Microbiologia – Sterilizzazione

PRINCIPI E TECNICHE DI STERILIZZAZIONE

Generalità:

La sterilizzazione è attuata attraverso tecniche fisiche o chimiche che consentono di uccidere (o rimuovere in alcuni casi) organismi viventi, compresi i virus eventualmente presenti nel materiale da sterilizzare.

La disinfezione si ottiene con l'uso di sostanze chimiche ad azione germicida, garantisce la non infettività di un materiale, ma non la distruzione di tutti i microrganismi presenti. È importante sottolineare che con la sterilizzazione non si ottiene l'apirogenicità del preparato, poiché non vengono rimosse le cellule microbiche o i loro prodotti (endotossine, ecc.).

La sterilizzazione può essere ottenuta mediante calore (fiamma diretta, calore umido, vapore, calore secco), filtrazione, radiazioni, gas.

Sterilizzazione mediante calore:

Fiamma diretta:

Per fiamma diretta si utilizza il becco Bunsen; viene utilizzata per sterilizzare anse di platino (oni-chelcromo), ma

anche per l'incenerimento del materiale. Una semplice sterilizzazione (flambaggio) è richiesta per operazioni in asepsi in apertura e chiusura delle provette e dei recipienti; si ottiene mediante passaggio rapido sulla fiamma dell'orlo delle provette che devono essere accuratamente richiuse successivamente. Calore umido La sterilizzazione mediante calore umido è molto efficace perché consente di uccidere i microrganismi a temperature inferiori a quelle che si devono raggiungere con il calore secco; ciò si può spiegare in base alla maggiore conducibilità termica dell'acqua o del vapore, rispetto all'aria secca. La sterilizzazione mediante calore umido può essere attuata con diversi metodi basati sull'azione di: - liquidi caldi (come acqua): bollitura, pastorizzazione; - vapore fluente o sotto pressione: sterilizzazione con vapore fluente, sterilizzazione frazionata o tindalizzazione, autoclave. 1. Bollitura Si

1. Sterilizzazione

La sterilizzazione è un processo che permette di eliminare tutti i microorganismi presenti in un materiale. Può essere ottenuta utilizzando liquidi portati alla temperatura di 100°C; permette la distruzione di microrganismi in forma vegetativa e, con un'azione prolungata, anche di alcune spore batteriche.

2. Pastorizzazione (inventata da Pasteur)

Si conoscono due metodi di pastorizzazione:

• Low temperature long time (LTLT) detta pastorizzazione lenta, è ottenuta riscaldando il materiale in grossi recipienti alla temperatura di 62,8°C per 30 minuti.
• High temperature short time (HTST) detta pastorizzazione rapida, è ottenuta facendo passare attraverso piastre che riscaldano il materiale liquido alla temperatura di 75°C per 15-20 secondi e successivamente si procede al rapido raffreddamento.

La pastorizzazione non è un vero e proprio metodo di sterilizzazione, viene applicato soprattutto per la riduzione della carica microbica ad esempio nella bonifica del latte: consente di uccidere i comuni patogeni (batteri della tubercolosi, Salmonelle, Streptococchi, Brucelle, Rickettsie).

E alcuni germi ambientali presenti nel latte, determinando la riduzione del 90-99% della carica batterica totale. hackmed.org hackmed@hackmed.org

3. Sterilizzazione mediante vapore fluente

Per vapore fluente si intende il vapore acqueo che si forma a pressione atmosferica ordinaria alla temperatura di 100°C. Il vapore possiede un grande potere di penetrazione e può uccidere tutte le forme vegetative e molte forme sporali: in alcune occasioni può avere azione sterilizzante. Un sistema utilizzato per formare vapore fluente è la pentola di Koch. È un recipiente metallico di forma cilindrica rivestito da materiale isolante; nell'interno, a livello del quarto inferiore, è posta una griglia che sostiene gli oggetti da sterilizzare. Il cilindro non è chiuso ermeticamente e un termometro indica la temperatura raggiunta nel suo interno. L'acqua, portata all'ebollizione, forma vapore che man mano sostituisce l'aria presente.

fino ad ottenere vapore saturo. La sterilizzazione a 100°C prevede il trattamento per 3 volte.

4. Sterilizzazione frazionata (Tindalizzazione)

Si applica quando il materiale da sterilizzare non sopporta le temperature superiori a 100°C (ad esempio terreni contenenti proteine del latte, siero, ecc.). In particolari casi la tindalizzazione si effettua a temperature inferiori a 100°C in apparecchi utilizzati anche per la solidificazione del terreno: esempio di questo apparecchio è il gelitinizzatore di Koch.

