Citologia - microscopia

Introduzione alla microscopia

Ci sono molti tipi di cellule. La differenza tra procariote ed eucariote è l’organizzazione del nucleo; inoltre le cellule procarioti sono molto piccole. Ad esempio, i microplasmi sono batteri procarioti che vivono nelle cellule eucariote; sono grandi 200 nm e sono le cellule più piccole del mondo.

L’occhio umano ha una capacità di risoluzione (la risoluzione indica la capacità di distinguere due punti distinti; è un concetto differente da quello di ingrandimento) che non arriva a vedere la stragrande maggioranza delle cellule e i loro dettagli. Tipicamente ogni strumento di osservazione ha limiti dettati dalle caratteristiche fisiche che limitano la risoluzione. L’occhio umano discrimina punti distinti fino a 100 µm (un decimo di mm). Ci sono cellule più grandi del microplasma, come la cellula uovo del pollo, il tuorlo.

Ci sono altre cellule più grandi rispetto a quelle del corpo umano; solitamente sono organismi che hanno vita libera. Le cellule del corpo umano sono piccole, sotto il limite di risoluzione dell’occhio umano.

Prendiamo in esame alcune cellule: ad esempio, la cellula nervosa è particolare. Ha un corpo cellulare che comprende gran parte del volume della cellula e poi un lunghissimo prolungamento chiamato assone. Come lunghezza, la cellula nervosa può arrivare a un metro. Ciononostante, è così piccola da non essere rilevabile dall’occhio umano (almeno in maniera distinta). Vi sono i fibroblasti, poi le cellule di lievito della birra, piccole cellule eucarioti.

Microscopia

Come sono state scoperte le cellule?

Nel ‘700 sono stati visti per le prime volte organismi unicellulari, con la comparsa del microscopio; poi è stata affinata la teoria cellulare. Vi sono diversi tipi di microscopio: il microscopio ottico è uno degli strumenti d’eccellenza per l’osservazione della cellula, che avrete a disposizione nelle esercitazioni. È composto di lenti e utilizza una sorgente luminosa.

La luce passa per il condensatore e viene convogliata dalle lenti sul campione da osservare; passa poi all’obiettivo dove viene fatto fare un percorso ottico (più o meno rettilineo, a volte vi è un prisma che consente l’osservazione in posizione più comoda per gli occhi) e infine arriva all’oculare, ultimo sistema di lenti. Per osservare il campione in maniera adeguata bisogna sistemare la distanza del campione rispetto ad obiettivo e al condensatore in modo che l’oggetto sia a fuoco (vi sono delle rotelline che spostano il piano del vetrino).

Il potere di risoluzione (0,61*lambda/r*sin(teta)) di uno strumento viene definito da un’equazione dove lambda è la lunghezza d’onda della luce che usiamo per osservare il campione. La luce visibile varia da 700 a 400 nm di lunghezza d’onda; la luce visibile ci appare bianca perché nell’occhio sommiamo tutte queste lunghezze d’onda e ciò produce la sensazione del bianco.

La percezione del colore è infatti una sensazione dovuta alla sensibilità dei nostri fotorecettori che captano particolari lunghezze d’onda. Teta è l’indice di rifrazione del mezzo, tipicamente l’aria; l’aria è sfavorevole come mezzo di osservazione (sta tra l’oggetto e l’obiettivo). Per fare osservazioni ad alto ingrandimento si usano obiettivi che lavorano con l’olio; quindi tra la lente dell’obiettivo e l’oggetto c’è olio (nelle osservazioni gli obiettivi lavoreranno ad aria). Teta è metà dell’apertura angolare: cambia da obiettivo a obiettivo.

Il prodotto di r*sin(teta) si chiama apertura numerica. Con l’aria non è differente da 1, ma con l’olio può arrivare a 1,4. Più elevata è l’apertura numerica più si avrà una risoluzione alta. Ciò dev’essere associato con una bassa lunghezza d’onda: il max si ottiene con una luce violetta e con un obiettivo che lavora ad olio. Più basso sarà il valore della risoluzione più riusciremo a distinguere punti con minor distanza. Il massimo di risoluzione con un microscopio ottico è 0,2 µm; circa 1000 volte più piccolo di quello che vede un occhio.

Con un microscopio ottico vedo un uovo di rana (circa 1 mm, una capocchia di spillo). Una cellula di una pianta, circa 50 µm, non la si vede ad occhio nudo; si osserva col microscopio ottico (per esempio nei giochi per bambini con i microscopi vengono forniti dei vetrini con la sfoglia della cipolla dove si possono ben distinguere le cellule).

Il nome cellula deriva dall’osservazione di preparati vegetali: in tali organismi esse appaiono infatti come piccole cellette esagonali. Così via via arriviamo a livello dei batteri che sono cellule estremamente piccole. Fino a Pasteur non se ne conosce l’esistenza: si pensava fosse sporcizia nel preparato. Ma Pasteur dimostrò che quei microorganismi esistono; osservando bene i preparati con microscopi migliorati, riuscirono a individuare i batteri come puntini neri.

Nella coltura cellulare utilizziamo fiaschetti di plastica o in piastra Petri per moltiplicare le cellule; questi ambienti sono sterilizzati, senza batteri. Se per sbaglio vengono contaminati, essi si notano macroscopicamente come sabbietta.

Col microscopio ottico non vediamo i dettagli della cellula batterica; non si vedono per esempio i flagelli: vediamo al massimo un alone. Nella microscopia ottica, quando osserviamo una cellula dobbiamo tenere a mente una cosa: la maggior parte delle cellule sono trasparenti, perché sono composte al 70% d’acqua; quindi osservandole così come sono l’effetto non sarà molto differente dall’osservare acqua.

Se si è fortunati in un normale apparecchio di microscopia ottica riuscirete a distinguere i confini della cellula. Per esempio, se osservo un fibroblasto, non riesco a vedere molto bene la cellula. A volte se le cellule sono molto allargate si fa fatica a vedere i confini delle cellule; quando le cellule vanno incontro a senescenza (cioè morte) tipicamente si allargano moltissimo e diventano così piatte da non riuscire a capire il confine.

Sono stati inventati vari strumenti per aumentare il contrasto fra le varie parti della cellula, pur sempre osservando una cellula viva; perché uno dei grossi vantaggi della microscopia ottica è la possibilità di osservare cellule vive. L’idea è quella del contrasto di fase (in alto a destra nella foto sotto): la luce entra nella cellula in varie posizioni.