Nozioni di microscopia

FISSAZIONE

La fissazione serve ad evitare che il campione prelevato perda le sue

caratteristiche fisiche e chimiche a contatto con l'ambiente, che non presenta le

condizioni fisiologiche adatte alla sua sopravvivenza.

Fissazione chimica = utilizza dei fissatori chimici (sostanze chimiche)

o scelte in base al risultato che si vuole ottenere.

Nella fissazione chimica si procede immergendo il campione prelevato o in

una soluzione di alcol etilico (se si vuole che i lipidi si perdano) o in aldeidi

(se si vuole che il tessuto da studiare conservi i lipidi) più precisamente

formaldeide glutaraldeide

per MO e per ME.

Fissazione fisica = consiste nel congelamento del campione. Questo

o congelamento sfrutta le proprietà dell'azoto liquido che per essere tale deve

essere ad una temperatura di -170°C. questa bassa temperatura permette il

congelamento del tessuto senza gravi perdite delle caratteristiche delle

cellule che lo compongono. I campioni trattati con questa fissazione non

devono subire i processi di disidratazione e di inclusione.

Tuttavia entrambi i metodi presentano delle limitazioni, nella fissazione chimica

infatti la fissazione non è assai rapida come nella fissazione fisica e non sempre

rispetta l'integrità delle singole molecole. Nella fissazione fisica invece lo

svantaggio principale è rappresentato dal danneggiamento dell'organizzazione

complessiva infatti, le cellule sono composte per la maggior parte del loro peso di

acqua, che congelandosi formerà dei cristalli solidi di ghiaccio, che a loro volta

hanno un volume maggiore delle molecole di acqua liquida e tenderanno a

rompere le membrane cellulari. Fortunatamente l'impiego di temperature molto

basse, quali ad esempio quelle dell'N liquido evitano questi effetti catastrofici

congelando molto rapidamente il campione, che una volta scongelato può tornare

a svolgere le sue normali attività.

DISIDRATAZIONE-DIAFANIZZAZIONE

I campioni trattati con fissazione chimica devono essere disidratati e diafanizzati.

Disidratazione = eliminazione dell'acqua, che altrimenti renderebbe i

o tessuti molli e quindi sarebbe impossibile sezionarli, quindi il sezionamento è

tanto più efficace quanto minore è la concentrazione di acqua all'interno del

campione. La disidratazione può essere ottenuta tramite il passaggio del

campione attraverso varie soluzioni di alcol etilico con concentrazioni

sempre più elevate (70, 90, 95, 100%)

Diafanizzazione = serve a rendere il campione trasparente. Questo si

o ottiene immergendo il campione nello xilolo. Lo xilolo ha oltre proprietà

oltre che rendere trasparente il campione: solubilizza i lipidi e scioglie

l'etanolo.

INCLUSIONE

l'inclusione serve a dare al campione una consistenza tale da poter essere

tagliato. Questa consistenza è data dall'immersione del campione in particolari

sostanze che hanno la proprietà di essere liquide ad alte temperature e solide a

basse temperature, quindi le loro proprietà fisiche sono temperatura-dipendenti,

dall'immersione del campione in queste sostanze si ottiene un blocco solido

pronto per essere sezionato. Queste sostanze sono generalmente la paraffina

fusa (60°C), utilizzata maggiormente per la microscopia ottica in quanto non

servono sezioni molto sottili e la paraffina ha una consistenza più molle, e la

resina epossidica utilizzata maggiormente per la microscopia elettronica dalla

necessità che per questo tipo di microscopia servono sezioni molto sottili, e la

resina epossidica ha una consistenza più dura della paraffina.

SEZIONAMENTO

Il sezionamento del campione fissato per fissazione chimica, prevede il taglio

o tramite il microtomo (in un meccanismo automatico) del blocco ottenuto

per inclusione in diverse sezioni che devono avere lo stesso spessore (3-

10μm) tale da permettere alla luce di oltrepassare il campione e osservarlo

al microscopio.

Il sezionamento del campione fissato fisicamente è diverso, in quanto questo

o tipo di campione dopo essere fissato non necessita di essere disidratato e

incluso, in quanto essendo congelato, ha già una consistenza tale che lo

rende pronto per il sezionamento. I tagli vengono effettuati dal

criomicrotomo o criostato che oltre a tagliare il campione mantiene bassa

la temperatura per evitare che questi si scongelino. In seguito al taglio delle

sezioni il tessuto viene riportato a temperatura ambiente per essere colorato

e osservato.

COLORAZIONE

La colorazione ha una duplice importanza nella preparazione dei campioni, in

quanto li rende visibili conferendogli proprietà cromatiche, e l'affinità per i diversi

coloranti utilizzati evidenzia le proprietà e le funzioni del tessuto studiato. In altre

parole, rende possibile l'osservazione e l'interpretazione del campione.

Distinzione tra tecniche di colorazione e coloranti, per uno studio ottimale

dell'sitologia bisogna capire la differenza che esiste tra queste due classi.

Tecniche di colorazione: sono i modi in cui si utilizzano i diversi coloranti, a

 loro volta sono suddivise in:

Istologica: evidenzia le caratteristiche morfologiche, quindi la struttura

o Istochimica: evidenzia le caratteristiche chimiche. Tramite una reazione

o chimica il cui precipitato andrà a colorare il tessuto. È notevolmente più

precisa dell'istologica.

Immunoistochimica: evidenzia specificatamente gli antigeni presenti

o nelle cellule o nei tessuti.

