Microscopia

PROTEINA CHIMERICA.

Questo è importante perché mi permette di rendere fluorescente una proteina, quindi si per

microscopia vogliamo individuare dove si localizza una proteina possiamo far produrre alla cellula

una proteina chimerica fluorescente e quindi in base a dove si osserva codesta fluorescenza

possiamo stabilire dove si trova la proteina. Questo è ciò che si chiama “ fluorescenza diretta“,

perché la proteina è chiusa alla proteina fluorescente e quindi è lei che diventa fluorescente in

modo diretto.

Inoltre…

Io posso far esprimere alla cellula anche 2,3 proteine diverse con 2, 3 proteine fluorescenti diverse

chiamano spettri diversi e quindi io all’interno della cellula contemporaneamente posso stabilire

dove sono situate queste proteine e soprattutto le posso distinguere perché la luce che serve ad

eccitare una determinata proteina sarà differente da quella che servirà ad eccitarne un’altra.

Per vedere come appaiono i vari compartimenti all’interno di una cellula si può utilizzare una sorta

di trucchetto, ovvero far utilizzare alla cellula una proteina chimerica fluorescente. Questo tipo di

espressione si chiama ESPRESSIONE ESOGENA.

INVECE…

L’ ESPRESSIONE ENDOGENA è quando la cellula produce da se stessa una proteina.

Poi ci sono una serie di proteine che spesso vengono utilizzate con funzione di

“marcatori degli organelli intracellulari”. Ma questo perché?

Perché come detto prima ogni proteina svolge la propria funzione solo in un determinato

organello, quindi una volta che viene prodotta deve essere smistata in maniera precisa, selettiva,

quindi vuol dire che quella determinata proteina si trova in quel determinato compartimento e

non in un altro.

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Ex. Spesso la CALNEXIN viene utilizzato come marcatore del reticolo endoplasmico, ovviamente

non soltanto essa perché nel reticolo ci sono tante altre proteine.

Il reticolo quindi si riconosce quando una

proteina fluorescente di quel

compartimento gli mostra quello che è il

“contorno del nucleo”. Perché come

vedremo successivamente li membrane del

reticolo sono in continuità con quelle

nucleari perciò si marca il contorno del

nucleo.

Poi c’è anche una regione del citoplasma

che è una sorta di rete dove all’interno si

trovano le proteine. Per quanto riguarda invece il GM130 è

uno dei 15 marcatori dell’apparato del Golgi. Ha una localizzazione vicino al nucleo, quindi una

localizzazione perinucleare spesso a forma di mezzaluna ma non sempre perché dipende dai vari

tipi cellulari infatti ad esempio a volte in alcune cellule è molto più compatto oppure in altri casi è

molto più a mezzaluna, in altri casi ancora è del tutto intorno al nucleo. E poi perché è positivo a

questo marcatore, perciò ci sono i marcatori perché spesso se uno potesse guardare con i propri

occhi gli organelli sarebbe difficile distinguere le membrane perché sono tutte molto vicine E

quindi per capire dove inizia e dove finisce un compartimento l’approccio migliore è utilizzare il

concetto di fluorescenza con delle proteine che risiedono in cui determinati compartimenti in

modo da avere una sorta di spazio buio e di poter accendere soltanto quella determinata proteina

e di fatto quel determinato compartimento.

Per quanto riguarda invece i mitocondri hanno come marcatore il TOM. Il Tom sarebbe il

traslocatore e della membrana esterna (poi lo vedremo più avanti meglio). I mitocondri appaiono

come delle strutture più allungate che non hanno una struttura sferica o come spesso viene

rappresentata sui libri come una forma di fagiolo. In realtà il mitocondrio attivo ha una forma

molto più allungata, quando non funzionano bene sono piccoli e frammentati e non

necessariamente solo quando non funzionano bene ma dipende dal grado di attività. Questo

perché anche i mitocondri che funzionano poco e quindi che non è che non funzionano bene

appaiono frammentati, un po’ più piccolini.

Infatti una delle caratteristiche morfologiche che ci permette di distinguere una cellula sana da

una non sana, tumorale, è una cosa del genere: le cellule tumorali fanno molta più glicolisi per fare

ATP piuttosto che utilizzare la catena di trasporto degli elettroni, dunque hanno meno bisogno di

mitocondri. Infatti nelle cellule tumorali i mitocondri tendono ad essere più frammentati mentre

normalmente una cellula sana tende ad avere mitocondri più allungati, di fatto è una cellula che fa

molta respirazione aerobica.

