Microbiologia molecolare

Microbiologia molecolare

Introduzione

1.1 Replicazione

La replicazione è un evento fondamentale che consiste nella copia del materiale genetico affinché, in seguito alla divisione, si abbiano due repliche identiche di DNA consentendo la conservazione del patrimonio genetico nelle cellule figlie. Ogni variazione viene definita mutazione e queste possono avere sia un effetto dannoso che rivelarsi utili ai fini dell'evoluzione. Dal punto di vista biochimico, si tratta di un processo di polimerizzazione (formazione di un legame fosfodiestereo).

La duplicazione dei cromosomi di batteri, virus e plasmidi avviene in modo analogo a quella che si verifica negli eucarioti. L'apparato di replicazione è detto replisoma e la sua funzione essenziale è quella di copiare in modo efficiente e fedele l'informazione contenuta nelle molecole di DNA.

La replicazione è:

• Semi-conservativa: il filamento neosintetizzato sarà costituito da un filamento nuovo e uno vecchio. Difatti, durante la replicazione, i due filamenti si separano e ciascuno viene utilizzato come stampo.
• Semi-discontinua: uno dei due filamenti viene copiato a frammenti (di Okazaki) a causa dei limiti della polimerasi, cui è in grado di copiare solo in direzione 5'-3' (che equivale alla direzione del filamento neosintetizzato). Infatti, i due filamenti hanno polarità opposta. Parliamo di semi-discontinuità in quanto il filamento leader (quello 3'-5') viene copiato nella giusta direzione (5'-3').
• Bidirezionale: ha origine in un punto e procede in entrambe le direzioni.

Mentre nei procarioti abbiamo un unico sito di inizio della replicazione (detto replicatore, oriC), negli eucarioti abbiamo più siti di inizio di replicazione su ciascun cromosoma. Negli archea abbiamo una situazione mista in quanto alcune specie hanno un'unica origine di replicazione, mentre altre ne hanno più di uno (sull'unico cromosoma).

In alcuni plasmidi di eubatteri, la replicazione avviene con un meccanismo diverso detto "rolling circle": uno dei due filamenti viene staccato dall'altro (che rimane circolare) e entrambi fungono da stampo.

La replicazione del DNA può essere divisa in 3 fasi:

Inizio: il replicatore, OriC, è lungo circa 250 pb ed è costituito da una serie di elementi ripetuti invertiti e da molte regioni ricche in A-T (così che è necessaria meno energia per denaturarle). Questi due elementi vengono riconosciuti dalla DNA-A la quale si lega alle DNA-A boxes presenti sulla molecola formando il complesso ORC (Origin Recognition Complex). Intervengono quindi le DNA-B, delle elicasi (funzionano consumando ATP) che denaturano la doppia elica separando i due filamenti. Questo complesso è chiamato pre-replication complex e comprende anche le SSB (Single Strand Binding-protein: proteine che stabilizzano il filamento singolo del DNA e lo proteggono dall'attacco delle nucleasi) e la primasi (una RNA polimerasi – DNA dipendente codificata dal gene DNA-G; è attivata dalla DNA elicasi) cui sintetizza corti frammenti di RNA a partire dal DNA che funzionano da innesco offrendo l'estremità 3'OH alla DNA polimerasi. La sintesi dei primer costituisce il primo evento effettivo di sintesi nella duplicazione.

Allungamento: avendo a disposizione ora un'estremità 3'OH libera, la DNA polimerasi può funzionare, legando il 5'P del nucleotide nuovo attraverso un legame fosfodiestereo al frammento preesistente. I due filamenti stampo vengono replicati in maniera differente: continua o discontinua.

• Filamento leader: sintetizzato nella direzione del movimento della forca di replicazione (usando come stampo il 3'->5'); la replicazione è continua e richiede un solo RNA di innesco.
• Filamento tardivo: sintetizzato da 5' a 3' nella direzione opposta del movimento della forca di replicazione (usando come stampo il 5'->3'); la replicazione è discontinua e richiede molto RNA di innesco.

Maturazione: il primer viene idrolizzato da una nucleasi (RNAasi H e da un dominio della DNA pol I che ha azione esonucleasica 5'->3') e viene sostituito da DNA dalla DNA pol I. Inoltre, i nick fra i frammenti di Okazaki prodotti vengono saldati dalla DNA ligasi con legami fosfodiesterei formando così un filamento continuo di DNA.

