Riassunti genetica 4

Approfondimento identificazione del materiale ereditario

Un contributo determinante alle indagini sul materiale ereditario venne fornito da Griffith in seguito ad esperimenti condotti con Diplococcus pneumoniae, batterio comunemente chiamato pneumococco che provoca la polmonite nell’uomo e che è letale per i topi. Ceppi diversi di questo agente patogeno hanno avuto differenze in termini di virulenza cioè la capacità di provocare la malattia.

Griffith usò due ceppi distinguibili in base all’aspetto delle relative colonie sviluppate in terreno di coltura solido, quello di tipo virulento aveva cellule rivestite da una capsula di polisaccaridi in grado di conferire alle colonie un aspetto liscio, mentre le cellule dell’altro ceppo, di tipo non virulento, non avevano la sacca di polisaccaridi e le colonie avevano aspetto di tipo rugoso. Per tali caratteristiche delle colonie i due ceppi vennero denominati rispettivamente di tipo S cioè smooth e di tipo R cioè di tipo rough.

I batteri del ceppo S non sono virulenti poiché la presenza del rivestimento di polisaccaridi, assenti nei batteri del ceppo R, impedisce alle difese dei topi di inglobarli per fagocitosi da parte dei leucociti. Griffith effettuò esperimenti iniettando in alcuni topi batteri vivi del primo ceppo e in altri topi batteri vivi del secondo ceppo e osservò se i due tipi di batteri potessero avere o no un’azione di tipo letale. Così vide che quando iniettava batteri del ceppo S i topi morivano mentre quando iniettava batteri del ceppo R i topi sopravvivevano.

In seguito, Griffith trattò le cellule del ceppo virulento con il calore, e stavolta vide che i topi sopravvivevano con il ceppo di tipo S poiché le sue cellule erano state uccise dal calore. Invece, iniettando allo stesso tempo cellule non virulenti e cellule virulenti uccise dal calore, i topi morivano. Griffith interpretò i suoi risultati affermando che un costituente cellulare riferito come principio trasformante, fosse passato dalle cellule del ceppo S morte a quelle del ceppo R vive determinando così la modificazione di quest’ultime da non virulente a virulente. A dimostrazione di ciò, le cellule vive recuperate dai topi morti, originavano colonie lisce di tipo S. In qualche modo un determinante ereditario delle cellule uccise S aveva convertito le cellule R in cellule S. Tale processo fu chiamato trasformazione batterica.

Ipotesi di Griffith

Nel loro complesso tali ipotesi risultarono compatibili con l’ipotesi che la formazione di una capsula dipendesse dal materiale genetico dei batteri. Nonostante Griffith ignorasse la vera natura della sostanza trasformante, il risultato più importante dei suoi esperimenti è costituito dalla dimostrazione che qualche determinante genetico responsabile di un’informazione ereditaria poteva essere trasferito dai batteri morti ai batteri vivi. Questi esperimenti vennero in seguito ripresi per scoprire quale fosse la natura del principio trasformante.

Esperimenti di Avery, McLeod e McCarty

Nel 1944 Avery, McLeod, McCarty ripresero il materiale genetico usato da Griffith e attraverso una serie di esperimenti dimostrarono che la capacità di indurre trasformazione nei batteri, non era connessa alle proteine ma agli acidi nucleici. Avery e collaboratori aggiunsero al mezzo di coltura dei batteri del ceppo non virulento, degli estratti acellulari del ceppo virulento, dalle quali erano state rimosse con metodi appropriati determinate categorie di sostanze (proteine polisaccaridi, acidi nucleici). Valutando singolarmente le singole classi di molecole trovate nei residui delle cellule morte del ceppo S, volevano stabilire la loro capacità di indurre una trasformazione batterica.