Per quanto riguarda invece i lisosomi abbiamo il marcatore di tipo: LAMP1, è una proteina

transmembrana e come abbiamo detto prima ciò che riusciamo a distinguere sono dei puntini

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luminosi. Anche lisosomi hanno una forma sferica e ed essendo una transmembrana dobbiamo

colorare soltanto il contorno della sfera perché è come se la sfera del nucleo sia vuota, non viene

colorata, non è illuminata (anche se in realtà non è vuota). E quindi la proteina illuminata ovvero

quella che dà luce sta solo sulla periferia, come se colorassimo soltanto la circonferenza di una

sfera che dentro resterebbe non colorata, buia, spenta. Dato che nell’immagine della slide viene

guardata soltanto una sezione dovremmo poter vedere tanti cerchietti ma realtà i cerchietti non li

vediamo e la maggior parte sono dei puntini proprio perché la distanza tra due proteine tra un

punto e l’altro della sfera è al di sotto del limite di risoluzione del microscopio, vedo tutta una

sfera luminosa. Se il microscopio fosse più risoluto vedrei, appunto, dei cerchietti con un punto

nero dentro. Con il microscopio utilizzato forse riusciamo a vedere qualche cerchietto ma soltanto

perché quella sfera è più grande rispetto alle altre e quindi il potere di risoluzione di questo

microscopio ci permette di vedere il cerchietto con il buco ma non la sfera piena come negli altri

casi (essendo troppo piccoli).

Nell’ultimo caso invece vediamo quella che è la struttura del citoscheletro della cellula, in

particolare solo il citoscheletro della tubulina, meglio dire micro-tubulina (E poi vedremo che ci

sono tre tipologie di strutture citoscheletriche nella cellula e questa è soltanto una di quelle). In

questo caso la proteina che viene utilizzata per marcare queste strutture e la ALFA-TUBULINA.

Infatti i micro tubuli sono costituiti in particolar modo da alfa e beta tubulina ma questo lo

vedremo successivamente. Quindi se io rendo fluorescente una di queste proteine e ciò mi

permette di osservare tale struttura.

Il trucchetto di far esprimere alle cellule una proteina fluorescente lo posso utilizzare anche per

comprendere meglio quella che è la dinamica della cellula.

Questa è un’immagine molto più risoluta sul reticolo

endoplasmico. Prima non si distinguevano le maglie nel

miglior modo possibile ma ora si riesce a vedere bene tutta

questa rete ed ognuno di questa sorta di filamenti è un

tubo, un cavo, un compartimento all’interno deve essere

ovviamente cavo.

● Un’altra cosa che si

può fare è seguire una proteina e vedere come si sposta all’interno della cellula.

Ad esempio una proteina che solitamente troviamo sulla membrana plasmatica, per

arrivare a tale membrana plasmatica deve passare per la via secretoria. La via secretoria

parte dal reticolo endoplasmico, quindi è lì che devono accedere queste proteine, le quali

proteine vengono smistate in delle vescicolette di trasporto, che viaggiano sui microtubuli,

arrivano al golgi e poi alla membrana plasmatica.

Quindi questo processo non ci dà soltanto delle informazioni su dove deve arrivare e

passare ma anche sulla cinetica, ovvero voglio capire quanto ci mette a svolgere questo

cammino e quanto ci metti invece in presenza di una mutazione, ovviamente più

lentamente.

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Uno dei problemi di questa tipologia di trucchetto (la fluorescenza) è che spesso quando si fa

esprimere qualcosa ad una cellula, in questo caso una proteina fluorescente, la stessa proteina

verrà espressa a dei livelli più alti sicuramente.

Questo ovviamente in alcuni casi può non comportare nulla ma in altri potrebbe essere un

problema perché alcune funzioni cellulari dipendono proprio da quella che è la quantità della

proteina espressa, quindi in alcuni casi io non posso far esprimere alla cellula la proteina a livelli

più alti perché altrimenti potrei modificare quella che è la fisiologia della proteina stessa o

addirittura in alcuni casi l’attività di quella proteina. Tendenzialmente in parole più semplici spesso

non posso “esagerare” perché potrei star alterando qualcosa. (Infatti per avere delle conferme

spesso non si fa soltanto un esperimento ma se ne fanno tanti a livelli differenti).

Inoltre un altro problema potrebbe sussistere proprio nella formazione di una proteina chimerica,

abbiamo visto che ogni catena polipeptidica ha una estremità N-terminale ed un’estremità C-

terminale quindi per costruire una proteina chimerica devo estendere una di queste due

estremità. A volte però questo non è possibile ovvero aggiungere un pezzo di una proteina ad

un’altra può cambiare la natura della proteina stessa, può influenzare il folding di una proteina.

Ancora… molte proteine per localizzarsi nel posto giusto della cellula devono esporre delle

“sequenze segnale“, molte di queste sequenze spesso sono terminali e questo significa che

possono funzionare soltanto se si trovano all’estremità C-terminale o a quella N-terminale. Quindi

aggiungere un pezzo in più significherebbe farle perdere questa localizzazione all’estremità della

proteina perché sta dentro e quindi potrebbe non funzionare più, potrebbe cambiare la

localizzazione della proteina. Per questo c’è bisogno sempre di più approcci quando si fanno

queste cose e non uno solo.

Un’altra cosa che si può fare proprio per evitare questo problema è quello di utilizzare un

approccio alternativo che prende il nome di IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA. In questo caso

l’immunofluorescenza indiretta perché io stabilisco dov’è la proteina sulla base di dove si fanno

posizionare gli anticorpi, perciò si chiama immunofluorescenza perché utilizza anticorpi.

Questo dà un vantaggio ovvero quello di poter osservare la localizzazione di una proteina a livello

fisiologico perché in questo caso non sto esprimendo quella che è la proteina. Per questo motivo è

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