Microbiologia - appunti

Microbiologia per cdl in infermieristica università degli studi di Perugia

Introduzione

Microbiologia è la scienza che studia esseri viventi microscopici: microrganismi. Sotto il termine “microrganismi” sono raggruppati organismi molto diversi tra loro, non sempre a struttura cellulare (es. virus) ma di norma unicellulari, che hanno dimensioni troppo piccole per essere osservati ad occhio nudo e che quindi risultano visibili con l’aiuto del microscopio. La microbiologia medica studia i microrganismi patogeni per l’uomo. In particolare, studia i meccanismi di patogenicità al fine di individuare strategie atte a prevenire e/o controllare l’insorgenza delle malattie infettive.

Osservazione dei microrganismi

Le dimensioni dei microrganismi sono in genere mille volte più piccole di 1 millimetro, ovvero 1 micron (µm) e nei virus possono scendere fino ad un milionesimo di millimetro, vale a dire 1 nanometro (nm). Il mondo microbico sfugge quindi alla capacità di risoluzione dell’occhio umano (circa 200 µm) ed è per questo motivo che viene utilizzato uno strumento chiamato microscopio. Il microscopio (dal greco: μικρόν (micron) piccolo e σκοπεῖν (skopein) guardare) è uno strumento che consente di ingrandire oggetti di piccole dimensioni per permetterne l'osservazione.

Tipi di microscopio

Microscopio ottico permette di evidenziare batteri, miceti, protozoi. Può essere:

• In campo chiaro
• In campo oscuro (ultramicroscopi)
• A contrasto di fase
• A fluorescenza

Microscopio elettronico permette di evidenziare sia i virus, sia singoli componenti di un corpo batterico grazie alla loro capacità di ingrandire centinaia di migliaia di volte un oggetto. Può essere:

• A trasmissione
• A scansione

Il microscopio ottico in campo chiaro è il più comunemente utilizzato in microbiologia. È composto da due sistemi di lenti: uno situato vicino all’oggetto da esaminare - obiettivo - uno vicino all’occhio dell’osservatore – oculare - e da una fonte luminosa costituita dalla luce visibile generata da una lampadina. Gli obiettivi sono intercambiabili mediante rotazione del blocco portante ed hanno in genere un potere di ingrandimento pari a 10X, 40X, 100X. Gli oculari hanno, in genere, un potere di ingrandimento pari a 10X. Il potere di ingrandimento si ottiene dal prodotto dell’ingrandimento dell’obiettivo con quello dell’oculare.

Esame colturale

Il metodo classicamente utilizzato per analizzare un microrganismo in un laboratorio di microbiologia dopo l’esame microscopico è l’esame colturale. Vengono utilizzati idonei terreni di coltura. Il terreno di coltura è un mezzo che consente lo sviluppo e la crescita. I batteri ed i miceti di importanza medica sono in genere abbastanza facilmente coltivabili in laboratorio. La coltivazione dei virus risulta più difficoltosa, in quanto sono parassiti endocellulari obbligati e quindi necessitano di substrati cellulari per replicarsi. I protozoi sono di difficile coltivazione in vitro ed ad oggi sono stati allestiti metodi colturali solo per alcuni.

Caratteristiche generali dei batteri

Cellula procariota: Diametro cellulare di circa 0,5-3 micrometri. Nucleo non definito e non associato ad istoni. Citoplasma caratterizzato dall’assenza di organelli delimitati da membrana.

Cellula eucariota: Diametro cellulare compreso tra 10-100 micrometri. Nucleo ben definito con DNA associato ad istoni. Citoplasma caratterizzato da organelli quali mitocondri, reticolo endoplasmatico, apparato del Golgi, lisosomi e talvolta cloroplasti.

Analizzando la struttura di una cellula batterica si possono distinguere alcuni componenti fondamentali ed altri che vengono definiti accessori. I componenti fondamentali sono presenti in tutti i batteri, in quanto necessari alla loro sopravvivenza. I componenti accessori conferiscono caratteristiche aggiuntive ai vari gruppi di batteri come maggiore virulenza, resistenza agli antimicrobici, capacità adhesive alle superfici, motilità cellulare.