Coloranti: sono dei diversi colori che possono essere utilizzati, in base alle

 tecniche utilizzate i coloranti si distinguono in

Bicromici

o Tricromici

o Elettivi

o

La colorazione per campioni fissati chimicamente simile a quella per i campioni

congelati, prevede il ripercorrersi dei passaggi dal sezionamento alla disidratazione al

contrario e la preparazione del vetrino con coloranti. Il vetrino viene inizialmente

trattato con una sostanza adesiva e lasciato ad asciugare, in seguito la sezione del

campione viene poggiata sul vetrino e immersa nuovamente in una soluzione di xilolo,

che in questo caso viene utilizzato per rimuovere la paraffina dato che adesso il

campione non deve essere ulteriormente sezionato e quindi non necessita più di

quella consistenza più "dura" che gli conferiva l'inclusione. Il passaggio successivo

quindi è la reidratazione, che prepara il vetrino alla successiva fase di colorazione

infatti i coloranti utilizzati sono idrofili (motivo per cui le gocciole lipidiche non si

colorano) favorendo così il legame del colorante con il campione, la reidratazione è

ottenuta immergendo il vetrino in soluzioni di alcol etilico con concentrazione sempre

minore (100, 95, 90, 70%).

TECNICA DI COLORAZIONE ISTOLOGICA azocarminio

Azan-Mallory = colorazione basata principalmente su tre colori:

 acidofilo)

che è un colorante basico (quindi permette quindi di colorare strutture

blu di alanina

acide quali il nucleo e in minore concentrazione il citoplasma;

basofilo): orange G

colorante acido (quindi colorante acido. Tuttavia è bene

ricordare che la colorazione Azan-Mallory è formato essenzialmente da due parti:

l'azocarminio e la miscela policroma di Mallory, formata da blu di alanina, Orange

G e acido ossalico.

Ematossilina-Eosina = colorazione maggiormente utilizzata in istologia, è una

 colorazione bicromica che sfrutta le proprietà acide e basiche delle cellule:

ematossilina eosina

colorante basico ed colorante acido. l'ematossilina colora

di viola il nucleo e il citoplasma delle cellule più attive (DNA E RNA ribosomiale),

l'eosina di rosso rosato/arancio il citoplasma e le strutture più basiche delle

cellule.

colorazione di Gomori = è una colorazione istologica elettiva, quindi colora

 colorante a base

specificatamente un solo componente. Ad esempio il

d'argento colora specificatamente le fibre reticolari. Le fibre sono quindi colorate

di nero su uno sfondo di tessuto grigio-giallastro.

Colorazioni Sudan III e Sudan Black = servono ad evidenziare le cellule

 Sudan III

adipose e le goccioline lipidiche in esso contenute. colora i lipidi di

Sudan Black

giallo, di nero. Queste colorazioni vengono applicate su campioni

sezionati con il criostato, in quanto in campioni fissati fisicamente c'è una minore

probabilità che i lipidi si siano dissolti.

Colorazione di Nissl = colorazione elettiva, colora specificatamente la zona

 tigroide di Nissl con il blu di Toluidina, su sezioni di paraffina di 10 μm di spessore.

Colorazione di Golgi-Cajal = colorazione specifica per il SNC. Un campione di

 SNC viene immerso per un periodo di tempo che varia da 1 a 6 giorni in una

soluzione osmio-bicromica a 25°C e successivamente in una soluzione di nitrato

di Ag (1%) per 3 giorni. Le sezioni sono ottenute dopo inclusione con paraffina e

risultano abbastanza spesse (30-40μ) in modo da ottenere una visualizzazione più

completa. Si tratta di una colorazione piuttosto difficile che presenta delle

problematiche ancora irrisolte, di solito si ottengono buoni risultati quando le

cellule nervose spiccano su uno sfondo color tabacco, mentre loro sono dotate di

un colore nero intenso.

May-Grunwald-Giemsa (MGG) = colorazione specifica per il sangue, su un

 campione ottenuto da uno striscio di sangue su vetrino, fatto asciugare per 30

minuti all'aria e un seguito colorato con la colorazione MG e lavato con Giemsa. Il

blu di metilene

May-Grunwald è formato da (colorante basico, acidofilo) e

eosina (colorante acido, basofilo), invece il Giemsa è formato da eosina, blu di

metilene, azzurro A e B e violetto di metilene. I globuli rossi saranno quindi

colorati di un rosa-arancio, mentre i nuclei dei globuli bianchi risulteranno colorati

di un blu violaceo.

TECNICA DI COLORAZIONE ISTOCHIMICA

Reazione PAS = mette in evidenza le mucine neutre, utilizza un ossidante,

 Acido Periodico , attacca in modo specifico il gruppo amminico primario o il

gruppo -OH delle mucine, liberando così gruppi aldeici delle mucine, messi in

Reattivo di Schif

evidenza dal colorante, il , solitamente questa reazione si

esegue insieme all'Alcian Blu, per avere un quadro completo delle mucine che

sono presenti nel preparato. Questa combinazione viene utilizzata per esempio in

campioni istologici ottenuti dallo stomaco, in quanto questo tessuto contiene

mucine a pH differenti. Alcian Blu

Alcian Blu = la colorazione mette in evidenza le mucine acide e i

 glicosamminoglicani (GAG), tramite l'attacco ai gruppi -COOH.

TECNICA DI COLORAZIONE IMMUNOISTOCHIMICA

Colorazione immunistochimica = sfrutta il legame antigene-anticorpo.

 l'anticorpo è trattato con un cromogeno, in seguito al legame antigene-antico