Termine: la replicazione termina in un sito specifico denominato TER in cui sono presenti delle sequenze ripetute cui vengono riconosciute dalle TBP (Ter Binding Protein) che hanno il ruolo di inibire l'elicasi. La TER è disposta a 180° da OriC (quindi al polo opposto). Si formano 2 forcelle di replicazione che si incontrano proprio in TER.

L'inizio della replicazione è un processo altamente regolato, altrimenti ogni volta che terminerebbe sarebbe subito pronto a ripartire. A tal proposito, svolge un ruolo fondamentale OriC che non sempre è disponibile. Infatti, la proteina SeqA si lega nella regione di OriC impedendo l'interazione con la DNA-A. Inoltre, nel cromosoma di E. coli vi è una regione chiamata datA in grado di legare DNA-A poco distante da OriC. Quando si ha la replicazione quindi viene quasi subito duplicato si legheranno moltissime molecole di DNA-A che, pertanto, non saranno disponibili per dare inizio ad altre replicazioni. In B.subtilis abbiamo invece YabA che regola negativamente la replicazione in quanto interagisce con DNA-A e con una subunità della DNA polimerasi (DNA-N).

1.2 Trascrizione

È il processo attraverso cui l'informazione genetica contenuta nel DNA viene copiata su un RNA complementare, affinché questo possa essere utilizzato per sintetizzare le proteine corrispondenti. Dei due filamenti che compongono la molecola del DNA, soltanto uno è informazionale. Il filamento stampo utilizzato nella trascrizione è chiaramente complementare all'RNA sintetizzato. Quest'ultimo pertanto sarà identico al filamento codificante.

Tuttavia, non tutti gli RNA prodotti verranno utilizzati per produrre proteine (mRNA): altri tipi di RNA sono gli rRNA, tRNA, small RNA e sRNA. L'enzima protagonista della trascrizione è la RNA polimerasi. Sintetizza la molecola di RNA in direzione 5'->3' a partire dal promotore fino al terminatore, delle speciali sequenze presenti sul DNA.

Il tratto di DNA compreso fra il promotore e il terminatore è chiamato unità trascrizionale e viene espresso come unica molecola di RNA, chiamata operone. Nei batteri, una singola unità trascrizionale (e quindi un unico RNA) può comprendere anche più geni: in questo caso parliamo di RNA policistronici.

Nel mondo procariotico, la RNA polimerasi è unica ed è costituita da 5 subunità: in particolare 4 subunità costituiscono il core cui si occupa della polimerizzazione e una subunità sigma responsabile dell'elevata affinità dell'RNA polimerasi per il promotore del gene da trascrivere. La subunità sigma è coinvolta solo nell'inizio della trascrizione ed è un'esclusiva degli eubatteri (non è presente negli archea e negli eucarioti).

Difatti, il gene non è costituito solo da una sequenza codificante: possiede una regione a monte chiamata promotore. Il promotore è un tratto del DNA costituito da regioni conservate consenso situato a monte dei geni che devono essere trascritti. Il promotore è quindi composto da un sito di inizio (solitamente una purina), una sequenza situata a -10 (rispetto al sito di inizio della trascrizione indicato con +1) formata da 6 paia di basi e una sequenza a -35 contenente altrettante paia di basi. Gli elementi -10 e -35 sono separati da un frammento non specifico di circa 17 paia di basi. Queste sequenze vengono riconosciute dalle RNA pol e, in particolare, ciascun fattore sigma riconosce un certo promotore. Dunque, la loro funzione è quella di identificare il primo nucleotide che verrà trascritto (quindi il sito d'inizio della trascrizione).

Quanto più una sequenza promotrice è simile alla sequenza consenso, tanto maggiore sarà l'efficienza con cui viene riconosciuta la RNA pol e quindi maggiore sarà l'efficienza di trascrizione. La sequenza consenso è quella ritroviamo nella maggior parte dei promotori ed è caratterizzata dalle basi TATAAT nella regione -10 e TTGACA a -35. Sono regioni altamente conservate, tuttavia possono variare nei vari promotori. Possiamo distinguere i promotori in forti e deboli: quanto più le sequenze -10 e -35 dei vari promotori si avvicinano alle sequenze consenso, tanto più il promotore sarà forte e la trascrizione più efficiente. Un promotore che contiene al -10 TATAAT sarà quindi più forte di uno contenente TGTAAT. In conclusione, un promotore forte ha sequenze quanto più simili possibile alla subunità sigma della RNA pol, di conseguenza la complementarietà sarà molto forte. Viceversa, il promotore debole ha meno sequenze complementari e l'interazione sarà meno stabile.

