Microbiologia introduzione - chemiotassi

Galileo e il metodo induttivo-deduttivo

Con Galileo si viene a delineare il primo metodo scientifico, cioè arrivare a conclusioni inconfutabili attraverso osservazioni sperimentali. Il metodo scientifico si basa sull'osservazione sperimentale e su due processi mentali: induzione e deduzione. Questo metodo consta di 4 fasi:

• Osservazione sotto forma di esperimenti
• Catalogazione, misurazione e selezione dei dati accumulati con la conseguente ricerca di uno schema di inquadramento seguendo le leggi matematiche
• Proposta di costruzione di un'ipotesi (fase induttiva), cercando di inquadrare i dati sperimentali raccolti in una visione generale
• Verifica della legge (fase deduttiva) attraverso la costruzione di un modello che possa essere valido a livello generale.

Si esegue dunque la verifica sperimentale e la ripetizione dell'esperimento.

Popper e il metodo ipotetico-deduttivo

Popper afferma che il metodo scientifico non può essere induttivo. L'unico metodo con il quale procedere è per tentativi ed errori, cioè proporre ipotesi e verificarle. Dopo aver sviluppato un'ipotesi, si prosegue scegliendo opportunamente le informazioni necessarie per saggiarla e attraverso le analisi ottenute da osservazioni ed esperimenti, si arriva alla conferma o alla falsificazione dell'ipotesi di partenza. Nel primo caso si procede al test di conferma, nel secondo alla costruzione di una nuova ipotesi.

Pasteur

La maggior parte dei primi biologi riteneva che gli esseri viventi più semplici potessero generarsi spontaneamente dalla polvere o dal fango. Questa teoria fu prima smentita da Francesco Redi nel 1600 e poi da Louis Pasteur. Redi dimostrò che le larve presenti nella carne in decomposizione non si generano spontaneamente ma derivano dalle uova deposte sulla carne da parte delle mosche.

Egli prese due pezzi di carne e li mise in due barattoli, uno aperto e l'altro chiuso con una reticella. In quello aperto comparvero le larve, nell'altro no. Se la generazione spontanea delle larve era stata smentita, in seguito alla scoperta dei microrganismi, fu ripreso lo stesso quesito: in un brodo lasciato all'aria, i microrganismi originano spontaneamente? La risposta, negativa, arrivò da Pasteur.

Egli dimostrò che nell'aria sono presenti strutture molto simili ai microrganismi trovati nel materiale in putrefazione e che trattando l'alimento in modo da distruggere ogni organismo vivente responsabile della sua contaminazione, cioè rendendolo sterile, e proteggendolo da ulteriore contaminazione, si sarebbe potuto ovviare alla putrefazione. Avendo già avuto modo di osservare che il calore era effettivamente in grado di uccidere gli organismi viventi, Pasteur lo usò per eliminare i contaminanti (sterilizzazione).

Egli introdusse in un pallone di vetro a collo lungo, un brodo nel quale in apparenza, si generavano “spontaneamente” microrganismi. Piegò a “S” l'estremità del pallone in modo da consentire l'ingresso dell'aria ma impedire la contaminazione del brodo da parte della polvere e dei batteri in essa presenti. Fece bollire il brodo in modo tale da uccidere tutti i microrganismi presenti all'interno. Lasciato raffreddare, Pasteur constatò che il brodo non aveva generato batteri. Inclinò poi il pallone in modo tale da far venire a contatto il brodo con la polvere presente all'estremità del collo ripiegato e dopo qualche giorno il brodo divenne torbido (presenza di microrganismi); fu confutata così l'idea della generazione spontanea dei microrganismi che provengono e vengono trasportati con la polvere.

Postulati di Koch

I postulati di Koch sono criteri volti a stabilire la relazione causa-effetto che lega un microrganismo a una malattia. I suoi primi lavori riguardano il carbonchio o antrace, una malattia dei bovini che può occasionalmente trasmettersi all'uomo. Il carbonchio è causato da un bacillo sporigeno, Bacillus anthracis, di cui il sangue dell'animale infetto contiene numerose e grandi cellule.

