Microbiologia

Appunti di microbiologia

Le reazioni sierologiche

Precipitazione: reazione in cui il siero immune è mescolato con un antigene macromolecolare solubile e si forma un precipitato insolubile visibile.

Agglutinazione: reazione in cui il siero immune viene cimentato con un antigene corpuscolato e la formazione dell’immunocomplesso si appalesa con l’agglutinazione dell’antigene in ammassi voluminosi.

Fissazione del complemento: reazione in cui il siero immune mescolato all’antigene in presenza di C, si può dimostrare la fissazione di C all’immunocomplesso.

Tossine batteriche

Esotossine ha lo stesso meccanismo d’azione della tossina colerica.

Tossina difterica: prodotta da Corynebacterium diphtheriae, è di tipo AB, è pantropa e il componente A viene traslocato nel citosol, e ha come bersaglio il fattore di allungamento 2 che inattivato non permette il trasferimento del complesso AA-tRNA sul ribosoma bloccando la sintesi proteica. Prodotta da Pseudomonas aeruginosa, agisce con lo stesso obiettivo.

Tossina A: prodotta da Shigella dysenteriae, ha struttura A-B5.

Tossina di Shiga e shiga-like: modifica il ribosoma provocando il blocco della sintesi proteica. Ha una azione tossica sul citoscheletro e provoca edema.

Tossina carbonchiosa: prodotta da Clostridium tetani, diffonde per via ematica; è una tossina con attività zincopeptidasica che inattivando la sinaptobrevina bloccando la secrezione di GABA.

Tossina tetanica: è neurotropa e provoca paralisi flaccida, ha la stessa azione della tossina botulinica.

Tossina botulinica: blocca però l’acetilcolina.

Tossine streptococciche pirogene e superantigene streptococcico: stimolano la risposta immunitaria in maniera esagerata con attività enzimatica, ma soprattutto per la loro capacità di legare più linfociti T e stimolarne l’attivazione.

Endotossina: l’endotossina batterica è costituita dalla sua porzione LPS, ovviamente è presente solo nei Gram -.

L’azione patogena dei batteri

Un batterio è definito patogeno in base alla sua capacità di moltiplicarsi nei tessuti di un organismo e alla sua tossigenicità.

Farmaci antibatterici

Battericidi: capaci di provocare la morte del batterio.

Batteriostatici: inducono il blocco replicativi nella popolazione batterica.

Chemioterapici prodotti per sintesi:

• Sulfamide e sulfamidici: è una molecola dalle proprietà antibatteriche grazie alla sua formula di struttura molto simile a due composti del metabolismo batterico, inibisce, infatti, la sintesi batterica di acidi folici competendo con l’acido p-amino-benzoico per il sito attivo dell’enzima diidropteroato sintetasi che lo inserisce nella molecola interferendo così in questa via metabolica. La maggioranza dei batteri non sono in grado di usufruire di acidi folici provenienti dall’esterno, benché i liquidi tissutali ne siano ricchi, mentre le cellule dell’ospite lo utilizzano. Questo principio è alla base della efficacia selettiva della sulfamide e dei suoi derivati amidici (sulfamidici).
• Isonazide o idrazide dell’acido benzoico: l’isonazide inibisce la sintesi del NAD o alcune transaminasi essendo strutturalmente simile sia alla nicotinamide che alla piridossamina, interferisce così nel metabolismo energetico e in alcune sintesi macromolecolari ma soprattutto nella sintesi degli acidi micoici della parete cellulare dei micobatteri. Infatti, questo composto è usato specialmente nelle infezioni da micobatteri, ne indebolisce la parete cellulare rendendoli facili da eliminare per le difese dell’ospite.
• Nitrofurani e nitroimidazoli: agiscono interferendo con la sintesi di DNA e RNA e in parte degradando quello esistente, i nitrofurani agiscono solo in assenza di ossigeno quindi contrastano infezioni solo di batteri anaerobi obbligati. Si attivano solo in presenza di una specifica nitroreduttasi batterica, infatti i fenomeni di sensibilizzazione sono dovuti alla mutazione del gene che la produce.
• Chinoloni: interagiscono con le girasi e con la topoisomerasi IV che sono enzimi fondamentali per la replicazione batterica.

