Microbiologia - micobatteri

QUANTE SPECIE DI MICOBATTERI CONOSCIAMO OGGI?

“Sono parecchie, ma non sono comunque assai…!”

I criteri per distinguere le varie specie rinvenute fino ad ora sono:

• Proprietà biochimiche
• Proprietà biologiche
• Tipo di crescita
• Produzione di pigmento

Sono così perlomeno 12 i caratteri che, incrociati in vario modo, danno origine alle varie specie di micobatteri raggiungendo un totale di 30, 40 al massimo.

Il RUNION ha classificato i micobatteri distinguendo il complesso della tubercolosi dove troviamo il m.tuberculosis ed il m. bovis, il m.ulcera ed il m.lepre (che causa la lebbra, malattia granulomatosa che presenta le stesse caratteristiche, le stesse evoluzioni, e le stesse risposte immunitarie della tubercolosi, solo che la tubercolosi colpisce a livello polmonare, mentre la lebbra colpisce a livello cutaneo).

Runion distinse 4 gruppi sulla base di due criteri:

• Produzione di pigmento in assenza ed in presenza di

luce(scotocromogeni = produzione di pigmento in assenza di luce;fotocromogeni = produzione di pigmento in presenza di luce)

• Velocità di crescita (i batteri che non causano la tubercolosi sono molto più veloci, mentre i batteri veri e propri della tubercolosi hanno bisogno di più tempo per poter costruire una colonia)

Quelli meno patogeni sono a crescita più veloce, tanto è vero che i saprofiti sono a crescita rapidissima (24/48 ore) e si trovano prevalentemente nei prati e nelle erbe e sono perciò facilmente assumibili dagli animali che brucano.

Esistono una serie di micobatteri con i quali il nostro organismo entra in contatto mediante l'ambiente e che innescano una determinata risposta immunitaria che costituisce la base della sensibilizzazione; su questa base poi si innescano nuovi tipi di sensibilizzazione.

COME SI COLTIVANO QUESTI MICROORGANISMI?

Sono di difficile coltivazione perché, essendo a crescita lenta, quando li preleviamo

Da materiale patologico ci sono altri germi che inquinano il materiale e che si sviluppano più velocemente pertanto i micobatteri sono più difficilmente messi in evidenza (anche perché difficilmente colorabili).

Per quanto riguarda la coltivazione, chi si occupò dello studio del bacillo della tubercolosi fu KOCH. Egli, sulle esperienze di Linnek, mise in evidenza nelle varie forme cliniche la reale presenza del bacillo che Linnek aveva solo ipotizzato.

Koch per dimostrare l'esistenza di questo microrganismo aveva bisogno di due cose:

• Un metodo per colorarlo
• Un mezzo per coltivarlo

Il terreno adatto alla coltivazione non poteva essere liquido perché all'interno di esso i microrganismi si sviluppano tutti insieme e quindi non è possibile isolarli singolarmente. Più favorevoli all'isolamento sono i terreni solidi perché, se diluiti in modo opportuno, si può ipotizzare che da una cellula si sviluppi una colonia.

di microrganismi; successivamente si può isolare questa colonia, trasferirla su terreni permissivi ed ottenere propagazione, isolamento e crescita della sola specie che ci interessa. Possiamo dunque dedurre che i terreni liquidi permettono l'arricchimento e lo sviluppo degli organismi perché, che siano aerobi o anaerobi, mediante tecniche di agitazione è possibile che tutte le sostanze nutritive che occorrono all'organismo gli arrivino e gli permettano di svilupparsi. I terreni solidi, invece, permettono l'isolamento dei microrganismi e per il loro nutrimento e sviluppo occorre la formazione di un gradiente di diffusione in maniera tale che i nutrienti diffondano dalle zone più ricche alle quelle più povere nei pressi delle colonie. QUALI SONO I TERRENI DI COLTURA? L'agar inizialmente non era ancora stato scoperto e veniva usata la GELATINA; essa, però, veniva attaccata da alcuni agenti che la liquefacevano e questo successivamentevenne usato come metodo per distinguere i microrganismi in base alla loro capacità di attaccare o meno la gelatina. In seguito essa è scomparsa dall'uso pratico. Koch usava la PATATA, avendo constatato che il germe si sviluppava in ambiente vegetale; ebbe dunque l'intuizione di usare fette di patate che trattò GLICERINANDOLE e aggiungendo della BILE (che distruggeva tutti i germi: essa infatti è un tensioattivo che abbassa la tensione superficiale in modo tale che i batteri gram-negativi vengano lisati). La glicerina veniva usata perché il glicerolo è il precursore degli acidi grassi, essenziali per la crescita del microrganismo. Altro terreno solido era il SIERO DI SANGUE coagulato al calore, purificato a 50-60°, temperature alle quali le proteine del sangue precipitano a formare un terreno solido molto ricco su cui ogni organismo può svilupparsi. IUTM: sigla dei terreni di coltura universalmente utilizzati per coltivare ed isolare.

Tutti i microrganismi. Parametri dettati dalla Organizzazione Mondiale della Sanità. (Alla base di questi terreni c'erano sempre iprecursori di acidi grassi: rosso d'uovo, glicerina, tegola di patata, sostanza colorante batteriostatica che impedisce lo sviluppo di altri microrganismi [es. verde di malachite]).

