microbiologia

Introduzione

Cos'è la microbiologia?

La microbiologia è una disciplina che studia i microrganismi, cioè organismi non visibili a occhio nudo.

Microscopi e coltivazione

Lo studio di questi microrganismi è reso possibile dai microscopi. Esistono 3 tipi di microscopio:

1. Microscopio ottico: è formato dalla lente dell’obiettivo, che è localizzata immediatamente sopra il campione ed è responsabile della formazione dell’immagine primaria, e dall’oculare che ingrandisce ulteriormente l’immagine primaria. L’ingrandimento totale dell’immagine può essere calcolato moltiplicando il potere di ingrandimento dell’obiettivo per quello della lente oculare. Quindi, siccome il primo ingrandisce 100x e il secondo 10x/15x, il massimo di ingrandimento che il microscopio ottico consente è di 1000x /1500x.
2. Microscopio elettronico a scansione (SEM): produce immagini da elettroni deviati dalla superficie esterna del campione e consente di ottenere immagini tridimensionali.
3. Microscopio elettronico a trasmissione (TEM): forma un’immagine grazie agli elettroni che vengono trasmessi attraverso il campione che si sta esaminando. Consente di vedere delle sezioni di particelle o particelle intere di dimensioni molto piccole e quindi fornisce immagini bidimensionali.

I microscopi elettronici, rispetto a quelli ottici, hanno un potere risolutivo maggiore. Quindi i microscopi sono stati i primi mezzi che hanno permesso lo studio di questa disciplina. Oltre ai microscopi, il secondo strumento per lo studio dei microrganismi è la coltivazione (che in realtà non è adatta a tutti i tipi di batteri, ad esempio molti di quelli del cavo orale). Anche i progressi della biologia molecolare hanno reso possibile uno studio molto approfondito dei microrganismi, per esempio tramite il sequenziamento del genoma.

L'interesse della microbiologia per l'uomo

• Microrganismi come agenti di malattia → esistono in tantissimi tipi, hanno una capacità di evoluzione molto rapida (infatti diventano resistenti agli antibiotici) e sono trasmissibili, quindi si possono diffondere rapidamente a livello di una popolazione causando quelle che vengono chiamate epidemie.
• Microrganismi per la preparazione di farmaci, vaccini (tipo quello per l’epatite B) o diagnostici (biotecnologie sanitarie).
• Microbi come strumento terapeutico → i probiotici sono microrganismi non patogeni che hanno un effetto benefico sulla salute umana e sono normalmente presenti nel nostro intestino. Anche nel caso di trapianto del microbiota fecale i microbi sono usati a scopo terapeutico: questa operazione consiste nel trasferimento di materia fecale contenente microbiota da un donatore sano a un paziente con alterazione del suo microbiota intestinale. Esiste anche il trapianto di microbiota orale.

I microrganismi sono anche agenti di malattie di interesse odontoiatrico come carie, parodontopatie, infezioni post-chirurgiche e altre patologie infettive del cavo orale. Inoltre, mediante le pratiche odontoiatriche i microrganismi possono rappresentare la causa di trasmissione di malattie come epatiti virali (la B e la C) o anche l’HIV. I principali tipi di microrganismi che possono causare malattia nell’uomo sono:

• Virus: agenti subcellulari.
• Prioni: agenti subcellulari.
• Batteri: microrganismi cellulari procarioti. Ogni batterio si indica con due nomi, un primo nome si riferisce al genere, un secondo alla specie.
• Miceti: microrganismi cellulari eucarioti.
• Protozoi: microrganismi cellulari eucarioti.

I virus e i batteri sono quelli di maggiore interesse odontoiatrico. I microrganismi non solo sono importanti per l’identificazione, il trattamento, e la prevenzione di malattie ma risultano essenziali anche a livello ambientale, alimentare e nelle biotecnologie.

Rapporto tra microrganismi ed ospite

Il microrganismo ha un vantaggio per la crescita mentre l’ospite ne è danneggiato. Quando si verifica un parassitismo, si hanno alterazioni strutturali o funzionali dei tessuti dell’ospite e quindi può esserci una manifestazione clinica (malattia). I microrganismi che intraprendono rapporti di parassitismo sono detti microrganismi patogeni.

