con piccolissime eccezioni, identico in tutti i domini della

vita ma tuttavia non può dirsi universale, piuttosto sarebbe corretto ritenerlo come un codice

“quasi” universale. Se da un lato infatti è vero che i risultati del sequenziamento di genomi su

larga scala hanno ampiamente confermato l’attesa universalità del codice genetico, cosa che

senz’ombra di dubbio ha consentito di accrescere e migliorare la comprensione sui meccanismi

che governano la vita in tutte le sue forme, dall’altro il riscontro secondo cui in alcuni organelli

subcellulari, il codice genetico risulta essere in realtà leggermente diverso dal codice standard,

ha fatto vacillare tale rinomata universalità del codice. Questo dato di fatto è stato constatato

anche durante il

sequenziamento

dell’intero genoma

mitocondriale umano

da 16.569 bp ma è

stato osservato anche

per i mitrocondri del

lievito, di Drosophila e

delle piante superiori.

Le note sequenze

codificanti per proteine

hanno rivelato quali e

quante differenze

sussistono tra i due

codici genetici, ovvero

quello standard e

quello mitocondriale

(Tabella accanto, la si

confronti con la tabella

a pagina precedente):

I. UGA in questo

codice ad esempio non

è un codone di stop ma

tale codone specifica

Trp

per il triptofano. Quindi, l’anticodone di un tRNA mitocondriale riconosce sia la

tripletta UGG che qulla UGA, anche in questo caso il codice mitocondriale risulta

degenerato proprio come accade nel codice genetico standard.

II. La metionina interna (in frame) è invece codificata sia dall’AUG che dal codone AUA.

III. Nei mitocondri dei mammiferi, i codoni AGA e AGG non sono codoni di arginina (nel

codice "universale" ne esistono ben 6 per questo aminoacido) ma, anzi, sono codoni di

stop; pertanto, vi sono quattro codoni di stop (UAA, UAG, AGA e AGG) nel codice

mitocondriale dei mammiferi.

IV. Nei mitocondri di Drosophila (moscerino comune della frutta), anche AGA e AGG non

sono codoni dell’arginina ma specificano per la serina. Forse non a caso, anche i tRNA

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mitocondriali sono insoliti rispetto alle regole con cui decodificano i messaggi

mitocondriali.

Nei mitocondri dei mammiferi sono presenti solo 22 tRNA, mentre occorre un minimo di 32

molecole di tRNA necessarie per decodificare il codice "universale" stando alle regole del

tentennamento della base, questo perché anche gli stessi tRNA mitocondriali non sono soggetti

alle stesse regole di quelli cellulari nel decodificare i messaggeri. Come conseguenza di questo

fatto si ha che, quando uno stesso amminoacido è specificato da quattro codoni differenti (recanti

tuttavia la stessa base in prima e seconda posizione), solo un singolo tRNA mitocondriale risulta

coinvolto (mentre almeno due tRNA sarebbero richiesti nel codice genetico standard).

Ora, tornando alle caratteristiche del codice genetico standard, attraverso un’accurata

supervisione si nota ad ogni aminoacido corrisponda da 1 (nel caso di metionina e triptofano) a 6

codoni e già questa caratteristica ci lascia pensare che tale codice si sia evoluto in modo da ridurre

al minimo gli effetti deleteri delle mutazioni, altre caratteristiche del codice genetico standard

possono essere così riassunte:

1. Mutazioni a carico della prima posizione di un codone spesso forniscono un amminoacido

con caratteristiche chimico-fisiche simili (anche se non uguale all’aminoacido originale),

ma, cosa ancora più visibile, spesso molti tra i codoni sinonimi che appunto specificano per

lo stesso aminoacido, differiscono per una sola base, la terza base.

2. Inoltre, codoni con PIRIMIDINE nella SECONDA POSIZIONE specificano principalmente

aminoacidi IDROFOBICI; codoni con PURINE in SECONDA POSIZIONE spesso codificano

principalmente per amminoacidi POLARI (vedi Tabella a pag. 318). Tutto questo vuol dire

che, qualora in SECONDA POSIZIONE dovesse determinarsi una mutazione per

TRANSIZIONE (sostituzioni da A: T a G: C o viceversa), le più comuni mutazioni puntiformi,

a carico della base in seconda posizione di un codone, comunque il codone sarà

ugualmente in grado di codificare per un aminoacido molto simile se non lo stesso.

3. In aggiunta, se un codone presenta una mutazione di transizione nella TERZA POSIZIONE,

raramente specificherà per un aminoacido diverso;

4. Una mutazione per trasversione in terza posizione poi, circa nella metà dei casi, non avrà

conseguenze sull’aminoacido codificato.

5. Un’altra caratteristica evidente nel codice è che quando le prime due posizioni di un

codone sono entrambe occupate da G e/o C, la presenza nella terza base di uno qualsiasi

dei 4 nucleotidi possibili consente comunque al codone di specificare per lo stesso

amminoacido (vedi esempi della prolina, dell’alanina, dell’arginina o della glicina).