Il materiale viene sottoposto ad un primo riscaldamento per 30 min-1h, successivamente si procede al raffreddamento fino a temperatura ambiente; dopo 24h si sottopone il materiale ad un secondo riscaldamento per 30 min-1h, allo scopo di uccidere le eventuali forme vegetative che si sono formate dalla germinazione delle spore durante l'intervallo di 24h. Dopo 24h (a temperatura ambiente) dal secondo riscaldamento, si opera un terzo riscaldamento per 30 min-1h, per avere

Lacertezza che tutte le forme microbiche siano state uccise.

5. Sterilizzazione mediante vapore sotto pressione

In campo microbiologico si utilizza soprattutto per la sterilizzazione di materiale che non subisce alterazioni da parte della temperatura.

L'autoclave è una particolare pentola a pressione; l'azione sterilizzante è data dalle alte temperature raggiunte dal vapore saturo sotto pressione. Esiste una stretta corrispondenza tra i valori della pressione e della temperatura, ad esempio: una temperatura di 120,6°C corrisponde ad una pressione di 1 atm. e permette la sterilizzazione del materiale in un tempo di 15-30 min; generalmente si fa riferimento alla distruzione delle spore batteriche, le più termostabili tra le forme viventi conosciute.

La sterilizzazione avviene perché il calore induce la coagulazione del protoplasma microbico (con denaturazione delle proteine); si è osservato che tale processo è molto rapido poiché il vapore

aumenta la conducibilità termica e garantisce una maggiore penetrazione del calore. Il materiale da sterilizzare deve essere disposto adeguatamente nella camera di sterilizzazione per evitare che in alcuni punti la temperatura non raggiunga i valori richiesti. La chiusura dei recipienti deve essere ottenuta con tappi di cotone o con tappi a vite o di plastica; questi ultimi non devono essere a chiusura ermetica, in modo che l'aria presente nel liquido possa uscire liberamente. I recipienti non devono essere riempiti fino all'orlo in modo che il liquido non fuoriesca a causa dell'ebollizione che si raggiunge durante la caduta di pressione. Il vapore saturo deve sostituire l'aria presente nella camera di sterilizzazione. Controllare la corrispondenza tra pressione e temperatura. La temperatura e il tempo di sterilizzazione devono essere adeguatamente regolati, allo scopo di permettere.vapore di penetrare nei materiali da sterilizzare. Di solito sono sufficienti, in campo microbiologico, 11-15 min a 121°C per distruggere le endospore dei batteri; la temperatura di sterilizzazione deve essere costante per tutto il tempo di sterilizzazione (eventualmente controllarla con registri di temperatura); a sterilizzazione avvenuta, per aprire l'autoclave, aspettare che la pressione abbia raggiunto i livelli normali e la temperatura sia scesa al di sotto dei 100°C; NB: il controllo di efficienza (di sterilità) si ottiene disponendo in autoclave una sospensione di spore di Bacillus subtilis (tra le più resistenti) e facendo avvenire un ciclo di sterilizzazione; in seguito la sospensione si semina su terreno di coltura per valutare l'assenza di sviluppo microbico e avere quindi la certezza di avvenuta sterilizzazione (metodo biologico). Calore secco La sterilizzazione con calore secco si ottiene in stufe come il forno di Pasteur (stufa a

La sterilizzazione può essere ottenuta attraverso diversi metodi, tra cui:

Sterilizzazione per calore

La sterilizzazione per calore viene effettuata utilizzando stufe o forni che raggiungono temperature elevate, solitamente tra i 160-170°C. Questo metodo è efficace per uccidere le spore microbiche. Le stufe devono essere dotate di sistemi di circolazione dell'aria per garantire una temperatura uniforme in tutti i compartimenti.

Sterilizzazione per filtrazione

La sterilizzazione per filtrazione viene utilizzata per sterilizzare materiali liquidi che contengono componenti sensibili al calore, come vitamine, antibiotici e proteine del siero. Il materiale viene fatto passare attraverso una membrana con pori di dimensioni specifiche (solitamente 0,45 micron o 0,2 micron) che permettono al liquido di passare liberamente, ma impediscono il passaggio dei batteri.

Il forno di Pasteur

Il forno di Pasteur è utilizzato principalmente per la sterilizzazione di vetreria, strumenti e materiali resistenti alle alte temperature. Non è adatto per la sterilizzazione di terreni di coltura.

Le tossine ed i virus presenti nel materiale liquido non vengono rimossi, questo perché le dimensioni della particella virale le consentono di attraversare i pori della membrana filtrante.