• Sia il microrganismo che l’ospite hanno un vantaggio: mutualismo.
• Il microrganismo ricava un vantaggio dall’ospite senza essere danneggiato: commensalismo.

Difese nei confronti dei microrganismi

L’organismo è provvisto di difese che sono una caratteristica essenziale e la cui mancanza aumenta il rischio di contrarre infezioni.

• Difese specifiche o immunità adattativa: effettori che si formano in funzione dell’incontro con uno specifico microrganismo. Le difese specifiche per entrare in azione hanno bisogno di tempi più lunghi, si parla di giorni e settimane (il vaccino ad esempio).
• Difese innate o immunità aspecifica: effettori pre-esistenti rispetto al contatto con i batteri, presenti sin dalla nascita. Le difese innate hanno un’azione immediata.

Le difese innate includono sistemi fisici, chimici e cellule in grado di rispondere a ciò che è riconosciuto come estraneo. Queste difese possono essere superficiali, e quindi agire come delle barriere che impediscono la penetrazione dei microrganismi nei tessuti, oppure interne se il microrganismo è già penetrato (come i fagociti che inglobano il batterio e poi, mediante fusione dei lisosomi con il fagosoma, avviano la digestione del batterio stesso). Esempi di difese innate sono: cute, mucose, muco, saliva, lacrime, flussi dilavanti, acidità gastrica (valore di pH molto acido), clearance mucociliare, fattori solubili che bagnano le mucose come il complemento, il lisozima (scioglie la parete batterica) e le difensine e cellule note come fagociti. Le difese specifiche sono delle proteine solubili (anticorpi) o cellule del sistema immunitario.

Condizione dell'ospite rispetto alle difese

Ospite normale → soggetto che ha difese immunitarie sufficienti. I microrganismi che causano infezione nei soggetti normali prendono il nome di patogeni classici. Esempi di patogeni classici sono i virus influenzali, il morbillo, la salmonella, il vibrione del colera.

Ospiti compromessi → soggetto con un corredo di difese, sia innate che acquisite, alterato (a causa, per esempio, di immunodeficienza da HIV, leucemie ecc.). I microrganismi che causano infezione nei soggetti compromessi, oltre ai patogeni classici, sono i patogeni opportunisti (che invece nel soggetto normale non alterano lo stato di salute).

Esempi di malattie batteriche

• Faringo-tonsillite: nella maggior parte dei casi è di origine batterica ed è dovuta a un batterio detto Streptococcus pyogenes.
• Impetigine: è una forma di dermatite ed anche questa quasi sempre è causata dallo Streptococcus pyogenes.
• Lebra: in questo caso l’agente eziologico sono dei microbatteri detti Mycobacterium leprae.
• Colera: l’agente eziologico è il Vibrio cholerae.
• Sifilide: l’agente eziologico è il Treponema pallidum.
• Carie dentale: in questo caso non abbiamo uno specifico agente eziologico.
• Parodontopatia: anche qui la situazione è analoga a quella della carie dentale, quindi non c’è un unico agente eziologico.

Struttura della cellula batterica e dei suoi componenti (fondamentali e accessori) e loro funzioni

Le due caratteristiche fondamentali che differenziano le due cellule procariota ed eucariota sono le dimensioni e la complessità.

Osservazione dei batteri al microscopio ottico

I. Si prende un vetrino porta-oggetti e sulla superficie di esso si fa uno striscio del materiale che contiene le cellule batteriche. Di solito per manipolare i preparati si usa uno strumento chiamato ansa, cioè un bastoncino che termina con un filo di metallo sul cui apice si trova un occhiello (il filo è di metallo perché è sterilizzato).

II. Si fissa il preparato al calore passando il vetrino sulla fiamma.

III. Si copre il vetrino con il colorante, si risciacqua e si asciuga.

IV. A questo punto si può osservare il vetrino al microscopio; per mettere a fuoco all’ingrandimento massimo si deve depositare una goccia di olio di cedro sul vetrino e si pone l’obiettivo su di essa.