Componenti fondamentali e accessori

Componenti fondamentali:

• Parete cellulare
• Membrana citoplasmatica
• Citoplasma
• Nucleoide
• Ribosomi

Componenti accessori:

• Capsula
• Plasmidi
• Fimbrie o pili
• Flagelli
• Spore

Parete cellulare

La parete batterica è situata nella parte esterna della cellula batterica ed è responsabile della forma e della rigidità dei batteri. La funzione principale della parete è quella di evitare che il batterio possa andare incontro a lisi quando la pressione osmotica del citoplasma è maggiore rispetto a quella dell’ambiente esterno. La parete è formata da un polimero macromolecolare chiamato peptidoglicano. Il peptidoglicano è costituito dalla ripetizione di una unità di base formata da due monosaccaridi: N-acetilglucosamina (NAG) e Acido N-acetilmuramico (NAM) legati tra di loro da un legame beta-1,4 glicosidico. In base a differenze strutturali della parete, i batteri sono suddivisi in due gruppi. Poiché tali differenze vengono evidenziate tramite la colorazione di Gram, i due gruppi sono: Gram + e Gram-.

Nei Gram + la parete è spessa ed è costituita da numerosi strati di peptidoglicano (200-800 Å). Altri componenti sono:

• Gli acidi teicoici (polimeri di alcoli polivalenti, glicerolo o ribitolo, esterificati con acido fosforico, a cui possono legarsi aminoacidi e/o monosacaridi). Hanno funzione antigenica e di adesività.
• Gli acidi lipoteicoici che ancorano la parete alla sottostante membrana citoplasmatica.

La membrana esterna, a differenza di quella citoplasmatica, è asimmetrica essendo costituita da fosfolipidi nella porzione interna e da un complesso lipidico-polisaccaridico (lipopolisaccaride, LPS) nella porzione esterna. LPS è costituito da:

• Lipide A: funzione tossica (endotossina).
• Core polisaccaridico.
• Antigene O: è costituito da zuccheri che caratterizzano la specificità antigenica.

Lipopolisaccaride

Consiste di tre porzioni:

• Una porzione lipidica (lipide A) rappresenta l’endotossina cioè la frazione tossica.
• Al lipide A è legata una porzione polisaccaridica proiettata all’esterno della membrana e composta a sua volta da due parti:
  • Una catena di zuccheri (parte centrale o core) (acido ketodeossioctonico ed un eptosio) con struttura costante in tutti i Gram negativi appartenenti alla stessa specie.
  • Una lunga catena polisaccaridica (40 zuccheri) di composizione differente nei batteri appartenenti alla stessa specie con spiccate proprietà antigeniche (antigene O). Distingue i sierotipi di una specie batterica.

Spazio periplasmico

• È lo spazio tra l’interno della membrana esterna e l’esterno della membrana citoplasmatica.
• Contiene:
  • Enzimi come proteasi, fosfatasi, lipasi, nucleasi, collagenasi, ialuronidasi, proteasi e beta lattamasi.
  • Proteine di trasporto delle sostanze nutritive e proteine costituenti il sistema di chemiotassi.

Colorazione di Gram

Colorazione più importante e usata in batteriologia. Prende il nome dal patologo danese che la mise a punto (1884). Permette di distinguere i batteri in Gram+ e Gram-. Gram+: blu-violacea. Gram- : rosso.

Prima di procedere con la colorazione è necessario allestire un preparato di cellule batteriche fissato al calore. Colorazione con soluzione di cristalvioletto. Allontanare il colorante. Trattare il vetrino con un mordenzante: il liquido di Lugol (i mordenzanti sono sostanze che formano un composto insolubile con il colorante facilitandone l’unione col substrato). Tutti i batteri acquisiscono una colorazione blu-violacea. Trattare il vetrino con una soluzione decolorante formata da alcool e acetone. Solo i batteri Gram- vengono decolorati. Applicare un colorante di contrasto: la fuxina o la safranina (rossa). I batteri Gram– si colorano di rosso.

Membrana citoplasmatica

È situata al di sotto della parete batterica. Ha una struttura a mosaico fluido (Singer), formata da un doppio strato di fosfolipidi in cui sono immerse diverse proteine che intervengono in molti processi biosintetici come la produzione di energia, il trasporto di nutrienti e prodotti da eliminare da o per il citoplasma. Costituisce una barriera selettiva che permette il passaggio per diffusione passiva, di acqua e piccole molecole idrofobiche e, per diffusione attiva, di nutrienti di maggiori dimensioni. Svolge un ruolo fondamentale durante la replica batterica intervenendo nel processo di segregazione dei cromosomi nelle due cellule figlie e nella formazione del setto divisorio tra di esse.

Citoplasma

È costituito per l’80% di acqua ed è estremamente semplice, privo di molti elementi morfologici che caratterizzano il citoplasma delle cellule eucariotiche. Contiene il nucleoide, macromolecole proteiche (50% del peso secco della cellula), acidi nucleici, ioni, polisaccaridi di riserva, ribosomi, granuli e plasmidi.