Dalla coltura di cellule del ceppo non virulento, ottennero solo colonie di tipo R, con gli estratti acellulari del ceppo virulento non ottennero alcuna colonia, mescolando insieme cellule batteriche vive non virulente con estratti acellulari del ceppo virulento osservarono soprattutto colonie di tipo R ma anche alcune rare colonie di tipo S. L’estratto acellulare delle cellule del ceppo S doveva quindi avere un principio trasformante. In seguito confrontarono la capacità trasformante di un estratto acellulare integro con quelli di estratto acellulari privati di volta in volta di proteine, lipidi, polisaccaridi, acidi nucleici. L’estratto acellulare del ceppo S mostrava un’attività trasformante così come gli estratti purificati da lipidi e proteine. Questi risultati dimostrarono che né i lipidi né le proteine potevano essere responsabili della trasformazione delle cellule non virulente a cellule virulente.

Avery e collaboratori trovarono solamente una classe di composti che possedeva la capacità di indurre una trasformazione e gli esperimenti proseguirono ma stavolta al fine di stabilire quale componente tra acidi nucleici, DNA e RNA fosse quella responsabile della trasformazione. In particolare quando ad un estratto acellulare del ceppo S veniva aggiunto deossiribonucleasi (DNasi) non veniva osservata alcuna attività trasformante. Al contrario utilizzando ribonucleasi (RNasi) per degradare gli acidi nucleici, la capacità trasformante risultava ancora presente. Ciò permise di isolare una singola classe di molecole corrispondente al DNA con alta capacità trasformante e alla fine si scoprì che il materiale ereditario che determina la presenza della capsula di polisaccaridi e quindi la virulenza delle cellule batteriche era il DNA.

Esperimenti di Hershey e Chase

Nonostante fosse già stato scoperto che il DNA fosse in grado di modificare geneticamente le proprietà della superficie batterica, la sua validità universale venne sancita nel 1952 da Hershey e Chase dimostrando che anche nei virus il materiale ereditario era rappresentato dagli acidi nucleici e non dalle proteine. Questi due condussero un esperimento che permise loro di provare che anche nel batteriofago T2, un virus che parassita i batteri, il materiale ereditario era rappresentato dagli acidi nucleici. Il concetto alla base del loro esperimento è che l’infezione fagica deve comportare l’introduzione nelle cellule batteriche di specifiche informazioni genetiche che controllano la moltiplicazione delle cellule virali. I fagi hanno infatti una costituzione molecolare semplice, la maggior parte della loro struttura esterna è costituita da proteine mentre gli acidi nucleici sono contenuti all’interno.

Riguardo agli elementi costitutivi era noto che il fosforo non fosse presente nelle proteine ma che invece rappresentasse un costituente del DNA e che lo zolfo al contrario facesse parte della struttura delle proteine. Dopo i risultati ottenuti da Avery e collaboratori con i batteri, l’obiettivo di questo esperimento era verificare che il batteriofago T2 durante infezione inietti DNA ma non le proprie proteine. Hershey e Chase fecero sviluppare colonie del batterio E. coli in presenza di radio isotopi, in particolare alcune colonie di batteri vennero ottenute utilizzando terreni di coltura contenenti un isotopo radioattivo del fosforo (³²P) e uno del zolfo (³⁵S).

In un secondo momento i fagi vennero impiegati per infettare tali colonie di E. coli. In questo modo il radio isotopo del fosforo poteva essere incorporato nel DNA dei fagi e allo stesso modo quello del zolfo poteva essere incorporato nelle proteine dei fagi. Con questi due campioni di virus, uno radioattivo per il ³²P e uno radioattivo per il ³⁵S, vennero poi infettati batteri cresciuti su un terreno di coltura normale. Dopo circa 10 minuti, le colonie di E. coli, infettate dai fagi vennero sottoposte prima a vibrazione in un agitatore allo scopo di distaccare le teste e quindi i capsidi dei fagi delle cellule dei batteri e poi a centrifugazione al fine di separare le cellule batteriche dalle particelle fagiche. Il ricorso alla centrifuga per ottenere nelle provette un sedimento formato da cellule batteriche e un supernatante contenente essenzialmente particelle fagiche, a conclusione dell’esperimento, misurarono la radioattività nelle due frazioni residue.

