Microbiologia introduzione - chemiotassi

MICROSCOPIO A FLUORESCENZA

Dispongono di lampade alogene (mercurio o tungsteno) che hanno una forte emissione all’estremità inferiore dello spettro

del visibile.

Inoltre, possiede due filtri speciali:

1) Filtro di eccitazione (tra la luce e il campione): lascia passare solo la luce a breve lunghezza d’onda.

2) Filtro barriera (tra oculare ed obiettivo): blocca le radiazioni a lunghezza d’onda minore, che sono passate attraverso il

filtro eccitatore, ma lascia passare quelle più lunghe emesse dagli oggetti fluorescenti.

Se il preparato non è colorato, bisogna utilizzare dei particolari reagenti.

Fluorocromi: reagenti speciali in grado di assorbire la luce ad una determinata lunghezza d’onda e di emetterla poi

nuovamente ad una lunghezza d'onda maggiore, i più usati sono il DAPI, syber green.

I diversi fluorocromi presentano ognuno un proprio spettro di assorbimento specifico, in funzione della struttura interna

delle molecole a fluorescenza.

Reazioni di immunofluorescenza

Metodo diretto: l’anticorpo marcato si lega all’antigene, formando un immunocomplesso fluorescente

Metodo indiretto: l’anticorpo non marcato si lega all’antigene, l’immunocomplesso; quindi viene aggiunto un anticorpo

anti-Ig marcato che si lega all’immunocomplesso, rendendolo fluorescente.

MICROSCOPIO CONFOCALE

Osservazione ad alta risoluzione di un singolo piano del campione, eliminando gli aloni dovuti alla luce diffusa dai piani

fuori fuoco del preparato.

Lo strumento opera nel campo dei microscopi ottici, ed è costituito da un normale microscopio ottico a cui viene

sovrapposto un apparato che si occupa di illuminare e rilevare l'immagine di un campione illuminato con una scansione

punto a punto.

ELETTRONICO A TRASMISSIONE

fa attraversare un campione molto sottile da un fascio di elettroni, quindi con un insieme di magneti(che funzionano

come le lenti del microscopio ottico) ingrandisce l'immagine ottenuta che viene infine proiettata su uno schermo

fluorescente, rendendola visibile. Dà immagini della struttura interna dell'oggetto esaminato, al contrario del SEM che ne

dà solo la superficie.

ELETTRONICO A SCANSIONE

ricava l'immagine illuminando con un fascio di elettroni un oggetto anche relativamente grande (un insetto per esempio)

e rilevando gli elettroni secondari riflessi, e può quindi fornire immagini 3D. Può analizzare solo oggetti conduttori o

semi-conduttori. Gli oggetti organici devono quindi essere prima rivestiti con una sottile lamina metallica. Permette di

osservare la morfologia di superficie ed alterazioni della stessa in seguito a trattamenti farmacologici od in particolari

stati fisiologici o patologici di cellule o tessuti Localizzazione di recettori di superficie preventivamente marcati.

COLORAZIONI

La colorazione dei preparati istologici si esegue per rendere visibili i diversi componenti cellulari e tissutali, che essendo

sostanzialmente trasparenti sono quasi invisibili al microscopio (colorazioni morfologiche) o per identificare la natura

chimica e la localizzazione dei costituenti chimici (molecole o gruppi reattivi) di un tessuto (colorazioni istochimiche) o

per evidenziare fenomeni fisiologici delle cellule viventi.

I coloranti normalmente usati nell'allestimento dei preparati istologici presentano un gruppo chimico colorato

(cromoforo) ed un gruppo chimico (auxocromo) che in soluzione acquosa dissocia, presentando una carica libera,

positiva o negativa. Anche i gruppi chimici del substrato (tessuto) in soluzione acquosa dissociano presentando una

carica libera, positiva o negativa. Il legame tra il gruppo auxocromo del colorante ed il substrato avviene sempre tra

gruppi reattivi di segno opposto. In base a questo principio i coloranti sono divisi in più categorie:

-Coloranti Acidi: gruppo auxocromo anionico (-), si legano a componenti basici (+) del tessuto, che sono definiti acidofili

per la loro affinità nei confronti dei coloranti acidi

-Coloranti Basici: gruppo auxocromo cationico (+), si legano a componenti acidi (-) del tessuto, che sono definiti basofili

per la loro affinità nei confronti dei coloranti basici.

Altri reagenti per colorazioni:

- Mordenzanti, sostanze che fissano il colorante od amplificano l’ingombro del campione: fenolo, soluzione iodo-iodurata

- Sostanze decoloranti: alcool-acetone, acido solforico al 20%

Colorazione Gram

La tecnica della colorazione di Gram prevede quattro fasi principali.

FASE 1: Lo striscio fissato a caldo deve essere ricoperto con il colorante cristalvioletto per tre minuti. Così facendo tutte le

cellule batteriche si coloreranno di viola.

FASE 2: A questo punto, si versa sul vetrino la soluzione di Lugol (una soluzione acquosa di e ioduro di potassio,

iodio

definita mordenzante, poiché in grado di fissare il colore) e si lascia agire per circa un minuto.

La soluzione di Lugol è polare e penetra nella cellula batterica dove incontra il cristalvioletto con cui forma un complesso

idrofobico.

Dal momento che la parete cellulare dei Gram-positivi è polare, il complesso idrofobico cristalvioletto-iodio non può

attraversarla rimanendo così bloccato all'interno della cellula batterica stessa.

FASE 3: Il vetrino viene lavato con un decolorante (di solito, o acetone)

alcool

per una ventina di secondi. Dopodiché, si lava con acqua per interrompere

l'azione del decolorante.