Antibiotici: sono sostanze naturali prodotte da microrganismi che a basse concentrazioni hanno potere antibatterico. La loro produzione ha una funzione fisiologica probabilmente correlata alla fase di inibizione del metabolismo precedente alla sporulazione.

Penicilline: sostanze antibiotiche prodotte dal fungo Penicillium chrysogenum, hanno in comune l’acido-6-aminopenicillanico. Questo può essere inattivato dall’enzima (presente nello spazio periplasmico di alcuni Gram -) beta-lattamasi. Esistono però alcune penicilline sintetiche che sono resistenti alla beta-lattamasi. Agiscono sui batteri attivamente metabolizzanti e ne provocano la morte per lisi cellulare, hanno la capacità di bloccare il legame di transpeptidazione tra le catene peptidiche laterali di molecole adiacenti di peptidoglicano, poiché la struttura del nucleo fondamentale è un analogo del dimero della D-alanina che forma la porzione terminale del pentapeptide dell’unità basale del peptidoglicano, e inoltre le penicilline sono in grado di inattivare alcuni enzimi (PBP: penicillin-binding-proteins) che partecipano al legame finale di transpeptidazione del peptidoglicano. Essendo vari i bersagli delle penicilline a seconda del tipo, si otterranno risultati diversi nella distruzione del batterio; se il blocco della sintesi di peptidoglicano interesserà i setti di divisione si arresterà la replicazione cellulare e la cellula batterica crescerà oltre i limiti fisiologici, se invece il blocco interesserà i vari punti di crescita alla periferia del batterio ci sarà l’arresto della crescita; in entrambi i casi un complesso sistema di segnali di membrana innescherà l’attivazione di un enzima, la mureina idrolasi, in grado di depolimerizzare il peptidoglicano stesso provocando la protrusione del protoplasma (sferoplasto) batterico dovuta all’assunzione di acqua non più controllata e quindi si avrà la lisi osmotica della cellula.

Cefalosporine e cefamicine: le cefalosporine sono derivati sintetici del prodotto, la cefalosporine C, di un micete il Cephalosporium achremonium, la loro formula di base è simile alle penicilline per la presenza dell’anello beta-lattamico. Anche il meccanismo d’azione è simile a quello delle penicilline, ma il loro spettro si estende anche ai batteri Gram - alle cui beta-lattamasi sono insensibili. Le cefamicine sono antibiotici prodotti da streptomiceti con una struttura di base molto simile a quella delle cefalosporine, hanno ampio spettro, resistenza alle beta-lattamasi e particolare efficacia per i batteri anaerobi.

Polimixine: sono antibiotici formati da polipeptidi prodotti da batteri del genere Bacillus (polymyxa: polimixine; aerosporus: aerosporine; colistinus: colistina o colimicina). Sono antibiotici attivi soprattutto nei Gram - alla cui membrana esterna si legano specificamente soprattutto a livello dei fosfolipidi distruggendone le proprietà osmotiche e provocando la fuoriuscita di metaboliti, hanno azione simile a quella dei disinfettanti e per questo agiscono anche su batteri non attivamente metabolizzanti, e sono altamente tossiche anche per le cellule eucariotiche perciò vengono utilizzate solo in trattamenti topici.

Novobiocina: prodotta da Streptomyces niveus o spheroides, inibisce la sintesi del DNA inattivando la girasi, ma legando un sito diverso da quello dei chinoloni per questo i due composti hanno un’azione sinergica.

Rifamicine: sono isolate da colture di Nocardia mediterranea (actinomicete) sono attive nei confronti di batteri sia Gram - che Gram +; un derivato semisintetico è la rifampicina. Sono capaci di bloccare la sintesi di RNA legando la subunità beta della RNA polimerasi batterica (diversa da quella eucariotica) inattivandola. Sono attivi anche sui micobatteri.

Antibiotici inibitori della subunità 30S

Tetracicline: sono prodotti da streptomiceti, hanno azione batteriostatica attivi contro i Gram - e i Gram +, hanno la capacità di legare la subunità 30S subito dopo che questa abbia effettuato il legame al mRNA impedendo il legame con l’aminoacil-t-RNA a livello del codone iniziatore così bloccando la formazione del polisoma.