Questi microrganismi erano sempre presenti nel sangue degli animali morti di questa malattia. Dimostrò inoltre che prelevando del sangue infetto e iniettandolo in un animale sano, quest'ultimo contraeva la malattia e ne moriva. Ripetendo questo passaggio più volte, si ottenevano le stesse conclusioni e inoltre le cellule batteriche erano sempre presenti e conservavano la capacità di generare questa malattia anche dopo essere coltivati all'infuori degli ospiti.

Sulla base di questi esperimenti formulò i 4 postulati:

• Il microrganismo deve essere presente negli animali malati e non presenti in quelli sani.
• Il microrganismo sospetto deve poter essere coltivato in una coltura pura all'infuori dell'organismo ospite.
• Cellule di una coltura pura dell'organismo sospetto se inoculate in un organismo sano, devono dare la malattia.
• I microrganismi devono poter essere re-isolati da un animale infetto e coltivati di nuovo in laboratorio, dimostrando di essere identici all'organismo originale.

Filogenesi

L'evoluzione rappresenta il cambiamento in una linea di discendenti che nel tempo porta alla formazione di nuove specie o varietà di esse. I rapporti evolutivi tra le forme viventi sono oggetto di una disciplina che si chiama filogenesi. Gli studi di evoluzione molecolare sui procarioti si basano principalmente sulla comparazione di sequenze di macromolecole fondamentali, gli rRNA, eccellenti orologi molecolari in grado di misurare correlazioni evolutive. Poiché tutti i microrganismi contengono ribosomi e quindi l'RNA ribosomiale, queste molecole possono essere usate per costruire un albero filogenetico. I geni codificanti gli RNA ribosomiali di due o più organismi vengono sequenziati e le sequenze allineate e comparate base dopo base al computer.

Maggiore è la differenza nella sequenza degli RNA ribosomiali tra due o più microrganismi, più grande è la loro distanza evolutiva. Queste distanze vengono espresse come alberi filogenetici.

Alberi filogenetici

Le cellule vengono inizialmente lisate, il gene codificante l'RNA ribosomale viene isolato e amplificato mediante la produzione di molte copie identiche con la tecnica della reazione polimerizzazione a catena (PCR). Il gene viene sequenziato e le sequenze ottenute sono allineate al computer. Un algoritmo produce la comparazione delle coppie di basi e genera un albero che descrive le differenze nella sequenza di RNA ribosomale tra i diversi organismi analizzati. Avremo un ramo, la cui lunghezza indica la distanza genetica e un nodo che è il punto in cui divergono le due linee primitive.

Un albero rooted viene visualizzato tramite una struttura ad albero che si sviluppa a partire da un unico nodo, rappresentante il più recente antenato comune delle forme di vita che si trovano alle estremità dell'albero. In questo modo, un albero filogenetico radicato è in grado di fornire informazioni sia sulla correlazione genetica esistente tra gli organismi presenti sulle sue ramificazioni, sia sui rapporti evolutivi che intercorrono tra gli stessi. Accetta come vera l’ipotesi dell’orologio molecolare e i nodi stanno in un preciso ordine temporale.

Un albero unrooted, al contrario, illustra le relazioni genetiche che intercorrono tra gli organismi che si trovano ai suoi apici, ma non fornisce alcuna informazione in merito alla loro evoluzione.