6. D’altra parte, ogni volta che le prime due le posizioni del codone sono entrambe occupate

da A o U, la natura del terzo il nucleotide fa la differenza tra codone e codone.

Dal momento che le coppie di basi G: C sono più forti delle coppie A:U, sono spesso

tollerate discrepanze (errori di accoppiamento) nell’associazione della terza base del

codone quando nelle prime due posizioni si formano coppie di basi forti come appunto G:

C.

Quindi, la possibilità che tutti e quattro i nucleotidi nella terza posizione specifichino lo stesso

amminoacido, così come tutte le altre caratteristiche di cui si è fatta menzione può essersi evoluta

come un meccanismo di sicurezza, un buffer (tampone) per ridurre al minimo gli errori nella

lettura di tali codoni e quindi le mutazioni. Questo ci fa capire come la terza base incide meno sul

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significato di un codone. La spiegazione di questa caratteristica verrà qui avanti fornita e va

ricercata nel meccanismo chimico della traduzione.

È stato inizialmente proposto che esistesse uno specifico anticodone di tRNA per ciascun

differente codone, ma, se così fosse, dovrebbero esistere almeno 61 diversi tRNA, con l’aggiunta

dei 3 tRNA che riconoscono i codoni di stop. In seguito, però, vennero prodotte prove che

dimostravano che varie specie di tRNA a sequenza nota e altamente purificati potevano

riconoscere numerosi codoni diversi; inoltre vennero scoperti casi in cui una base

dell’anticodone non era una delle quattro canoniche, ma era costituita da una base diversa,

l’inosina: come tutte le altre basi non canoniche che si ritrovano nei tRNA, questa viene generata

attraverso la modifica enzimatica di una base presente all’interno della catena polinucleotidica

tRNA. In particolare, l’inosina deriva dall’adenina, il cui carbonio in posizione 6 viene deaminato

per dare il gruppo chetonico dell’inosina (si ricordi che l’inosina è in realtà un nucleoside

composto dal ribosio e dalla base ipoxantina).

Nel 1966, Francis Crick introdusse il concetto di appaiamento tentennante (codone-anticodone,

anche detto tentennamento) per spiegare queste osservazioni.

Secondo tale concetto, la base all’estremità 5’ dell’anticodone ovvero la prima base

dell’anticodone (cui corrisponde la terza nel codone, vedi figura sopra), non è spazialmente

confinata differentemente dalle altre due, cioè risente meno della presenza delle basi adiacenti

rispetto alle altre due dell’anticodone e questa peculiarità le consente di formare legami

idrogeno con una “qualsiasi” (in realtà ci sono delle piccole restrizioni) delle diverse basi situate

all’estremità 3’ di un codone, tuttavia non tutte le combinazioni sono possibili: 321

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Se nella prima base dell’anticodone è presente una C,

questa si può soltanto appaiare con la G del codone,

quindi è possibile soltanto l’appaiamento cononico; stessa

cosa se presente la A nella prima base dell’anticodone,

questa potrà appaiarsi con la U del codone. Un

appaiamento più ampio si può già avere se la prima base

dell’anticodone è la G, infatti questa si può appaiare sia

con la C che con la U di un codone. Se poi, ad esempio, è

l’Uracile a trovarsi nella posizione di oscillazione

dell’anticodone, può appaiarsi con l’Adenina o la Guanina,

mentre l’Inosina nella prima posizione dell’anticodone può

accoppiarsi con Uracile, Citosina o Adenina (Fig. accanto).

Gli accoppiamenti consentiti dalle regole del tentennamento sono soltanto quelli che forniscono

distanze ribosio-ribosio prossime a quella delle coppie standard di basi A: U o G: C: le coppie

purine-purine (ad eccezione delle coppie I: A) o pirimidina-pirimidina darebbero distanze ribosio-

ribosio rispettivamente troppo lunghe o troppo corte.

In generale, le regole di oscillazione non consentono ad una singola molecola di tRNA di

riconoscere quattro codoni diversi, infatti, soltanto al massimo tre codoni possono essere

riconosciuti da un singolo tRNA e questo caso, tra l’altro, accade SOLO quando L’INOSINA occupa

la prima (al 5’) posizione dell’anticodone (in quanto, come si è detto questa può appaiarsi sia con

l’Uracile che con la citosina o con l’adenina in un codone del trascritto). Quasi tutte le prove

raccolte dal 1966 sino ad oggi supportano comunque il concetto di oscillazione: il concetto ha

previsto correttamente che esistono almeno tre tRNA per i sei codoni serinici (UCU, UCC, UCA,

UCG, AGU e AGC). Gli altri due aminoacidi (leucina e arginina) codificati da sei codoni presentano

anche tRNA diversi per i gruppi di codoni che differiscono nella prima o nella seconda posizione.