Aminoglicosidi: sono prodotti da Streptomyces o da micromonospora o derivati sintetici di prodotti naturali. Hanno in comune struttura chimica, meccanismo d’azione, proprietà fisiche e spettro d’azione ampio. La loro azione non si esplica in ambienti anaerobici o per anaerobi obbligati. Si legano stabilmente con la subunità 30S sottraendola al pool polisomico e inibendo così la sintesi proteica. Oltre a questo blocco può provocare anche errori nella traduzione dell’mRNA producendo proteine non funzionali per il batterio.

Antibiotici inibitori della subunità 50S

Competono con la subunità 50S per il sito di legame sulla subunità ribosomiale stessa.

Macrolidi: sono prodotti da streptomiceti, hanno azione batteriostatica, spettro appena più ampio delle penicilline (anche Gram -).

Cloramfenicolo: prodotto da Streptomyces venezuelane, è batteriostatico e ha azione sia su Gram - che Gram +.

Lincomicina e derivati: sono batteriostatici, con spettro simile a quello dei macrolidi pur avendo struttura diversa, e hanno particolare efficacia contro gli anaerobi obbligati.

Antibiotici inibitori di fattori extraribosomiali

Acido fusidico: estratto da filtrati di Fusidium coccineum, è un acido monocarbossilico insaturo che interagisce con il fattore G di allungamento della catena polipeptidica in formazione impedendone appunto la funzione. È selettivo in forza della sua maggiore permeabilità della cellula batterica rispetto a quella eucariotica.

Resistenza agli antibiotici

La resistenza di uno stipite batterico ad un antibiotico può essere acquisita ex novo tramite coniugazione o trasduzione, essere intrinseca o indotta temporaneamente da alcune condizioni ambientali. Dipende comunque dai seguenti meccanismi:

• Produzione di enzimi inattivanti il farmaco.
• Modificazione del bersaglio.
• Diminuita permeabilità al farmaco o eliminazione più immediata.
• Sviluppo di una via metabolica alternativa a quella inibita dal farmaco.

Disinfezione e sterilizzazione

Disinfezione: ha come obiettivo l’uccisione di ogni eventuale patogeno presente sul materiale sottoposto a tale trattamento. Può essere effettuata con varie sostanze chimiche dette appunto disinfettanti, queste agiscono con vari meccanismi:

• Denaturazione delle proteine per combinazione con gruppi solfidrici, per alchilazione anche di altri gruppi polari.
• Ossidazione di gruppi solfidrici liberi o di altri gruppi funzionali di enzimi.
• Alterazione della membrana per solubilizzazione di lipidi.

Vi sono alcuni fattori che influenzano l’attività disinfettante, come il tempo (esiste un tempo minimo al di sotto del quale la disinfezione non può essere ritenuta efficace, e lo stesso vale per la concentrazione, il pH, il tipo di microrganismo (alcuni disinfettanti sono innocui per alcuni microrganismi), si deve considerare inoltre la natura del materiale da disinfettare per scegliere una adeguata sostanza disinfettante.

Sterilizzazione: ha come obiettivo invece l’uccisione di ogni microrganismo patogeno o meno sul materiale sottoposto. Può essere effettuata con mezzi fisici e chimici. Avviene con diversi metodi a seconda del materiale da sterilizzare:

• Filtrazione: usata per materiali in soluzione e termosensibili, consiste nel passaggio del liquido attraverso filtri dotati di pori di massimo 0.5 micron.
• Stufe a secco: garantiscono la sterilizzazione di materiali termoresistenti a temperature non inferiori a 140° per un tempo minimo di 3 ore.
• Autoclave: viene utilizzato nell’autoclave il potere sterilizzante del vapore acqueo a 110-120° e può essere attuata per minor tempo.
• Radiazioni ionizzanti: sono utilizzate spesso per sterilizzare materiale ospedaliero, protesi e strumenti di laboratorio.
• Vapori di formaldeide o ossido di etilene gassoso sono impiegati in alcuni casi come sterilizzanti chimici.

Principi generali per la diagnosi delle malattie causate da batteri

In un organismo affetto da una malattia gli eventi fondamentali da prendere in considerazione ai fini di una diagnosi eziologica sono:

• La presenza di un batterio patogeno nell’organismo da accertare mediante esami.
• La reazione immunitaria dell’organismo ospite da studiare mediante reazione sierologica.