Ribosomi

Sono i distretti citoplasmatici deputati alla sintesi delle proteine. Sono costituiti da RNA e proteine. Sono costituiti da due subunità asimmetriche.

Nucleoidi

Tutti i batteri sono sprovvisti di un nucleo vero e proprio dotato di membrana nucleare che lo separi dal citoplasma, ma posseggono una regione in cui è addensato il materiale cromosomale, denominato “nucleoide”. Il nucleoide è costituito da una grande singola molecola di DNA in grado di autoduplicarsi, strettamente avvolta ed immersa nel citoplasma. È funzionalmente e strutturalmente equivalente ad un cromosoma.

Capsula

È un involucro mucoso e amorfo che può essere abbondantemente presente sia nei batteri Gram+ sia nei Gram-. Si trova esternamente alla parete batterica. Nella maggior parte dei casi è costituita da polisaccaridi. Nel caso sia poco aderente e poco uniforme per densità e spessore, questo materiale è definito strato mucoso o glicocalice.

1. Azione antifagocitaria: impedisce la fagocitosi da parte dei fagociti dell’ospite (i batteri più invasivi che debbono attraversare il torrente ematico per raggiungere il bersaglio sono sempre capsulati).

2. Strumento di adesione: il materiale capsulare rappresenta un efficace strumento per l’adesione batterica alle superfici mucose o inerti dell’organismo ospite contribuendo fortemente alla formazione del “biofilm”. Una volta che i batteri aderiscono ad una superficie si moltiplicano e grazie alla capsula riescono ad aderire saldamente alla superficie. Il biofilm svolge un ruolo fondamentale nel promuovere la colonizzazione di corpi estranei come protesi o cateteri vascolari o urinari.

Plasmidi

DNA circolare extra-cromosomico. Sono dotati di replica autonoma. Possono essere singoli o in più copie. Codificano per importanti fattori di virulenza: Tossine, Pili e adesine, Enzimi che conferiscono resistenza agli antibiotici, Batteriocine.

Pili o fimbrie

Sono appendici filiformi proteiche che si proiettano al di fuori degli involucri cellulari esterni. Sono presenti prevalentemente nei Gram negativi (circondano la cellula). Originano dalla membrana citoplasmatica e si estendono per 0,2 µm all’esterno. Sono formate dalla ripetizione di subunità proteiche (piline) specifiche per le diverse specie batteriche, organizzate con simmetria elicoidale a formare rigide strutture cilindriche.

1. Pili comuni o fimbrie (adesività): condizionano la patogenicità batterica.

2. Pili sessuali: permettono il trasferimento di materiale genetico extracromosomico (plasmidi), in un processo chiamato Coniugazione batterica.

Flagelli

Sono organi di locomozione che permettono al batterio di muoversi in un substrato liquido. Sono appendici molto sottili, di aspetto ondulato, con spessore che si protendono all’esterno della cellula batterica e sono lunghi 15-20 micron. Sono costituiti da una proteina (flagellina) la cui composizione in aminoacidi varia da specie a specie ed hanno quindi caratteristiche antigeniche (antigene H). La presenza dei flagelli, tranne rare eccezioni, è una caratteristica esclusiva dei batteri di forma cilindrica (bacilli, vibrioni e spirilli). In un batterio possono essere presenti anche più di un flagello. A seconda del numero e della disposizione sulla superficie del batterio, abbiamo:

• Monotrichi: flagello singolo ad un’estremità (P. aeruginosa, V. cholerae).
• Lofotrichi: ciuffo di flagelli ad un’estremità (H. pylori).
• Amfitrichi: flagelli presenti alle due estremità (spirochete).
• Peritrichi: flagelli disposti intorno alla cellula (P. mirabilis, E. coli, C. difficile).

Il filamento elicoidale che protrude dalla cellula è costituito da molecole di flagellina che aggregandosi formano lunghe e numerose catene elicoidali dal cui intreccio si forma il filamento. Un gancio tubulare che collega il filamento al corpo basale. Un corpo basale che ancora il flagello alle strutture cellulari e rappresenta il “motore” del movimento rotatorio del flagello.

Gram negativi: 4 anelli - anello L (lipopolisaccaride), anello P (peptidoglicano), anello S (supermembrana), anello M (membrana). Gram positivi: 2 anelli - anello P, anello M.