Come terreno LIQUIDO si usa ancora il BRODO GLICERINATO e GLUCOSATO; il glucosio perché viene attaccato dai micobatteri, mentre il glicerolo in quanto precursore di acidi grassi e quindi in grado di fornire abbondante nutrimento al microrganismo.

Dopo diverse settimane avremo una crescita batterica che si manifesta come una patina al di sotto della quale il terreno è liquido: questo perché il germe è nettamente aerobio ed è in grado di crescere solo in superficie e non negli stadi intermedi microanaerobi. Quando tutta la superficie è stata coperta vediamo che questa si increspa e risale lungo il bordo del contenitore.

All'interno del quale stiamo osservando la crescita del microrganismo. Questo tipo di crescita, tipica dei micobatteri, è definita AVELO INCRESPATO e riverifica dopo 6-7 settimane circa.

QUAL È LA COLORAZIONE?

Da Koch ed altri collaboratori fu messo in evidenza il metodo dell'ACIDO-RESISTENZA che successivamente fu adottato anche da Ziehl e Nielsen che riuscirono a ridurne i tempi (soli 15 minuti rispetto alle 24-48 ore di Koch).

Per la colorazione utilizzarono oltre alle normali sostanze mordenzanti anche un espediente particolare: inizialmente tutto veniva colorato con normali coloranti, poi veniva estratto il colore con un solvente in cui il colorante si scioglieva facilmente, oppure con un acido. In questo modo si scolorava tutto tranne i micobatteri, x cui l'aggiunta di un colorante contrastante faceva risaltare di più i bacilli.

Ziehl e Nielsen abbreviarono i tempi di colorazione riscaldando il preparato fino ad ebollizione (sulla base della relazione

temperatura-tempo in base alla quale la velocità di una reazione aumenta all'aumento della temperatura): tale punto di ebollizione non doveva essere superato perché il colorante sarebbe precipitato e si sarebbe avuta una visione distorta del microrganismo. [N.B. Quando prepariamo un tessuto o un terreno da osservare lo dobbiamo prima fissare su un vetrino; in genere i batteri vengono fissati alla fiamma in modo tale che la temperatura sia abbastanza alta da denaturare le proteine per fissare il germe sulla superficie del vetrino, ma non alta al punto di distruggere o alterare la conformazione dell'organismo.] Il meccanismo alla base di questa colorazione sta nel fatto che, inizialmente i micobatteri non trattengono colore, ma nel momento in cui acquistano la capacità di trattenerlo non lo rilasciano più. I micobatteri, insieme alle spore, sono tra i pochi organismi in grado di colorarsi col metodo dell'alcool-acido resistenza. Esistono poi

altriorganismi debolmente acido-alcool resistenti, che perdono questa resistenza se riscaldati per poco tempo, mostrano dunque questa proprietà in modo più lieve.

Il meccanismo alla base dell'acido-alcool resistenza sta nella grossa quantità di lipidi presenti nei micobatteri. Per l'acido esistenza c'è un lipide particolare che si chiama acido glicolico che presenta generalmente un gruppo -OH libero e quindi questo gruppo lascia una certa idrofilia e permette al colore di passare attraverso questo canale idrofilo. Quando è passato il colore, oltre alla porzione che si fissa all'interno, c'è proprio una parte che si fissa all'acido glicolico; in questo modo il gruppo -NH2 libero del colorante che si fissa all'acido fa perdere parzialmente l'idrofilia (seppur minima, legata ad -OH) e così il colorante non può più essere rilasciato.

Quando ci sono ceppi di micobatteri altamente

idrofobici il colore in nessun caso passa nella membrana e quindi i microrganismi non vengono colorati: in questo caso il terreno potrebbe apparirne sprovvisto, quando in realtà queste specie potrebbero rivelarsi come le più virulente. Questo è un tipico caso di errore nell'esame batterioscopico. Questa tipologia di esame ci dice se ci sono batteri acido-alcool resistenti, ma non può garantirci che questi siano micobatteri (anche se la probabilità è del 90%). Un altro errore è dovuto al trattamento del paziente con ACIDO ISOMICOTINICO che blocca la sintesi di acidi micotici, per cui il paziente presenterà micobatteri privi di tali acidi e di conseguenza quando verrà effettuata l'estrazione del colorante passerà all'esterno anche quello contenuto nei micobatteri che avranno dunque perso l'acido-alcool resistenza e quindi non potranno essere messi in evidenza. Siccome il solo esame batterioscopico non basta,

occhio nudo, si utilizzano tecniche di amplificazione del DNA come la PCR (Polymerase Chain Reaction) per identificare specificamente la presenza di micobatteri. Durante l'esame colturale, il campione viene inoculato su un terreno di coltura specifico per i micobatteri e viene incubato a una temperatura controllata per favorire la crescita di questi batteri. Successivamente, i micobatteri vengono identificati utilizzando test biochimici e molecolari. È importante sottolineare che l'esame colturale per i micobatteri richiede tempo e pazienza, in quanto la crescita dei batteri è lenta e può richiedere diverse settimane. Tuttavia, è un metodo affidabile per identificare la presenza di micobatteri e determinare la sensibilità agli antibiotici. In conclusione, l'esame colturale per i micobatteri è un processo complesso che richiede attenzione e precisione nella preparazione del campione e nella coltura dei batteri. È uno strumento fondamentale per la diagnosi e il trattamento delle infezioni da micobatteri.