Microbiologia

VARIABILITÀ GENETICA

La replicazione di un battere avviene per scissione binaria, dove non è presente alcuna ricombinazione genetica. La

riproduzione batterica è infatti di tipo clonale.

Una certa variabilità è tuttavia necessaria, per consentire un maggior adattamento della specie all’ambiente. Per

ovviare al problema della “clonazione” i batteri sfruttano sia le variazioni spontanee del proprio genoma, sia utilizzano

alcune tecniche per mescolare il proprio patrimonio genetico.

Esistono perciò due tipi di variabilità:

• 

Variabilità fenotipica variazione nell’espressione genica

Pagina 49

Microbiologia D’Incà Levis Roberta

• 

Variabilità genotipica variazione della struttura del genoma stesso. Può avvenire in modo passivo

attraverso mutazioni o in modo attivo tramite acquisizione di nuova informazione genetica.

MUTAZIONI

Tutte le mutazioni avvengono in natura sempre in modo casuale. Queste vengono poi selezionate direttamente

dall’ambiente, che favorisce la vita di solo quei mutanti in grado di sopravvivere al meglio.

Possono essere

• 

Puntiformi una sola base viene sostituita

• 

Frameshift inserzione/delezione di una sequenza di basi. Sono meno gravi se avvengono per triplette.

Pagina 50

Microbiologia D’Incà Levis Roberta

L’informazione genica è conservata dalla cellula attraverso



1. Attività 3’-5’ esonucleasica della polimerasi mantenimento del genoma attraverso la correzione

automatica di errori di trascrizione effettuato direttamente dalla DNA polimerasi

2. Sistemi multienzimatici di riparo

Allo stesso tempo l’informazione genica può venire modificata attraverso

• 7 11

errori nella riparazione del DNA (ogni 10 -10 basi FREQUENZA DI MUTAZIONE SPONTANEA) mutazioni

spontanee

• 

mutageni chimici e radiazioni (sostanze che causano danni nel DNA; cancerogene) mutazioni indotte, che

possono portare alla modificazione di una cellula; possono essere mutazioni mortali in organismi come quello

umano, in grado di trasformare le cellule in tumorali, dalla proliferazione incontrollata. Queste sostanze

aumentano la frequenza di mutazione spontanea succitata.

Le mutazioni avvengono sempre, anche in colture pure dove i batteri non hanno contatti con ceppi diversi.

8 9

Dato che 1ml di coltura contiene 10 – 10 batteri è possibile che in ogni ml sia presente uno o più organismi mutanti

in un determinato gene. Queste variazioni emergono soltanto se vantaggiose, altrimenti rimangono silenti.

Gli organismi mutanti possono essere:

• 

Mutanti in determinanti di prodotti essenziali non vitali, perché non più in grado di sintetizzare sostanze

fondamentali per la propria sopravvivenza

• 

Mutanti resistenti batteri in grado di resistere ad un antibiotico o ad un antibatterico. Sono selezionabili in

modo diretto: se una coltura è posta in un terreno che presenta tali sostanze, rimarranno in vita solamente

quegli organismi in grado di sopravvivere in presenza di queste, ovvero quegli organismi che hanno

sviluppato per quelle sostanze una certa resistenza.

• 

Mutanti nutrizionali la mutazione determina l’incapacità del ceppo a sintetizzare una sostanza

normalmente necessaria (auxotrofi). Non sono selezionabili in modo diretto: batteri di questo tipo non sono

in grado di sopravvivere in colture in cui invece sopravvivono i corrispondenti prototrofi, ovvero i relativi

ceppi selvatici.

Se avviene una mutazione selezionabile il ceppo mutante è direttamente selezionabile tramite utilizzo di un terreno

speciale addizionato con la sostanza di riferimento.

Figura 13 - Mutazione selezionabile

Pagina 51

Microbiologia D’Incà Levis Roberta

Se invece avviene una mutazione non selezionabile l’unico modo per selezionare il ceppo mutante è utilizzare due

colture: una con terreno minimo e una con terreno minimo addizionato della sostanza speciale non sintetizzata dai

mutanti. Confrontando poi i due livelli di crescita e sottraendo il numero di batteri presenti nel terreno arricchito a

quelli nel terreno minimo, si può studiare il tipo di crescita dei batteri mutanti.

Figura 14 - Mutazioni non selezionabili

Queste considerazioni sono utili per capire il principio di funzionamento del test di Ames.

TEST DI AMES

Serve per valutare la mutagenicità di una sostanza.

È tra i primi test che vengono effettuati su un nuovo farmaco prima di poterlo immettere nel mercato. È infatti

necessario verificare che questo non sia mutageno; non deve causare danni al DNA, perché se una sostanza è

mutagena è automaticamente considerata cancerogena (= in grado di indurre tumori).

Il test viene usato per valutare la mutagenicità sia di potenziali farmaci che di sostanze alimentari.

Per poter comprendere in che modo le mutazioni che avvengono influenzino il genoma è però necessario scegliere un

qualche gene indicatore di cui si conoscono le caratteristiche. Non si andrà quindi a studiare l’intero genoma, ma il

singolo gene.

Nel momento in cui il ceppo batterico è posto a contatto con una sostanza mutagena la maggior parte delle mutazioni

non potrà essere visualizzata, ma si potrà calcolare la frequenza di mutazioni per il gene considerato.

