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Citologia - microscopia

Appunti di Citologia per l’esame del professor Zavan. Gli argomenti trattati sono i seguenti: la microscopia elettronica e a scansione, la preparazione del campione,
l'immunoistochimica, l'immunofluorescenza, il massimo di risoluzione con un microscopio ottico.

Esame di Citologia docente Prof. V. Zavan

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Introduzione alla Microscopia

Ci sono molti tipi di cellule. La differenza tra Procariote ed Eucariote è l’organizzazione del

nucleo; inoltre le cellule Procarioti sono molto piccole. Ad esempio i Microplasmi sono batteri

Procarioti che vivono nelle cellule Eucariote; sono grandi 200nm e sono le cellule più piccole del

mondo.

L’occhio umano ha una capacità di risoluzione (la risoluzione indica la capacità di distinguere due

punti distinti; è un concetto differente da quello di ingrandimento) che non arriva a vedere la

stragrande maggioranza delle cellule e i loro dettagli. Tipicamente ogni strumento di osservazione

ha limiti dettati dalle caratteristiche fisiche che limitano la risoluzione. L’occhio umano discrimina

punti distinti fino a 100um (un decimo di mm). Ci sono cellule più grandi del Microplasma, come la

cellula uovo del pollo, il tuorlo.

Ci sono altre cellule più grandi rispetto a quelle del corpo umano; solitamente sono organismi che

hanno vita libera. Le cellule del corpo umano sono piccole, sotto il limite di risoluzione dell’occhio

umano.

Prendiamo in esame alcune cellule: ad esempio la cellula nervosa è particolare. Ha un corpo

cellulare che comprende gran parte del volume della cellula e poi un lunghissimo prolungamento

chiamato Assone. Come lunghezza la cellula nervosa può arrivare a un metro. Ciononostante è così

piccola da non essere rilevabile dall’occhio umano (almeno in maniera distinta). Vi sono i

Fibroblasti, poi le cellule di lievito della birra, piccole cellule Eucarioti.

Microscopia

Come sono state scoperte le cellule?

Nel ‘700 sono stati visti per le prime

volte organismi unicellulari, con la

comparsa del microscopio; poi è stata

affinata la Teoria cellulare.

Vi sono diversi tipi di microscopio: il

microscopio ottico: è uno degli

strumenti d’eccellenza per

l’osservazione della cellula, che avrete

a disposizione nelle esercitazioni. È

composto di lenti e utilizza una

sorgente luminosa. La luce passa per il

condensatore e viene convogliata dalle lenti sul campione da osservare;

passa poi all’obiettivo dove viene fatto fare un percorso ottico (più o meno rettilineo, a volte vi è un

prisma che consente l’osservazione in posizione più comoda per gli occhi) e infine arrivare

all’oculare, ultimo sistema di lenti. Per osservare il campione in maniera adeguata bisogna

sistemare la distanza del campione rispetto ad obiettivo e al condensatore in modo che l’oggetto sia

a fuoco (vi sono delle rotelline che spostano il piano del vetrino).

Il potere di risoluzione (0,61*lambda/r*sin(teta)) di uno strumento viene definito da

un’equazione dove lambda è la lunghezza d’onda della luce che usiamo per osservare il campione.

La luce visibile varia da 700 a 400nm di lunghezza d’onda; la luce visibile ci appare bianca perché

nell’occhio sommiamo tutte queste lunghezze d’onda e ciò produce la sensazione del bianco. La

percezione del colore è infatti una sensazione dovuta alla sensibilità dei nostri fotorecettori che

captano particolari lunghezze d’onda. Teta è l’indice di rifrazione del mezzo, tipicamente l’aria;

l’aria è sfavorevole come mezzo di osservazione (sta tra l’oggetto e l’obiettivo). Per fare

osservazioni ad alto ingrandimento si usano obiettivi che lavorano con l’olio; quindi tra la lente

dell’obiettivo e l’oggetto c’è olio (nelle osservazioni gli obiettivi lavoreranno ad aria). Teta è metà

dell’apertura angolare: cambia da obiettivo a obiettivo.