Orologi molecolari

Sono geni o proteine che sono misura dei cambiamenti che sono avvenuti nel corso dell’evoluzione, le differenze di sequenza nucleotidica o amminoacidica di macromolecole simili da un punto di vista funzionale (omologhe), sono una funzione della loro distanza evolutiva. Affinché la suddetta molecola sia adeguata è necessario che:

• La molecola sia distribuita universalmente nel gruppo in esame
• La molecola sia funzionalmente omologa in ogni organismo
• Ogni molecola abbia regioni di sequenza conservate per poter allineare correttamente le molecole da confrontare
• La sequenza della molecola prescelta dovrebbe riflettere il cambiamento evolutivo avvenuto in un organismo considerato nella sua interezza, infatti, tanto maggiore è la distanza filogenetica da misurare, tanto più lenta deve essere la velocità con la quale la sequenza cambia

Grazie alle loro caratteristiche, gli RNA ribosomiali si sono rivelati degli eccellenti orologi molecolari. Si tratta infatti di molecole relativamente grandi. Il 16s è stato utilizzato per la filogenesi dei procarioti, mentre negli eucarioti il 18S. La distanza evolutiva, cioè la percentuale di nucleotidi non omologhi tra gli RNA di una qualsiasi coppia di organismi, può essere misurata tramite la differenza nella sequenza nucleotidica. Minore è la differenza, minore sarà la distanza evolutiva.

Specie procariotica

Una specie procariotica è un insieme di ceppi che hanno una composizione in G+C simile.

Ceppo: è una popolazione di organismi che è distinguibile da altre popolazioni in una particolare categoria tassonomica.

Biovar: all'interno di una specie, sono ceppi varianti, caratterizzati da differenze biochimiche o fisiologiche.

Serovar: hanno invece proprietà antigeniche diverse.

Il contenuto in GC è definito come la percentuale di guanina+citosina presente nel DNA di un organismo. Se il contenuto in GC differisce per più del 5%, due organismi avranno in comune poche sequenze di DNA e risulteranno poco correlati. Questo contenuto viene determinato anche in base alla temperatura di denaturazione del DNA. Poiché le coppie di basi GC sono unite da due legami idrogeno, all'interno del doppio filamento, troveremo più legami a idrogeno nei DNA con maggior contenuto in GC e si denaturerà a temperature più elevate.

Microscopio in campo chiaro

Microscopia basata sulla proprietà della cellula di assorbire o disperdere la luce. Colorazione generalmente necessaria. È un sistema di due lenti convergenti dette, rispettivamente, obiettivo e oculare. L'oggetto da osservare viene posto davanti all'obiettivo, che ne fornisce un'immagine reale, capovolta e ingrandita. Questa immagine viene fatta cadere davanti all'oculare a distanza opportuna, che ne dà un'altra, virtuale ed ingrandita. Obiettivo ed oculare sono inseriti all'estremità di un tubo metallico della lunghezza standard di 16 cm, appoggiato su un sostegno detto stativo, il quale regge anche il piatto dove viene posto il preparato da osservare.

La distanza tra obiettivo e preparato può essere variata con un movimento del tubo, regolato da due viti, quella macrometrica per spostamenti rapidi e quella micrometrica per la messa a fuoco. Con movimenti laterali del piatto si può esaminare la parte del preparato che interessa di più.

Sotto il piatto si trova il condensatore che fa convergere sull'oggetto la luce prodotta da una lampadina incorporata nel microscopio: il condensatore è munito di un diaframma regolabile. Oculare e obiettivo costituiscono il sistema ottico del microscopio; tubo, piatto, stativo, viti e condensatore, le parti accessorie.

Caratteristiche per osservare al microscopio

• Ingrandimento: è il rapporto fra le dimensioni dell'immagine e quelle dell'oggetto e dipende dal prodotto degli ingrandimenti forniti dall'oculare e dall'obiettivo, misurati di solito in diametri.
• Potere di risoluzione: capacità di mostrare due punti adiacenti come distinti. La distanza minima alla quale due punti sono visti come distinti si chiama limite di risoluzione (D).
• Contrasto: Il contrasto dipende dal diverso assorbimento della luce da parte delle strutture osservate, che risultano così più o meno intense, formando un'immagine. Poiché la maggior parte dei componenti cellulari è trasparente alla luce visibile per l'abbondanza di acqua, non si rivelerebbe quasi nessuna struttura cellulare; si preferisce perciò colorare il preparato con sostanze che si legano in modo selettivo ai componenti delle strutture cellulari, diversificandole.

