Microscopia e preparazione di vetrini istologici

Microscopia

Per effettuare studi a livello citologico ed istologico è fondamentale poter osservare le cellule che compongono tessuti. Queste non possono essere viste ad occhio nudo, per questo dobbiamo fare affidamento ad uno strumento che ci permette di osservare queste immagini in modo chiaro. Questo strumento è detto microscopio.

Tipi di microscopi

Microscopio ottico

È il più comune. È costituito da due sistemi di lenti: un oculare (più vicino all’occhio dell’osservatore) e l’obiettivo (più vicino all’oggetto). L’obiettivo crea una prima immagine, detta immagine intermedia IR, che è reale e ingrandita. Se l’oculare è posto in modo tale che l’IR cada all’interno della sua distanza focale, si crea una seconda immagine, detta immagine virtuale, che è sempre ingrandita ma capovolta rispetto all’oggetto. Il rapporto tra le dimensioni dell’immagine finale e quelle dell’oggetto è l’ingrandimento ottenuto e il potere risolutivo è sostanzialmente la capacità del microscopio di ingrandire un’immagine senza che essa diventi sfocata. La sua struttura è costituita da una base, un condensatore (concentra la luce in una zona del preparato), un tavolino, un obiettivo, una lampada ed un tubo.

Microscopio a fluorescenza

Il preparato viene illuminato con una luce ultravioletta e i suoi componenti vengono analizzati in base alla fluorescenza emessa (la fluorescenza è la proprietà di alcune sostanze di assorbire radiazione UV e riemettere radiazioni visibili. Si parla di autofluorescenza quando i composti biologici emettono naturalmente fluorescenza, di fluorescenza indotta, invece, quando i componenti biologici emettono fluorescenza soltanto dopo essere stati marcati da fluorocromi).

Microscopio confocale

Permette di osservare un preparato nella sua tridimensionalità, focalizzandosi su un solo strato per volta e poi ricreando un’immagine 3D al computer. La sorgente luminosa è un laser e si possono osservare cellule e tessuti in vivo.

Microscopio a campo oscuro

Le cellule viventi prive di pigmenti non sono chiaramente visibili al microscopio “con uno sfondo chiaro” per la scarsa differenza di contrasto che esiste tra le cellule e l’acqua. Il microscopio a campo oscuro si ottiene facendo apparire le cellule del campione chiare su sfondo scuro.

Microscopio a contrasto di fase

Sfrutta l’interferenza tra la luce diretta proveniente dalla sorgente e quella deviata dal preparato. Viene usato spesso per studiare tessuti biologici poiché ha il vantaggio di non dover ricorrere a coloranti consentendo l’osservazione di preparati viventi.

Microscopio polarizzatore

È un microscopio ottico la cui sorgente di luce per l’osservazione dei campioni è stata polarizzata.

Microscopio elettronico a trasmissione

Il campione esaminato viene investito da un fascio di elettroni. L’immagine ottenuta è data dagli elettroni che hanno attraversato le zone elettrontrasparenti del preparato. Con questo strumento non si può osservare la materia viva.

L’occhio umano percepisce fra due oggetti una distanza minima di 100 um (0,1 mm), un microscopio ottico una distanza minima di 200 nm (0,2 um) e uno elettronico una di 1 nm.

Preparazione di un vetrino istologico

Questo processo può essere suddiviso in più fasi:

• Prelievo: processo che permette di individuare e isolare il campione
• Fissazione: consiste nel trattamento del campione biologico in modo tale che questo non si alteri e risulti il più simile possibile alla materia vivente. La fissazione può avvenire sia mediante metodi chimici che fisici.

Metodi chimici

Ha una durata di 12-24 ore, prevede l’impiego di agenti stabilizzanti che penetrano rapidamente la membrana cellulare e immobilizzano tutto il materiale macromolecolare, formando legami trasversali fra le catene proteiche adiacenti, immobilizzandole nella loro posizione. Tra i fissativi si possono riconoscere:

• Fissativi coagulanti proteine, ad esempio acido acetico, etanolo, ecc…
• Fissativi non coagulanti proteine, ad esempio formalina neutra tamponata, liquido di Bouin, tetrossido di osmio, bicromato di potassio, ecc…