Appunti Microscopia

PHOTOACTIVATION

Si parla di fotoattivazione quando abbiamo fluorofori che diventano attivi ovvero sono

fluorescenti quando sono eccitati grazie ad un cambiamento strutturale. Sono cioè

molecole che normalmente non sarebbero fluorescenti. Con l’illuminazione viene

indotto un cambio strutturale che le rende fluorescenti.

TIRF (total internal reflection fluorescence)

La riflessione totale interna è un fenomeno che è molto importante in quanto permette

di fare imaging in particolare della zona del campione che è a stretto contatto con il

vetrino.

Si prende fluorescenza nella zona sottile

a pochi nm dal porta-oggetto. È uno dei

metodi che elimina la fluorescenza di

background delle zone che non sono nel

nostro piano focale.

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Si sfrutta il fenomeno dell’onda evanescente indotta cioè un’onda elettromagnetica

che si forma in una regione limitata del campione direttamente adiacente

all’interfaccia tra 2 mezzi con indice di rifrazione diverso ovvero il vetrino e il

campione. Principi funzionamento: quando il laser incontra

l’interfaccia, almeno una porzione della luce viene

confinata all’interno del mezzo con indice maggiore

ovvero viene rifratta nel mezzo. Esiste un angolo di

incidenza critico oltre cui l’onda è tutta riflessa nel

primo mezzo. Perciò lavorando in tirf l’angolo di

incidenza deve essere superiore all’angolo critico in

modo da non avere luce eccitatrice che esce dal

vetrino andando nel campione ma deve essere tutta

rifratta nel campione. Ma se tutta la luce viene rifratta come viene eccitato il

campione? La luce non passa nel campione ma quella riflessa genera un campo

elettromagnetico molto ristretto nella zona dell’interfaccia. Questo campo

evanescente o onda evanescente ha la stessa lunghezza d’onda dell’onda eccitatrice e

la sua intensità decade in modo esponenziale con la distanza dall’interfaccia quindi si

può estendere per poche centinaia di nm nel campione. Perciò l’onda evanescente

eccita solo i fluorofori che sono all’interfaccia. Si studiano ad es dinamiche di

membrana, adesione … si studiano es processi alla superficie cellulare, membrana

plasmatica DINAMICHE DI MEMBRANA!



SUPER-RESOLVED FLUORESCENCE MICROSCOPY (microscopia super risolta)

Si indica indicano una serie di tecniche impiegata in microscopia ottica, in particolare

tecniche di fluorescenza, che permettono alla microscopia ottica di superare il limite di

risoluzione dettato dal limite di rifrazione. Applicando queste tecniche in fluorescenza

si ottengono immagini a risoluzione migliore di quella classica dei 200 nm.

Le tecniche sono:

1- SIM

2- STED

3- PALM-STORM

STED (stimulated emission depletion microscopy)

Cosa significa fare uno spegnimento dell’emissione? se in assorbimento vado a colpire

la molecola con fotoni che hanno l’energia quindi lunghezza d’onda dell’emissione, si

spegne l’emissione perché si fa interagire la molecola allo stato eccitato con il fotone

di lunghezza d’onda comparabile con la differenza di energia tra il gran state dello

stato eccitato e lo stato fondamentale e così si riporta la molecola allo stato

fondamentale senza emissione di fluorescenza. Quindi eccitando la molecola con una

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certa lunghezza d’onda e contemporaneamente fornisco il fotone compatibile con la

differenza tra i due stati allora spengo la fluorescenza ottenendo immagine buia.

Si hanno 2 laser, quello di eccitazione tradizionale e il sted laser che fornisce i fotoni

detti rossi perché vanno verso energie minori quindi verso l’infrarosso. Anche lo sted

laser viene focalizzato sul campione ma, non è una semplice sovrapposizione dei due

laser. Lo sted laser passa attraverso una maschera che ha una specie di chiusura

interna/ filtro, che fa passare tutta la luce del laser sted tranne una piccola porzione

centrale ovvero fa un’illuminazione a forma di ciambella. Nella zona centrale non si va

a spegnere fluorescenza e quindi quella è l’unica parte che osserveremo.

La microscopia a fluorescenza sted è una tecnica a scansione: avremo il campione

eccitato e spento. Avremo sempre una piccola regione con fluorescenza e attorno le

altre zone saranno spente. La zona da cui ottengo fluorescenza dipende dalla

dimensione del buco della ciambella e quindi dalla maschera che blocca la luce sted.

Spostando lungo il campione il sistema si hanno un certo numero di immagini che poi

unite mi danno l’immagine a fluorescenza ad alta risoluzione.

MICROSCOPIA ELETTRONICA

La microscopia elettronica è la tecnica da elezione per visualizzare oggetti nanometrici

e risolvere dettagli in questa scala dimensionale. Il microscopio elettronico ha due

varianti: a trasmissione TEM e a scansione SEM. Si differenzia da quello ottico per la

sorgente che nell’ottico è una

luce visibile, nell’elettronico è

un fascio di elettroni accelerato.

Si ottengono immagini in scala

di grigi che sono in seguito

colorate.

