Microscopia e preparazione di vetrini istologici

Microscopio ottico: uno strumento fondamentale per lo studio citologico ed istologico

Per effettuare studi a livello citologico ed istologico è fondamentale poter osservare le cellule che compongono tessuti. Queste non possono essere viste ad occhio nudo, per questo dobbiamo fare affidamento ad uno strumento che ci permette di osservare queste immagini in modo chiaro. Questo strumento è detto microscopio.

Esistono diversi tipi di microscopi, ma il più comune è il microscopio ottico. Esso è costituito da due sistemi di lenti: un oculare (più vicino all'occhio dell'osservatore) e l'obiettivo (più vicino all'oggetto). L'obiettivo crea una prima immagine, detta immagine intermedia IR, che è reale e ingrandita. Se l'oculare è posto in modo tale che l'IR cada all'interno della sua distanza focale, si crea una seconda immagine, detta immagine virtuale, che è sempre ingrandita ma capovolta rispetto all'oggetto. Il rapporto tra le dimensioni dell'immagine finale e

quelle dell'oggetto è l'ingrandimento ottenuto e il potere risolutivo è sostanzialmente la capacità del microscopio di ingrandire un'immagine senza che essa diventi sfocata. La sua struttura è costituita da una base, un condensatore (concentra la luce in una zona del preparato), un tavolino, un obiettivo, una lampada ed un tubo.

Il preparato viene illuminato con una luce ultravioletta e i suoi componenti vengono analizzati in base alla fluorescenza emessa (la fluorescenza è la proprietà di alcune sostanze di assorbire radiazione UV e riemettere radiazioni visibili. Si parla di autofluorescenza quando i composti biologici emettono naturalmente fluorescenza, di fluorescenza indotta, invece, quando i componenti biologici emettono fluorescenza soltanto dopo essere stati marcati da fluorocromi).

Il microscopio a fluorescenza permette di osservare un preparato nella sua tridimensionalità, focalizzandosi su un solo

strato per volta e poi ricreando un’immagine 3D al computer. La sorgente luminosa è un laser e si possono osservare cellule e tessuti in vivo- le cellule viventi prive di pigmenti non sono chiaramente visibili al microscopio “con uno sfondo chiaro” per la scarsa differenza di contrasto che esiste tra le cellule e l’acqua. Il microscopio a campo oscuro si ottiene facendo apparire le cellule del campione chiare su sfondo scuro- sfrutta l’interferenza tra la luce diretta proveniente dalla sorgente e quella deviata dal preparato. Viene usato spesso per studiare tessuti biologici poiché ha il vantaggio di non dover ricorrere a coloranti consentendo l’osservazione di preparati viventi- è un microscopio ottico la cui sorgente di luce per l’osservazione dei campioni è stata polarizzata- Il campione esaminato viene investito da un fascio

Il microscopio elettronico a trasmissione utilizza elettroni per creare un'immagine. Gli elettroni attraversano le zone elettrontrasparenti del campione, generando l'immagine. Con questo strumento non è possibile osservare la materia vivente.

L'occhio umano percepisce una distanza minima di 100 um (0,1 mm) tra due oggetti, mentre un microscopio ottico ha una distanza minima di 200 nm (0,2 um) e un microscopio elettronico di 1 nm.

La preparazione di un vetrino istologico può essere suddivisa in diverse fasi:

1. Prelievo: processo che permette di individuare e isolare il campione
2. Fissazione: trattamento del campione biologico per preservarlo e renderlo simile alla materia vivente. La fissazione può avvenire attraverso metodi chimici o fisici e richiede 12-24 ore e l'uso di agenti stabilizzanti.

I metodi chimici penetrano rapidamente la membrana cellulare e immobilizzano il materiale macromolecolare.

formando legami trasversali fra le catene proteiche adiacenti, immobilizzandole nella loro posizione. Tra i fissativi si possono riconoscere: 1. Fissativi coagulanti proteine, ad esempio acido acetico, etanolo, ecc... 2. Fissativi non coagulanti proteine, ad esempio formalina neutra tamponata, liquido di Bouin, tetrossido di osmio, bicromato di potassio, ecc... In generale, quindi, non esiste un fissativo universale, ma bisogna sempre scegliere quello più adatto. La fissazione può avvenire per: 1. La procedura fissativa più largamente utilizzata è l'immersione: consiste nell'immersione di un campione di piccole dimensioni dell'ordine di alcuni mm3, appena prelevato, nel liquido fissativo. 2. La procedura che permette di fissare organi più voluminosi è la perfusione: è limitata ad animali di piccole dimensioni ed è particolarmente raccomandata nello studio di organi facilmente deteriorabili, come l'encefalo. Questa consiste nel veicolare il liquido fissativo attraverso i vasi sanguigni dell'organo.

fissativo attraverso il sistema circolatorio dell'organismo, raggiungendo attraverso questa via ogni cellula del distretto corporeo.

Un'alternativa all'impiego di fissativi chimici ed alcoli è rappresentata dai metodi fisici:

- dal congelamento in azoto liquido (-170°C), che consente di stabilizzare il materiale biologico in funzione della rapidità e della maggior preservazione dell'antigenicità del tessuto in esame. Il congelamento permette inoltre di mantenere nei tessuti i depositi di lipidi che vengono altrimenti persi durante il processamento del campione con i solventi organici, tappa che precede l'inclusione in paraffina.