La radioattività risultava concentrata nel sedimento vale a dire all’interno delle cellule batteriche, quando i batteri erano stati infettati con i fagi che avevano incorporato ³²P. Quando invece i batteri erano stati infettati con i fagi che avevano incorporato ³⁵S la radioattività veniva riscontrata soprattutto nel supernatante. Nel caso dei fagi marcati con ³²P, la maggior parte della radioattività individuata nelle cellule batteriche (sedimento) dimostrava che il DNA del fago era entrato nei batteri mentre nel caso dei fagi marcati con ³⁵S indicava che le proteine del fago non erano passate nei batteri. L’esperimento permise di concludere che solo il DNA era entrato nel batterio, le proteine del fago invece costituivano il materiale di rivestimento esterno.

Scoperta del materiale genetico nei virus

Nel 1956 fu dimostrato che anche nei virus il materiale genetico è costituito dagli acidi nucleici. Utilizzando il virus del mosaico del tabacco venne provato che il suo materiale genetico era rappresentato dall’RNA e non dal DNA. Questo virus denominato TMV cioè tobacco mosaic virus, è costituito da due componenti chimiche principali, acidi ribonucleici e proteine assemblati insieme a formare una struttura elicoidale. Una particella del virus del mosaico del tabacco include un singolo filamento di RNA avvolto a spirale e rivestito da 2130 subunità proteiche uguali.

Gierer e Schramm riuscirono a separare l’RNA del virus dall’involucro di proteine. Quando piante di tabacco erano inoculate usando tale RNA purificato, le foglie manifestavano le tipiche lesioni indotte da virus. Queste lesioni non venivano invece osservate quando le piante venivano invece inoculate con le proteine virali oppure con RNA trattato impiegando ribonucleasi. I risultati ottenuti indicavano che l’RNA era il materiale genetico del virus. Conrat e Singer riuscirono ad isolare le componenti proteiche e gli acidi ribonucleici da due diversi ceppi del virus TMV per poi riuscire a ricostruire particelle infettive unendo l’RNA di un ceppo virale con le proteine dell’altro ceppo e viceversa. Inoculi dei virus originali e di quelli riassemblati vennero infine impiegati per infettare foglie di tabacco e così fu possibile dimostrare che il tipo di lesione dipendeva dall’acido nucleico e non dalla proteina.

Il materiale ereditario doveva necessariamente contenere tutta l’informazione per la struttura e la funzione delle cellule in un organismo e doveva replicarsi accuratamente in modo che tutte le nuove cellule formatosi per divisione condividano lo stesso patrimonio genetico della cellula di partenza. Inoltre doveva possedere una struttura sufficientemente stabile ma allo stesso tempo in grado di subire cambiamenti ereditari cioè mutazioni.

Scoperte di Levene

Nel 1931 Levene dimostrò che gli acidi nucleici sono costituiti da grosse molecole che per idrolisi totale producono unità più semplici detti nucleotidi, ognuno dei quali è formato da un gruppo fosfato, uno zucchero pentoso e una base azotata. Il gruppo fosfato deriva da una molecola di acido fosforico. Gli acidi nucleici con cinque atomi di carbonio sono il ribosio e il deossiribosio, il primo ha un atomo di ossigeno in meno rispetto al ribosio in posizione 2’ cioè posizione due primo: C₅H₁₀O₄ e C₅H₁₀O₅.

Le basi azotate possibili sono 5 divise in due gruppi, purine e pirimidine, delle prime fanno parte l’adenina e la guanina che hanno una struttura a doppio anello, mentre delle seconde fanno parte citosina timina e uracile e hanno struttura a singolo anello. Ovviamente lo zucchero presente nel DNA è il deossiribosio mentre quello presente nell’RNA è il ribosio. Nel DNA possono trovarsi quattro diversi tipi di nucleotidi che differiscono tutti per la base azotata, così come nell’RNA. Tuttavia la timina è presente solo nel DNA e nell’RNA al suo posto è presente l’uracile. Il DNA è localizzato prevalentemente nel nucleo e rappresenta il costituente dei geni e quindi dei cromosomi insieme alle proteine mentre l’RNA è concentrato nel citoplasma in corrispondenza...