Campo scuro

Ideale per l’osservazione di superfici. Illuminazione laterale. Colori “falsi”. Gli oggetti appariranno chiari su uno sfondo scuro. In questo modo è possibile osservare oggetti anche al di sotto del potere di risoluzione del microscopio ottico, come fasci di flagelli. Un particolare tipo di condensatore consente di deviare i fasci di luce in modo che le lenti frontali dell’obiettivo siano attraversati soltanto dai raggi di luce diffratti o diffusi dal preparato. Soltanto la luce che colpisce il campione e viene riflessa in alto verso l’obiettivo forma l’immagine.

Contrasto di fase

Aumenta il contrasto tra cellule e mezzo circostante, sfruttando la differenza di “fase” della luce che attraversa le cellule in osservazione. Ideale per l’osservazione di campioni in vivo. Si evita l'utilizzo di coloranti e fissativi che spesso comportano notevoli alterazioni strutturali. Sfrutta le lievi differenze di spessore e della natura chimica (indice di rifrazione del materiale da osservare) rispetto al mezzo circostante.

Le differenze di spessore ritardano l’attraversamento della luce cioè si convertono in una deviazione di fase della luce. Mediante il microscopio a contrasto di fase è possibile andare a determinare tali cambiamenti e convertirli in differenze di densità così da ottenere delle informazioni utili circa la composizione di cellule e tessuti analizzati.

Si basa sul fenomeno dell'interferenza luminosa. Amplifica le “differenze di fase” tra cellule e ambiente, rendendo visibili componenti trasparenti ma di indice di rifrazione differente da quello del mezzo.

• Diaframma anulare/anello di fase (sotto il condensatore)
• Lamina anulare (ritardatore, posteriore all’obiettivo)

Microscopio a fluorescenza

Dispongono di lampade alogene (mercurio o tungsteno) che hanno una forte emissione all’estremità inferiore dello spettro del visibile. Inoltre, possiede due filtri speciali:

• Filtro di eccitazione (tra la luce e il campione): lascia passare solo la luce a breve lunghezza d’onda.
• Filtro barriera (tra oculare ed obiettivo): blocca le radiazioni a lunghezza d’onda minore, che sono passate attraverso il filtro eccitatore, ma lascia passare quelle più lunghe emesse dagli oggetti fluorescenti.

Se il preparato non è colorato, bisogna utilizzare dei particolari reagenti. Fluorocromi: reagenti speciali in grado di assorbire la luce ad una determinata lunghezza d’onda e di emetterla poi nuovamente ad una lunghezza d'onda maggiore, i più usati sono il DAPI, syber green. I diversi fluorocromi presentano ognuno un proprio spettro di assorbimento specifico, in funzione della struttura interna delle molecole a fluorescenza.

Reazioni di immunofluorescenza

• Metodo diretto: l’anticorpo marcato si lega all’antigene, formando un immunocomplesso fluorescente
• Metodo indiretto: l’anticorpo non marcato si lega all’antigene, l’immunocomplesso; quindi viene aggiunto un anticorpo anti-Ig marcato che si lega all’immunocomplesso, rendendolo fluorescente.

Microscopio confocale

Osservazione ad alta risoluzione di un singolo piano del campione, eliminando gli aloni dovuti alla luce diffusa dai piani fuori fuoco del preparato. Lo strumento opera nel campo dei microscopi ottici, ed è costituito da un normale microscopio ottico a cui viene sovrapposto un apparato che si occupa di illuminare e rilevare l'immagine di un campione illuminato con una scansione punto a punto.

Elettronico a trasmissione

Fa attraversare un campione molto sottile da un fascio di elettroni, quindi con un insieme di magneti (che funzionano come le lenti del microscopio ottico) ingrandisce l'immagine ottenuta che viene infine proiettata su uno schermo fluorescente, rendendola visibile. Dà immagini della struttura interna dell'oggetto esaminato.