Il flagello è un fattore di virulenza in quanto permette al batterio:

• Migrazione di E. coli da intestino alle vie urinarie.
• Penetrazione del film mucoso gastrico da parte di H. pylori.
• Migrazione verso il circolo ematico (disseminazione).
• Invasione cellulare (E. coli).

Spore

Le spore sono forme di resistenza prodotte da alcune specie batteriche in condizioni di crescita sfavorevoli. Sono metabolicamente inerti, presentano un basso contenuto di acqua e la loro peculiare struttura le rende particolarmente resistenti a:

• Essiccamento
• Alta temperatura
• Radiazioni ultraviolette
• Disinfettanti

Alcuni batteri Gram+ appartenenti ai generi Bacillus (aerobi) e Clostridium (anaerobi): Bacillus cereus (tossinfezioni alimentari), Bacillus anthracis (antrace), Clostridium tetani (tetano), Clostridium botulinum (tossinfezioni alimentari), Clostridium perfringens (gangrena gassosa).

All’interno della spora ritroviamo il citoplasma circondato da una membrana citoplasmatica al cui lato interno è addossato il materiale nucleare. È caratterizzata dall’avere vari rivestimenti. Dall’interno verso l’esterno abbiamo:

• Cortex costituita prevalentemente da peptidoglicano rudimentale, ac. dipicolinico e calcio
• Coat, costituito due rivestimenti di natura proteica
• Esosporio costituito da proteine, polisaccaridi e lipidi

Importanza in laboratorio

Controllo di qualità delle autoclavi. Le spore di alcune specie batteriche vengono utilizzate come indicatori per verificare l’efficacia della sterilizzazione da parte delle autoclavi. Le spore vengono uccise a 121°C, 15’, 1 atm. Le cellule vegetative vengono uccise a 100°C. L’assenza di spore al termine del processo è indice di avvenuta sterilizzazione.

Affinché un batterio sia in grado di vivere e di replicarsi deve mettere in atto processi metabolici. Il metabolismo comprende tutte le reazioni chimiche che avvengono in una cellula.

1. Catabolismo: Reazioni di demolizione o di degradazione delle macromolecole (producono energia).
2. Anabolismo: Reazioni di biosintesi di macromolecole (hanno bisogno di energia).

Reazioni cataboliche

La fonte primaria di energia è rappresentata dai carboidrati (glucosio). Per produrre energia dal glucosio i batteri possono utilizzare, a seconda delle loro caratteristiche biochimiche due importanti processi: Respirazione e Fermentazione.

Respirazione: Nella respirazione batterica il composto organico che viene più comunemente degradato è il glucosio. Viene degradato ad acido piruvico tramite l’insieme delle reazioni che costituiscono la via della glicolisi. La glicolisi è poi seguita dal ciclo di Krebs. È un processo ad elevato rendimento energetico: vengono infatti prodotte 38 molecole di ATP.

Fermentazione: Consiste in un processo biologico, in assenza di ossigeno, finalizzato alla produzione di energia e nel quale sia il composto iniziale da ossidare (per es. glucosio) sia il prodotto finale ridotto (accettore di elettroni come etanolo, butanolo ecc.) sono rappresentati da materia organica. La fermentazione dei carboidrati rappresenta il più importante e diffuso tipo di fermentazione nel mondo batterico e quella tipica è la fermentazione del glucosio.

Nei batteri ci sono numerosi tipi di fermentazione del glucosio che prendono il nome dal prodotto finale organico, come:

• Omolattica (ac. lattico)
• Alcolica (etanolo)
• Propionica (ac. propionico)
• Formica (ac. formico)

L’energia ricavata dai processi catabolici accumulata nelle molecole di ATP, è utilizzata per svolgere molteplici funzioni quali:

• Il trasporto delle sostanze attraverso la membrana citoplasmatica
• I processi biosintetici deputati alla sintesi di tutti i componenti della cellula batterica (sintesi dei polisaccaridi, sintesi dei lipidi, sintesi del peptidoglicano, sintesi degli aminoacidi, sintesi degli acidi nucleici)
• Il movimento dei flagelli

Crescita batterica

I batteri attuano in gran parte una riproduzione asessuata per fissione binaria (schizogonia o scissione semplice) alla fine della quale sono prodotte due cellule figlie equivalenti. Le tappe fondamentali del processo di replicazione sono:

1. Duplicazione del DNA e del suo sito di attacco alla membrana plasmatica
2. Accrescimento cellulare con conseguente allungamento della cellula ed allontanamento dei due cromosomi
3. Formazione di un setto di divisione cellulare attraverso l’invaginazione della membrana plasmatica
4. Formazione di un setto di divisione