Al termine di questa fase, le cellule dei batteri Gram-positivi avranno

trattenuto il colore viola.

Le cellule dei Gram-negativi, invece, si saranno decolorate. Questo avviene

perché l'alcool attacca la struttura lipopolisaccaridica della membrana esterna

tipica dei Gram-negativi e assente nei Gram-positivi, agevolando così la perdita

del colorante precedentemente assorbito.

FASE 4: Sul vetrino viene aggiunto un secondo colorante (safranina) e si lascia agire un paio di minuti.

Al termine di questa fase, le cellule dei batteri Gram-negativi che hanno subìto decolorazione nella fase precedente,

assumeranno una colorazione che varia dal rosa al rosso.

Colorazione Ziehl-Neelsen

La colorazione di Ziehl-Neelsen è un esame di laboratorio che consente di riconoscere la presenza dei micobatteri in un

campione sfruttando la caratteristica alcool-acido resistenza di tali microrganismi. I micobatteri, per la particolare

struttura e composizione della parete cellulare, hanno la capacità di trattenere la colorazione della fucsina basica di Ziehl

anche quando trattati con decoloranti come l'alcool o gli acidi minerali.

1. 1.strisciare il campione in esame su un vetrino portaoggetti, fissarlo al calore e coprirlo con un piccolo rettangolo

(2 cm x 3 cm) di carta da filtro.

2. applicare 5-7 gocce di fucsina fenicata alla carta da filtro completamente bagnata.

3. scaldare il vetrino fino ad evaporazione ma senza lasciarlo seccare. Il riscaldamento può essere ottenuto con

un becco Bunsen o con un riscaldatore elettrico.

4. allontanare la carta con una pinzetta, risciacquare e lasciar scolare.

5. decolorare con la soluzione di alcool-acido per circa 2 minuti, fino a quando non scompare il colorante.

6. eseguire la colorazione di contrasto con blu di metilene per 1-2 minuti.

7. risciacquare, scolare e seccare all'aria per 1-2 minuti.

8. esaminare al microscopio ottico con l'obiettivo ad immersione da 100x.

Colorazioni speciali

colorazione negativa: con negrosina, rivela la presenza della capsula che circonda molte cellule batteriche. I batteri

risaltano come corpi luminosi su uno sfondo nero.

La colorazione delle spore: Le endospore vengono colorate con il verde di malachite, a caldo, e visualizzate col

microscopio a contrasto di fase. Le spore sono colorate in verde, su sfondo rosa-rosso.

La colorazioni dei flagelli: Colorazione di Leifson (sali d'argento).

Struttura e funzioni cellulari

Un batterio con una morfologia sferica oppure ovale è detto cocco. Un batterio a forma cilindrica è definito bastoncello.

Alcuni bastoncelli sono curvi e spesso assumono forme spiraliformi ragion per la quale sono detti spirilli. In molti

procarioti, dopo la divisione cellulare, le cellule rimangono associate a formare dei gruppi la cui forma spesso

caratteristica per ogni microrganismo. Per esempio i Cocchi e i bastoncelli possono formare lunghe catene, alcuni Cocchi

formano sottili strati di cellule mentre altri costituiscono strutture tridimensionali cubiche O irrregolari o a grappolo.

Membrana plasmatica

1. Barriera permeabile in modo selettivo;

2. confine meccanico delle cellula;

3. trasporto di nutrienti e prodotti di rifiuto;

4. sede di molti processi metabolici (respirazione, fotosintesi). Sono presenti enzimi biosintetici che catalizzano le

reazioni terminali di biosintesi di lipidi di membrana e di varie classi di macromolecole che compongono la

parete cellulare batterica (peptidoglicano, acidi teicoici, lipopolisaccaridi e semplici polisaccaridi);

5. sede di generazione e utilizzo di ATP durante il trasporto di elettroni. I componenti della catena di trasporto degli

elettroni, l’ATP fosfotransferasi e i componenti dell’apparato fotosintetico sono localizzati nella membrana;

6. individuazione dei segnali ambientali per la chemiotassi

La membrana citoplasmatica è una struttura sottile che circonda completamente la cellula.

Spessa soltanto 7 nm, questa struttura d'importanza vitale è la barriera che separa l'interno della cellula (il citoplasma)

dall'ambiente.

La struttura generale delle membrane biologiche è un doppio strato fosfolipidico. Dal momento che i fosfolipidi in

soluzione acquosa si aggregano, essi tendono a formare spontaneamente strutture a doppio strato, con gli acidi grassi

rivolti all'interno a costituire un ambiente idrofobico mentre le porzioni idrofiliche rimangono esposte verso il mezzo

esterno acquoso.

La struttura generale della membrana citoplasmatica è stabilizzata da legami idrogeno e da interazioni idrofobiche.

Inoltre, cationi quali Mg2+ e Ca2+ contribuiscono a stabilizzarla grazie a interazioni ioniche con le cariche negative dei

fosfolipidi.

Molte proteine della membrana sono localizzate al suo interno e vengono perciò chiamate proteine integrali di

membrana. Altre proteine, possono essere strettamente associate alla superficie della membrana citoplasmatica e di fatto

funzionare come proteine legate alla membrana e interagiscono con le proteine integrali di membrana in importanti

processi cellulari, come il metabolismo energetico. Alcune di queste proteine associate alla membrana sono lipoproteine

e contengono all'estremità amminoterminale una coda lipidica che àncora la proteina di membrana stessa.

La membrana citoplasmatica, in realtà, è una struttura piuttosto fluida, in cui i fosfolipidi e le proteine hanno un'elevata

libertà di movimento. Esse possono essere quindi immaginate come un mosaico fluido, nel quale proteine globulari,

orientate in modo specifico, si estendono attra