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Giustamente, ci si chiede come sia possibile che basi, quali la Guanina, l’Uracile e l’Inosina possano

appaiarsi con basi differenti da quelle canoniche o con più basi diverse. La spiegazione, da un

punto di vista molecolare, è fornita dall’oscillazione della base al 5’ dell’anticodone è in grado di

oscillare, e tale fenomeno è stato utilizzato per spiegare e reggere la teoria, poi diventata un

concetto, dell’appaiamento tentennante codone-anticodone. L’oscillazione della prima base

dell’anticodone le è consentità perché, come si è accennato precedentemente, la sua posizione

non è confinata dalla presenza di basi adiacenti o, che a dir si voglia, questa base è in grado di

possedere una mobilità maggiore rispetto alle altre che costituiscono l’anticodone. L’oscillazione

della base (si attenzioni che oscilla la base e non l’intero nucleotide) le consente di formare,

attraverso i propri gruppi reattivi, legami idrogeno con altre basi generando appaiamenti diversi

da quelli standard.

Nella struttura tridimensionale del tRNA, le tre basi dell’anticodone, ed anche le due basi

successive (al 3’) nell’ansa dell’anticodone, sono tutte orientate nella stessa direzione, e la loro

conformazione esatta è determinata dalle interazioni tra le superfici piatte delle basi impilate

(Figura sopra). In tal modo, la prima base (in posizione 34, al 5’) dell’anticodone si trova

all’estremità della pila ed è probabilmente meno limitata nei movimenti di quanto non lo siano

S-S

le altre due basi dell’anticodone poiché non risente della stessa intensità delle interazioni

(interazioni di impilamento) di cui invece risentono le altre due basi: se infatti si attenziona la sua

posizione, la posizione 34 sul tRNA, si nota come effettivamente, seppure da un lato questa base

sia piuttosto vicina alla seconda base dell’anticodone (in posizione 35 del tRNA) con cui

sicuramente interpone delle interazioni di impilamento, dall’altro però la base in posizione 33 si

trova molto più distaccata da essa quindi certamente non fa risentire il proprio ingombro sterico e

non determina la generazione di forze di impilamento di intensità tale da mantenere ben in

poszione la prima base dell’anticodone. Da ciò infatti deriva la variabilità della base nella terza (al

3’) posizione del codone. Al contrario invece, la terza base dell’anticodone (quella al 3’) non solo

si trova nella parte mediana della pila, ma è sempre affiancata da un’ingombrante purina

modificata, pertanto, la restrizione dei suoi movimenti potrebbe spiegare perché non si osserva

mai variabilità nella prima posizione (al 5’) del codice genetico standard. Discorso molto simile poi

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vale per la seconda base dell’anticodone, strettamente impilata e confinata dalle due adiacenti (la

S-S(o S-stacking)

prima al 5’ e la terza al 3’) quindi vincolata da interazioni e pertanto

impossibilitata ad oscillare.

Il codice genetico sottostà a tre regole principali: Æ

g) I codoni vengono letti sempre in direzione 5’Æ 3’;

h) I codoni non si sovrappongono e il messaggio non contiene interruzioni: il ribosoma

infatti posiziona un codone alla volta all’interno dei propri siti.

i) Il messaggio viene letto con uno schema di lettura fisso, la cosidetta ORF, determinato

dal codone di inizio.

Date queste tre linee guida, bisogna comunque tenere conto del fatto che, come analizzato nel

capitolo dedicato (capitolo 8), le mutazioni puntiformi, pur avvenendo anche casualmente,

possono alterare la sequenza di un gene: come spesso si è detto, un’alterazione che cambia un

codone specifico per un amminoacido in un codone specifico per un altro amminoacido viene

detta mutazione missenso. La conseguenza è che un gene che porta una mutazione missenso

produrrà una proteina in cui un singolo amminoacido è stato sostituito da un altro, come E-

nell’esempio classico dell’anemia falciforme, in cui il glutammato in posizione 6 nella subunità

globina dell’emoglobina è sostituito da una valina.

Un effetto più drastico si ha quando l’alterazione causa la comparsa di un codone di stop, tale

mutazione viene detta mutazione nonsenso o mutazione di stop: se tale mutazione avviene nei

pressi del centro di una sequenza codificante di un qualsiasi messaggero, dal ribosoma viene

rilasciato un polipeptide incompleto, dovuto alla terminazione prematura della traduzione. Le

dimensioni della catena polipeptidica incompleta dipendono dalla posizione in cui è avvenuta la

mutazione nonsenso, quindi di rimando, la gravità dell’effetto della mutazione è determinata da

quanto risulti mutato il polipeptide prodotto: infatti le mutazioni che avvengono vicino all’inizio di

un gene producono polipeptidi molto corti, mentre quelle che avvengono vicino alla fine

producono polipeptidi di lunghezza quasi normale. Come si è visto nel Capitolo precedente, gli

mRNA che contengono codoni di stop prematuri vengono degradati rapidamente nelle cellule

eucari