Confronto tra i microscopi:

nel microscopio ottico ho come

sorgente una lampada (già

viste) o laser/ led. In quelli

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elettronici avremo una fonte/sorgente di elettroni. Nell’ottico ho poi il condensatore, il

campione, la lente obbiettivo dopo cui ottengo un’immagine ingrandita e capovolta e

poi l’oculare dopo il quale ottengo immagine orientata correttamente e ancora più

ingrandita. Nell’elettronico a trasmissione il funzionamento è molto simile. In quello a

scansione, dopo il primo condensatore e prima di intercettare il campione abbiamo

uno scanning coil che permette di fare una scansione del campione. Mentre nella

trasmissione si osservano gli elettroni che passano attraverso il campione, nella

scansione si opera su oggetti non in sezione ma massivi. Quindi gli elettroni non sono

trasmessi ma ho 2 tipi di elettroni: retrodiffusi e secondari (emessi dal campione in

seguito a interazione con elettroni del fascio primario). Le ottiche nei microscopi

elettronici non sono di vetro/quarzo ma devono poter interagire col fascio e quindi

sono elettromagnetiche (es condensatori/lenti elettromagnetiche).

L’immagine al TEM è 2D, nel SEM è 3D. Le informazioni che possiamo ottenere

lavorando con microscopi elettronici:

1- Topografiche: posso studiare caratteristiche della superficie dell’oggetto.

2- Morfologiche: forma, dimensioni particelle del materiale.

3- Composizionali : segnali a seconda ad es del Peso atomico degli elementi.

4- Informazioni cristallografiche: sull’arrangiamento degli atomi nel materiale che

osserviamo (relazione diretta con le proprietà del materiale es forme

allotropiche del carbonio).

Nel microscopio ottico si muove la lente rispetto all’oggetto per avere varie immagini.

Nell’elettronico si agisce sulla corrente che passa attraverso le spire delle lenti

elettromagnetiche. Nell’ottico si vede il campione tramite oculare, nell’elettronico

invece si vede l’immagine non a occhio nudo ma tramite una camera digitale o

schermo fluorescente. Si può anche impressionare una lastra fotografica e ottenere

foto. Inoltre i microscopi elettronici funzionano solo sottovuoto perché gli elettroni non

devono interagire con nulla.

La risoluzione dell’occhio umano è limitata. Risoluzione e ingrandimento sono concetti

diversi. Posso ingrandire molto ma non ottenere comunque dei buoni dettagli. Dettagli

molto fini dipendono dalla tecnica che si utilizza. Con il microscopio elettronico ho

molta più risoluzione. La risoluzione dipende dalla lunghezza d’onda che si usa. Più

bassa è la frequenza, minore sarà la risoluzione che possiamo avere dell’immagine. ad

alte frequenze aumentiamo la risoluzione. La microscopia ottica ha limite di risoluzione

che dipende dall’apertura numerica dell’obbiettivo e dalla lunghezza d’onda. Il potere

di risoluzione massimo nella microscopia ottica è 200 nm ad eccezione delle tecniche

super-risolte.

In microscopia elettronica concetto chiave è l’elettrone. La lunghezza d’onda degli

elettroni è data da un’equazione in funzione di massa, carica e voltaggio applicato.

h

λ= √ 2 mqV

Come si arriva a questa formula? usando

il fascio di elettroni come sorgente ci

rifacciamo al dualismo onda particella.

L’elettrone è considerato quindi onda-

particelle la cui quantità di moto p è

correlata alla lunghezza d’onda tramite

Plank: 57

h

λ= p

In un microscopio elettronico la p dell’elettrone è dovuta alla differenza di potenziale

che lo accelera e quindi impartendo una certa energia cinetica. Uguagliando l’energia

cinetica e quella potenziale si fanno una serie di sostituzioni 

Inoltre la velocità dell’elettrone non è trascurabile rispetto alla velocità della luce !!!

siamo in un sistema RELATIVISTICO. Si corregge la formula in questo modo.

All’aumento di V potenziale di voltaggio degli elettroni, diminuisce la lunghezza

d’onda. h

λ= √ [ ]

( )

eV

2 m eqV 1+

0 2

2m c

0

la risoluzione può essere atomica.

Come ottengo il fascio di elettroni accelerato?

Tipologie di sorgenti sono 3:

1- Filamenti di tungsteno;

2- Filamenti di esaboruro di lantanio (cristallo);

3- Field emission gun (FEG);

Le differenze sono legate alla brillantezza della sorgente e ai costi.

Si ha comunque un filamento che emette elettroni che vengono raccolti dall’anodo e

poi partono e sono accelerati in colonna. Si hanno sempre delle electron gun (sorgente

di elettroni) che formano un fascio di elettroni collimato e controllato, che deve essere

focalizzato a livello del campione.

Possiamo distinguere tra sorgenti termoioniche e field emission gun.

Funzionamento sorgente termoionica (filamento di tungsteno o cristallo di esaboruro di

lantanio). Entrambi vanno riscaldati tramite il filamento. Il riscaldamento del filamento

fa sì che gli elettroni vengano emessi dal catodo e siano raccolti e accelerati tramite

un voltaggio applicato all’anodo. Questo voltaggio è di solito fino a 50 kV nel SEM e

500 kV nel TEM.

Nella field emission gun, non ho il filamento ma ho una sorgente molto affilata,

appuntita. Nel caso di una field emission gun di tungsteno, la punta sarà un aghiforme

molto sottile con raggio < 0.1 micron. In questo caso si forma alla punta un campo

elettrico molto forte e gli elettroni sono espulsi e collimati e accelerati lungo la

colonna.

Nelle sorgenti ovviamente serve il vuoto anche per evitare ossidazione del filamento. Il

vuoto nella field emission è anche maggiore per evitare il bombardamento alla punta

di gas residui. 5