Questo vuol dire che la presenza di un agente eziologico nell’ospite potrà essere accertata con l’isolamento del patogeno stesso in materiali infetti provenienti dal paziente in esame o con la constatazione di un aumento degli anticorpi specifici per quel agente nello stesso ospite.

Prelievo del materiale da esaminare:

• Fare in modo che il materiale prelevato sia quello patologico nell’ospite.
• Eseguire il prelievo al momento più opportuno.
• Evitare l’inquinamento da parte di microrganismi estranei.
• Evitare ogni alterazione del materiale nell’intervallo di tempo tra il prelievo e l’arrivo in laboratorio.

La presenza di un dato microrganismo in un campione può essere accertata mediante esame microscopico o colturale. L’esame microscopico per la ricerca di batteri patogeni senza l’ausilio di tecniche particolari, ha molte limitazioni, può in fin dei conti dare informazioni utili a riconoscere la morfologia del patogeno e le sue reazioni ai coloranti (colorazione di Gram). L’esame colturale invece è molto più indicato; il primo passo nella ricerca colturale è l’isolamento dei batteri presenti nel materiale, e poi si passa all’identificazione attraverso l’utilizzo di colture selettive (nel caso si voglia rispondere ad una richiesta specifica). L’identificazione definitiva avviene comunque nelle colonie pure derivate da ciascun tipo di colonia e si basa su caratteri morfologici del batterio e della colonia, comportamento biochimico, antigeni, potere patogeno sperimentale. Inoltre sono molto efficaci nella ricerca di un particolare patogeno i metodi immunologici con i quali è possibile identificare in un materiale biologico anche solo un antigene, e le sonde molecolari che riescono a evidenziare la presenza di una parte significativa (anche grazie all’amplificazione) di genoma batterico; questi metodi permettono inoltre di evidenziare indifferentemente la presenza di batteri vitali o meno, ma necessitano comunque di essere guidati da un sospetto diagnostico.

Interpretazione dei risultati nell’esame batteriologico

È importante ricordare che un organismo può albergare vari batteri patogeni senza presentare sintomi morbosi o sviluppare malattia, questo nel caso che nonostante la ricerca di uno specifico battere per sospetto diagnostico se ne riscontri uno diverso nel campione. Nel caso che l’esame escluda un sospetto è comunque giusto cambiare linea diagnostica dopo aver ripetuto il test più volte sempre con esito negativo. Da siti di infezione si possono isolare anche batteri non normalmente patogeni e cioè abituali commensali della zona interessata da patologia, in questo caso si deve accertare che il risultato non sia dovuto a contaminazione della coltura ematica in seguito a traumi, ecc., e si deve ricordare che anche batteri normalmente apatogeni possono causare in individui debilitati infezione.

Antibiogramma

Quando l’esame mette in evidenza la presenza di una famiglia batterica costituita da stipiti con diverse sensibilità agli antibiotici è necessario stabilire con precisione di quale stipite si tratta prima di prescrivere una terapia antibiotica o chemioterapica. Per determinare la cura più idonea si sottopone la popolazione batterica in fase logaritmica dividendola in diversi gruppi a concentrazioni diverse di ogni farmaco per stabilire la quantità minima inibente per ognuno. L’antibiogramma è utilissimo per terapie mirate che consentono la massima efficacia antibatterica con minimi effetti tossici per il paziente.

Le ricerche sierologiche hanno invece il compito di rilevare un’attività immunologica nell’ospite contro il patogeno sospettato. Il rinvenimento di anticorpi anti-patogeno ricercato non significa necessariamente che ci sia una infezione in corso, la presenza può essere dovuta a vaccinazioni o infezioni pregresse. Quando il dubbio rimane, è necessario ripetere il prelievo ad alcuni giorni di distanza e verificare se la concentrazione di anticorpi sia cresciuta significativamente; se questo avviene c’è sicuramente una infezione in atto.

Ricerca differenziale delle IgM: le IgM sono gli anticorpi tipici della risposta primaria e rimangono in circolo per breve tempo all’inizio dell’infezione. Quindi rilevarne la presenza in circolo equivale a diagnosticare un’infezione in atto (il risultato è dubbio in caso di Gram - nelle cui infezioni le IgM possono permanere in circolo per lunghi periodi).