Il test di Ames si basa sui microrganismi batterici, prendendo in considerazione la loro via biosintetica della sintesi

dell’istidina.

I ceppi batterici selvatici presentano un gene che codifica per l’istidina, chiamato GENE AB, funzionante. In questo

caso i batteri sono in grado di sviluppare enzimi AB funzionanti. Il ceppo selvatico crescerà quindi senza problemi in un

terreno minimo senza istidina. Pagina 52

Microbiologia D’Incà Levis Roberta

I ceppi batterici di Ames sono ceppi di Salmonella typhimuriumche, che presentano il gene AB mutato: questo

comporta che i ceppi di Ames non siano in grado di sintetizzare l’istidina (sono auxotrofi), morendo in terreni minimi

dove questa sostanza non sia stata aggiunta.

Se un ceppo di Ames è posto in un terreno contenente una certa sostanza mutagena si visualizzerà una frequenza di

RETROMUTAZIONI, ovvero mutazioni che ripristinano in tali batteri la capacità di sintetizzare l’istidina. In questo

caso il ceppo sarà in grado di crescere nuovamente su terreno minimo, rendendosi a questo punto direttamente

selezionabile.

Il test viene effettuato in due parti: in terreno minimo addizionato con poca istidina, si analizza il comportamento

dello stesso campione di batteri prima non aggiungendo (controllo) e poi aggiungendo il sospetto mutagene.

Nel controllo visualizzerò un certo numero di colonie in grado di crescere comunque (frequenza di mutazione

spontanea), ma il numero sarà molto basso. Se nell’altro terreno il numero di colonie visualizzato è consistentemente

maggiore allora la sostanza avrà indotto una retromutazione, ed è da considerarsi mutagena.

Figura 15 – Nella prima provetta è aggiunto il sospetto mutagene, nella seconda non viene aggiunto nulla (controllo)

Teoricamente il test termina a questo punto, ma in realtà così non è completo: è stato dedotto se il farmaco sia

mutageno, ma nulla si è detto sulla sua pro-mutagenicità.

Un agente PROMUTAGENO è una sostanza che di per sé non è mutagena, non ha azioni sul DNA; ma nel momento in

cui viene inserita nell’organismo ed enzimi dell’organismo stesso la degradano, i prodotti di degradazione hanno

effetto mutageno. Pagina 53

Microbiologia D’Incà Levis Roberta

In un’altra provetta contenente lo stesso ceppo batterico viene aggiunto il mutageno e anche un omogenato di fegato

di ratto, che ha il compito di mimare il metabolismo epatico umano.

Una volta aggiunto il campione ad un terreno privo di istidina si potranno ottenere zero colonie, poche o molte. Se si

ottiene un numero elevato anche sottraendo il numero di colonie a quelle visualizzate nel controllo allora la sostanza

è promutagena.

ATTENZIONE!: Il test di Ames non viene effettuato per valutare il potenziale mutageno dei batteri, ma quello di

potenziali farmaci: i batteri sono solamente il mezzo utilizzato per effettuare tale valutazione.

Altre caratteristiche del test:

• Possono essere utilizzati diversi tipi di ceppi, alternativi al Salmonella typhimuriumche: tutti auxotrofi per

l’istidina ma con diversi tipi di mutazioni (puntiformi, frameshift). In questo modo è possibile identificare

anche il tipo di mutazione che il farmaco può indurre.

• Solitamente i ceppi usati presentano un polisaccaride O più corto, che li rende più permeabili e quindi più

facilmente attaccabili dalle sostanze mutagene.

• Spesso i ceppi presentano mutazioni nei sistemi di riparazione del DNA (complessi multienzimatici); in questo

modo sono molto più sensibili ai vari mutageni.

Il limite principale di questo test è proprio l’utilizzo di sole cellule procariotiche: in questo modo è impossibile predire

con sicurezza l’effetto del farmaco sulle cellule umane.

ACQUISIZIONE DI NUOVA INFORMAZIONE GENETICA

Altra modo con cui il battere può ottenere variabilità genetica è attraverso l’acquisizione diretta di questa. Si parla di

trasferimento orizzontale, ovvero di un trasferimento di geni tra due cellule non discendenti.

Con il termine trasferimento verticale invece si indica il trasferimento del patrimonio genetico da una cellula madre a

tutta la progenie.

Sono importanti entrambi i processi che portano all’acquisizione completa del DNA

• 

Ingresso nella cellula può avvenire in tre modi diversi

o Trasformazione

o Transduzione

o Coniugazione

• 

Permanenza del DNA all’interno della nuova cellula solo nel caso in cui vi sia trasmissione del patrimonio

acquisito alla progenie (capacità di trasferimento verticale) è possibile la variabilità

Pagina 54

Microbiologia D’Incà Levis Roberta

TRASFORMAZIONE

È il metodo più primitivo tra tutti: permette alla cellula di acquisire il DNA presente nell’ambiente circostante.

È stato evidenziato tramite l’esperimento di Griffith nel 1928.

L’esperimento analizzava il comportamento di ceppi diversi di batteri Streptococcus pneumoniae, in grado di produrre

o meno la capsula. È stato osservato che i ceppi in grado di produrla (ceppi S, da “smooth” = liscio, perché privi di

capsula) avevano attività patogenica, quelli non capsulati (ceppi R, da “rough” = ruvidi) erano invece innocui.

Griffith notò con grande stupore che l’inoculazione di una combinazione di ceppi R vivi (innocui) e S