Il prodotto di r*sin(teta) si chiama Apertura Numerica. Con l’aria non è differente da 1, ma con

l’olio può arrivare a 1,4. Più elevata è l’apertura numerica più si avrà una risoluzione alta. Ciò

dev’essere associato con una bassa lunghezza d’onda: il max si ottiene con una luce violetta e con

un obiettivo che lavora ad olio. Più basso sarà il valore della risoluzione più riusciremo a

distinguere punti con minor distanza. Il massimo di risoluzione con un microscopio ottico è

0,2um; circa 1000 volte più piccolo di quello che vede un occhio. Con un microscopio ottico vedo

un uovo di rana (circa 1mm, una capocchia di spillo). Una cellula di una pianta, circa 50um non la

si vede ad occhio nudo; si osserva col microscopio ottico (per esempio nei giochi per bambini con i

microscopi vengono forniti dei vetrini con la sfoglia della cipolla dove si possono ben distinguere le

cellule).

Il nome cellula deriva dall’osservazione di preparati vegetali: in tali organismi esse appaiono infatti

come piccole cellette esagonali. Così via via arriviamo a livello dei batteri che sono cellule

estremamente piccole. Fino a Pasteur non se ne conosce l’esistenza: si pensava fosse sporcizia nel

preparato. Ma Pasteur dimostrò che quei microorganismi esistono; osservando bene i preparati con

microscopi migliorati, riuscirono a individuare i batteri come puntini neri. Nella coltura cellulare

utilizziamo fiaschetti di plastica o in piastra Petri per moltiplicare le cellule; questi ambienti sono

sterilizzati, senza batteri. Se per sbaglio vengono contaminati, essi si notano macroscopicamente

come sabbietta.

Col microscopio ottico non vediamo i dettagli della cellula batterica; non si vedono per esempio i

flagelli: vediamo al massimo un alone. Nella microscopia ottica, quando osserviamo una cellula

dobbiamo tenere a mente una cosa: la maggior parte delle cellule sono trasparenti, perché sono

composte al 70% d’acqua; quindi osservandole così come sono l’effetto non sarà molto differente

dall’osservare acqua. Se si è fortunati in un normale apparecchio di microscopia ottica riuscirete a

distinguere i confini della cellula.

Per esempio se osservo un fibroblasto, non riesco a vedere molto bene la cellula. A volte se le

cellule sono molto allargate si fa fatica a vedere i confini delle cellule; quando le cellule vanno

incontro a senescenza (cioè morte) tipicamente si allargano moltissimo e diventano così piatte da

non riuscire a capire il confine.

Sono stati inventati vari strumenti per aumentare il contrasto fra le varie parti della cellula, pur

sempre osservando una cellula viva; perché uno dei grossi vantaggi della microscopia ottica è la

possibilità di osservare cellule vive. L’idea è quella del contrasto di fase (in alto a destra nella foto

sotto): la luce entra nella cellula in varie posizioni ed entra con le radiazioni alla stessa fase, cioè ad

ogni picco di una radiazione corrisponde un picco di quella vicina.

Il passaggio nella cellula porta un’interferenza perché la luce interagisce con le molecole della

cellula. Tanto più spessa sarà la cellula da attraversare, tanto più verrà modificata la fase della

radiazione. All’uscita, la fase della radiazione che ha attraversato una parte sottile della cellula verrà

modificata di meno della fase di una radiazione che ha attraversato una porzione più considerevole

di cellula. Il risultato è la comparsa di zone più chiare e scure. Vi sono diversi tipi di contrasto di

fase, per esempio l’interferenza di Nomarski (in basso a sinistra nella foto).

Il Campo Scuro (in basso a

destra nella foto) si ottiene

facendo un’illuminazione

dall’alto invece che dal basso.

Quindi non osserviamo più la

radiazione che attraversa la

cellula ma quella che viene

rifratta dalle strutture

cellulari. Si vedono p.e.

strutture vescicolari.

Il Campo Chiaro (in alto a sinistra nella foto) è l’attraversamento della radiazione luminosa senza

particolari accorgimenti.

Preparazione del campione

Nell’osservazione di un tessuto si prende un campione, e lo si rende sottile per essere percorso dalla

luce. Si usa il microtomo, strumento in cui il campione del tessuto

viene tagliato da una lama. Il campione viene inserito in un

supporto ceroso e viene tagliato (si può arrivare a 4um). Le sezioni

si depongono poi sul vetrino e si possono osservare al

microscopio; naturalmente avremo un preparato morto. Ciò

significa che il preparato viene fissato, cioè bloccato nella sua

condizione, in tre modi:

• impregnare il preparato di alcoli che estraggono acqua e impediscono l’idrolisi delle

molecole della cellula, distruggendo però alcune strutture;

• impregnare il preparato di aldeidi che formano legami trasformando il preparato istologico

in una specie di pezzo di plastica, bloccando le molecole nella posizione del decesso.