Un gene è costituito da un promotore e da una sequenza codificante:

Sono evidenziabili 3 fasi della trascrizione:

Inizio: comprende il riconoscimento e l'attivazione del promotore da parte della RNA polimerasi. Una volta formatosi il complesso DNA-RNA polimerasi, chiamato anche complesso chiuso in quanto il DNA appare ancora intatto, si verifica la denaturazione del doppio filamento in conseguenza al legame fra le sequenze consenso -35 e -10 con il fattore sigma. Dunque, il filamento non codificante fungerà da stampo per la RNA polimerasi e anche in questo caso la sintesi procederà in direzione 5'->3'. Non appena si ha l'entrata del primo nucleotide, il fattore sigma si stacca in quanto perde affinità con il promotore (il ruolo è soltanto quello di riconoscere il punto di aggancio).

Allungamento: detta anche di elongazione; consiste nella polimerizzazione della catena di RNA. Nella fase iniziale della sintesi, l'RNA pol sintetizza e poi rilascia dei corti frammenti di RNA, chiamati frammenti abortivi. È stato ipotizzato che la formazione dei prodotti abortivi servano per fornire l'energia necessaria per rompere le interazioni tra l'RNA pol e il promotore. Dopo la fase abortiva si ha la fase processiva di allungamento del trascritto. I substrati della reazione catalizzata dalla RNA pol sono i ribonucleosidi trifosfato; ogni volta che viene inserito un ribonucleoside, viene liberato del pirofosfato. Il promotore non viene trascritto: l'RNA avrà come primo nucleotide il complementare del +1 situato sul DNA. Molto spesso si hanno dei rallentamenti o delle interruzioni, fondamentali per consentire all'RNA nascente di foldarsi correttamente e per regolare il processo. Difatti, le pause servono a coordinare la trascrizione con la traduzione, cui avvengono contemporaneamente in quanto nei procarioti non è presente un nucleo.

Terminazione: rilascio dell'RNA e distacco dell'RNA polimerasi dal DNA. La trascrizione termina quando l'RNA pol incontra delle sequenze specifiche chiamate terminatore. Sono delle sequenze presenti all'estremità 3' del gene e consistono in una palindrome imperfetta. Questi, possono essere di due tipi:

• Rho indipendenti: questo tipo di terminatore consiste in un tratto di DNA costituito da sequenze palindromiche ricche in G-C seguite da un tratto ricco in A. L'RNA che verrà trascritto, formerà in corrispondenza di queste sequenze una forcina che destabilizza insieme al tratto ricco in U il complesso trascrizionale.
• Rho dipendenti: distacco della RNA polimerasi dal DNA mediato dalla proteina Rho. È una proteina presente in tutti i batteri che si associa all'RNA nascente in una regione ricca in citosine chiamata Rut site (Rho Utilization site) situata a valle della regione codificante. Agisce come un'elicasi che si muove in direzione 5'->3' consumando ATP. Quando Rho raggiunge la polimerasi che è in pausa determina il distacco e avviene il rilascio dell'RNA. Difatti, si crea comunque una struttura secondaria che però non è in grado di segnare la fine della trascrizione ma a causa dell'ingombro sterico che provoca, induce una pausa.

Gli Archea come gli eubatteri possiedono un solo tipo di RNA pol per la trascrizione dei propri geni. Tuttavia, hanno invece un apparato trascrizionale simile a quello degli eucarioti. Difatti:

• La RNA pol è simile alla RNA pol II eucariotica; non hanno un fattore sigma.
• I promotori possiedono una TATA box e un TFB-responsive element (BRE);
• I fattori trascrizionali sono strutturalmente e funzionalmente più simili a quelli eucariotici (TFB e TBP).

1.3 Traduzione

La traduzione è il processo mediante il quale l’mRNA ottenuto dal DNA nella fase di trascrizione viene decodificata in proteine attraverso l’azione dei ribosomi e dei tRNA. I ribosomi sono delle particelle costituite da rRNA e proteine formate da due subunità. Nei procarioti il ribosoma ha dimensioni di 70 S e in particolare la subunità maggiore misura 50 S (è formata da rRNA 23 S e 5 S, nonché da 31 proteine indicate con L: large perché associate alla subunità più grande) mentre quella minore 30 S (rRNA 16 S e da 21 proteine S: small).