Disidratazione e Diafanizzazione:

Poiché le cellule sono formate principalmente da acqua, questa va rimossa (disidratazione). Si immerge il tessuto in una soluzione alcolica a concentrazione crescente, a partire da etanolo al 50% fino ad arrivare ad etanolo al 100%. Questo processo deve essere graduale per

viene tagliato in sezioni sottili utilizzando un microtomo. Le sezioni hanno uno spessore compreso tra 5-10 µm. Durante il sezionamento, le sezioni vengono poste su un vetrino e successivamente trattate per la colorazione. Colorazione- le sezioni vengono colorate utilizzando coloranti specifici per evidenziare determinate strutture o componenti cellulari. La colorazione permette una migliore visualizzazione delle cellule e dei tessuti al microscopio. Montaggio- le sezioni colorate vengono montate su un vetrino con un mezzo di montaggio trasparente, come il balsamo del Canada. Il mezzo di montaggio permette di proteggere le sezioni e di mantenere la loro trasparenza. Osservazione- le sezioni montate vengono osservate al microscopio ottico. Durante l'osservazione, è possibile analizzare le strutture cellulari e i tessuti, e ottenere informazioni dettagliate sulla morfologia e sulla composizione delle cellule.viene tagliato finemente in sezioni regolari (in modo che passi la luce). Per effettuare il taglio è necessario utilizzare uno strumento chiamato microtomo, dotato di una lama e di un braccio su cui viene fissato il blocchetto di paraffina contenente il campione che, avanzando verso la lama, permette di ottenere sezioni sottili che vanno da 5 a 110 µm di spessore. Le sezioni andranno poi sottoposte al processo inverso di inclusione, ovvero si dovrà rimuovere la paraffina. I campioni sottoposti a congelamento vengono invece tagliati al microtomo congelatore, che impiega un sistema di raffreddamento (-30°C) che permette il congelamento del tessuto. Quest'ultimo offre il vantaggio di poter saltare la fase di disidratazione e reidratazione dei campioni, al costo di ottenere sezioni meno precise e più spesse. Colorazione: consiste nel trattamento del campione con particolari sostanze colorate che rendono visibili le varie differenze e strutture dellacellulaMontaggio: applicazione di un vetrino coprioggetti al vetrino stesso che viene fatto aderire a questo mediante l'uso e successiva solidificazione del "balsamo del Canada".

Altri metodi di preparazione del campione:

Freeze drying: Tecnica di laboratorio basata sull'ottenimento di repliche fedeli delle superfici di materiali biologici mediante congelamento a bassissime temperature sottovuoto (si evita l'utilizzo di fissativi chimici). Una volta congelato il tessuto, questo può essere tagliato da un microtomo. La superficie fratturata viene poi sublimata eliminando l'acqua in eccesso e poi viene stratificata con platino e carbonio in modo che si abbia una replica della superficie da analizzare al microscopio elettronico.

Strisci di sangue: Nel caso di tessuti liquidi, come il sangue, o di campioni biologici ottenuti da lavaggi bronchiali, liquidi pleurici, peritoneali o per ago-aspirazione da noduli solidi e cisti non è necessario.

Ricorrere all'inclusione e al sezionamento. In questi casi, la riduzione dello spessore del campione biologico può essere ottenuta per apposizione, ossia premendo il vetrino portaoggetto sulla superficie del tessuto fresco (masse tumorali o tessuti bioptici) oppure strisciando direttamente le cellule sul vetrino portaoggetti. Nel caso dello striscio di sangue una goccia di sangue viene fatta strisciare sul vetrino e conseguentemente vengono utilizzati dei coloranti che mettono in risalto la parte corpuscolare del sangue. In sezioni da 1mm, si sottopone il campione ad abrasione.

Erosione: Tecnica usata per l'osservazione di tessuto osseo non sottoposto a decalcificazione. Dopo aver sezionato l'osso con un disco di carta smeriglio che viene fatto ruotare a bassa velocità. Quando è abbastanza fine da far passare la luce del microscopio, si sottopone ad osservazione il campione.

Coloranti: Esiste un'ampissima gamma di coloranti adatti alle diverse esigenze di studio.

I coloranti istologici sono per lo più composti da due tipi di molecole: - Molecola capace di assorbire radiazioni elettromagnetiche visibili: Cromoforo, conferisce al colorante, in soluzione acquosa, proprietà acide o basiche. - Auxocromo: Un colorante istologico, in un tessuto fissato si lega stabilmente ai costituenti cellulari e tissutali in base a differenti affinità. Di uso molto comune sono i coloranti che si legano al tessuto in base alla loro affinità chimica, che quindi si dividono in: - Coloranti basici: a pH neutro sono carichi positivamente, perché si sono presi il protone. Si legano a sostanze anioniche (basofile), un esempio è l'ematossilina, che ha come bersaglio il nucleo per gli acidi nucleici (essendo acidi, sono basofili), ma anche il RER per l'RNA ribosomiale (basofilo). Caratteristica dei coloranti basici è la metacr.