• congelamento : si usa il criostato, un microtomo che taglia preparati congelati. Si lasciano

seccare i preparati che poi non si decompongono.

Il colore dei preparati non è naturale: le cellule sono trasparenti. Le sezioni vengono colorate:

l’idea è che all’osservazione in microscopia ottica tutte le radiazioni vengono bloccate dalle cellule

colorate tranne quelle di una specifica lunghezza d’onda; ovvero le cellule bloccano tutte le

radiazioni tranne una. Si usano solitamente più coloranti per preparato, perché ogni colorante è

specifico per una struttura piuttosto che per un’altra. Si usano Ematossilina/Eosina (sopra nella

foto) e Azan-Mallory (sotto nella foto). A

esercitazione si rivedranno queste cose oltre a

spiegare bene queste colorazioni.

Per osservare un preparato tagliato col

microtomo a microscopia ottica è necessaria

una colorazione istologica. La colorazione

significa immergere il vetrino con le sezioni in

una soluzione contenente colorante; particolari

molecole nella cellula si impregnano e vanno a

creare legami forti con le molecole del

colorante per cui parte della sezione rimane

colorata e questo permette di distinguere parte delle strutture all’interno della sezione e delle

cellule.

Anticorpi

Per vedere dov’è la proteina di cui ci si sta occupando all’interno della cellula si possono usare gli

anticorpi.

Gli anticorpi si conoscono per il sistema immunitario: sono molecole proteiche che riconoscono i

patogeni, o comunque qualsiasi sostanza estranea al proprio corpo. Chi ha delle allergie, produce

anticorpi contro delle cose assolutamente innocue, come il polline.

Gli anticorpi hanno la particolarità di essere specifici per la molecola che vanno a riconoscere. Il

nostro sistema immunitario produce anticorpi contro diversi tipi di antigeni.

Quando, ad esempio, si prende il morbillo una volta, poi non lo si prenderà più. Questo perché il

nostro corpo comincia a produrre anticorpi contro il virus del morbillo, siccome gli anticorpi

nascono per evoluzione Darwiniana delle molecole originali di immunoglobuline.

Fondamentalmente il punto è questo: alla fine vengono prodotte delle proteine, dette appunto

anticorpi, che sono specifiche: riconoscono cioè specificamente le proteine che sono superficie del

virione (nel caso del virus del morbillo).

Immunoistochimica

L’idea degli istologi è stata quindi questa “posso far fare ad un animale (un coniglio ad esempio)

degli anticorpi contro la proteina che interessa a me. Gli inietto grandi quantità di una determinata

proteina e questo comincerà a immunizzarsi contro la proteina come se fosse un virus. Poi prelevo

il sangue da questo animale, purifico questi anticorpi avendo così un anticorpo specifico per

riconoscere la mia proteina”.

L’idea è quindi quella di avere una molecola, che si userà come reagente, come se fosse un

colorante, ma che mi riconosca non una classe di molecole, ma una specifica molecola!

Da qui deriva la immunoistochimica: far riconoscere la proteina dagli anticorpi, modificando gli

stessi anticorpi in maniera tale che mi producano un precipitato nero. Il risultato è questa immagine:

Qui (è una sezione della pelle) è stato usato un anticorpo contro una proteina che si localizza

specificatamente nel nucleo delle cellule. L’anticorpo, messo sopra la proteina, la riconosce

specificatamente. Poi, con una reazione chimica, si fa produrre un precipitato marrone/nero laddove

l’anticorpo si è legato alla mia proteina, e così posso riconoscere i nuclei delle cellule che

effettivamente producevano quella proteina. Quindi ottengo così due cose:

• Posso vedere quali cellule producono la proteina che mi interessa

• Dove queste proteine si localizzano dentro la cellula

Questa tecnica (immuno (anticorpi) isto (istologia) chimica (c’è un precipitato)), ha dei limiti.

Permette di osservare dove si localizza solo una molecola alla volta, perché se ne guardo più alla

volta potrei non distinguere i due precipitati neri (perché un precipitato può coprire l’altro).

Immunofluorescenza

Per risolvere questo problema, è stata inventata la immunofluorescenza, che è una modificazione

della microscopia a fluorescenza e che funziona secondo un principio differente da quello della

microscopia ottica normale.


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13

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AUTORE

peppotta

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+1 anno fa


DETTAGLI
Esame: Citologia
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in medicina e chirurgia 1 (ordinamento U.E. - 6 anni)
SSD:
Università: Padova - Unipd
A.A.: 2015-2016

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher peppotta di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Citologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Padova - Unipd o del prof Zavan Valeria.

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