Negli archea abbiamo una situazione intermedia in quanto hanno sì subunità 70 S come gli eubatteri ma risultano resistenti agli antibiotici che invece bloccano l’attività ribosomiale di questi. L’A è la tasca in cui “atterra” il tRNA caricato dell’amminoacidi da aggiungere, quello P è quella in cui avverrà invece la creazione del legame peptidico, E è il sito in cui il tRNA scarico viene liberato. I ribosomi hanno 3 siti di legame: A (amminoacidico), P (peptidico) ed E (sito di uscita).

Il tRNA invece funge da adattatore: ciascun amminoacido non viene riconosciuto direttamente dalla tripletta del codone. Il tRNA ha l’aspetto di un quadrifoglio e tridimensionalmente appare come una L capovolta. È considerato un adattatore in quanto riconosce sia lo specifico codone che l’amminoacido corrispondente. All’estremità 3’ ha una sequenza consenso CCA ed è il ribosio di quest’adenina a legarsi all’amminoacido corretto. La regione che invece si appaia al codone sull’mRNA è situata esattamente nella regione opposta a sito di riconoscimento degli amminoacidi. In realtà, il tRNA si lega preventivamente all’amminoacido e poi successivamente si avvicina al codone.

Affinché avvenga il caricamento dell’amminoacido sul tRNA è necessario che l’amminoacido venga preventivamente attivato. L’attivazione costa energia ed è per questo motivo che la sintesi proteica risulta essere energeticamente dispendiosa. L’amminoacido reattivo denominato amminoacil-AMP è ora in grado di interagire con il tRNA. Il legame del giusto amminoacido è guidato da una conformazione ospitale. Nonostante sia termodinamicamente favorita, la reazione di caricamento del tRNA necessita dell’enzima amminoacil-tRNA sintetasi. Questi enzimi sono estremamente specifici, se però si verifica un errore dopo il caricamento, questo non può essere corretto.

L’mRNA batterico ha una lunga sequenza iniziale detta regione 5’UTR (chiamata anche regione leader) che non viene tradotta. Circa 7 nucleotidi a monte del codone di inizio del primo gene codificato dal trascritto c’è una sequenza di fondamentale importanza, la Shine-Dalgarno, che è complementare all’estremità 3’ dell’rRNA 16 S della subunità minore del ribosoma. Dunque, la sequenza Shine-Dalgarno ha il ruolo di promuovere l’interazione del messaggero con il ribosoma.

È possibile suddividere la sintesi proteica (traduzione) in 3 step:

Inizio: il primo evento della traduzione consiste nella formazione del complesso RNA messaggero – subunità 30 S del ribosoma e due fattori di inizio: IF1 ed IF3. A tal punto, arriva il primo tRNA, che, nel caso degli eubatteri è sempre caricato con la formil-metionina; questo perché il codone d’inizio è AUG cui codifica per la formil-metionina in veste di primo codone, altrimenti per la metionina il tRNA iniziatore viene prima caricato con la metionina che poi viene successivamente formilata dall’enzima formilasi. Negli eucarioti e negli archea, come primo amminoacido abbiamo invece la metionina. Il tRNA caricato con la formil-metionina è associato al fattore di inizio IF2, il quale è legato a GTP. Quando interagisce con la subunità 30 S, si ha il rilascio di IF3 consentendo l’associazione della subunità maggiore con quella minore. Il tRNA carico con la formil-metionina si posizionerà nella tasca P del ribosoma e al contempo GTP viene idrolizzato e IF1 e IF-2 vengono rilasciati.

Allungamento: l’elongazione consiste nell’arrivo dei vari tRNA carichi successivi al primo. Il secondo amminoacil-tRNA entra nel sito A legato al fattore EF-Tu che a sua volta è legato al GTP. Il legame dell’amminoacil-tRNA al sito A è accompagnato dall’idrolisi del GTP ed è seguita dal rilascio del complesso EF-Tu-GDP dal ribosoma. L’EF-Tu-GTP verrà poi rigenerato dal fattore EF-Ts, così che possa essere utilizzato nuovamente.