Forma della cellula batterica

Generalmente i batteri hanno una forma abbastanza regolare grazie alla presenza della parete batterica. L’unico tipo di batteri sprovvisti di una parete cellulare sono i micoplasmi. I batteri di forma sferica si chiamano cocchi. I batteri al microscopio possono apparire singoli o possono formare degli aggregati; nel caso dei cocchi, se le cellule formano delle coppie si parla di diplococchi (tipo i meningococchi), se le cellule formano delle catenelle si parla di streptococchi (a livello della placca del dente una grande componente batterica è formata dagli streptococchi, i principali responsabili delle carie) mentre se le cellule formano un ammasso tridimensionale si parla di stafilococchi.

Poi ci sono batteri definiti bastoncelli o bacilli. Ci sono vari tipi di bacilli: cocco-bacilli (forma ovoidale), vibrioni (forma a virgola), spirilli. Di solito i bacilli non sono ramificati, a eccezione di alcuni che prendono il nome di streptomiceti.

Componenti fondamentali della cellula batterica

Le componenti che si definiscono fondamentali si trovano in tutte le cellule batteriche e sono:

Cromosoma

Non è delimitato da un nucleo ma si trova preferenzialmente in alcune zone della cellula che prendono il nome di nucleoide batterico. Il cromosoma porta il corredo genico essenziale per la cellula che consiste, nella maggior parte dei casi, in 1 dsDNA circolare chiuso; in alcune eccezioni i batteri hanno cromosomi lineari. Quasi sempre il cromosoma batterico è unico anche se ci sono casi particolari: brucelle (cocco-bacilli) e vibrioni hanno 2 cromosomi circolari, l’Agrobacterium ne ha sempre 2, uno circolare e uno lineare. I batteri sono aploidi quindi una qualunque mutazione può avere un fenotipo che può essere dannoso ma che facilita molto più rapidamente l’evoluzione. Nella cellula procariota sono assenti gli introni ma si può verificare che i geni siano organizzati in un'unità trascrizionale detta operone.

Le dimensioni del genoma variano da 0,5-8 milioni di nucleotidi e riflettono diverse esigenze dal punto di vista adattativo e diversa complessità strutturale:

Vediamo questo concetto tramite questi tre esempi: E. coli si trova nel tubo digerente, quindi in un ambiente anaerobio e molto vasto dove trova molta competizione. E. coli ha un genoma di dimensioni molto ampie. Il genoma di Haemophilus influenzae è quasi un terzo di E. coli perché questo batterio si trova solo nella mucosa respiratoria e quindi l’adattamento è certamente minore. Il batterio Mycoplasma pneumoniae è un esempio di micoplasma, quindi non possiede la parete cellulare e anche questo si trova nella mucosa respiratoria. In questo caso il genoma è ancora più piccolo rispetto agli altri due batteri perché il batterio non ha nemmeno bisogno dei geni per sintetizzare le componenti della parete cellulare.

Il meccanismo di duplicazione del DNA batterico è di tipo semiconservativo e si chiama divisione per fissione binaria: la cellula batterica si accresce, il cromosoma viene duplicato e le due copie migrano alle estremità della cellula. La parete cellulare si approfonda formando un setto nella regione equatoriale della cellula che quando si completa dà origine a due cellule batteriche uguali. La regione in cui questa duplicazione ha inizio prende il nome di origine di replicazione e da questo punto in poi la duplicazione procede bidirezionalmente. Gli enzimi coinvolti in questo meccanismo si aggregano a formare il replisoma che scorre sulla molecola di DNA. Essendo un processo semplice, il tempo di divisione è piuttosto rapido, all’incirca 20-30 minuti. Se quando le cellule si dividono c’è un ritardo nel distacco delle cellule figlie, allora si formano aggregati (streptococchi, stafilococchi). Se la divisione avviene per piani paralleli si formano gli streptococchi (negli aggregati le cellule rimangono comunque separate!).

Citoplasma

Il citoplasma contiene il cromosoma, i sistemi enzimatici, i ribosomi (l’unico organulo della cellula batterica). Inoltre nel citoplasma si trovano alcune componenti accessorie:

• Molecole di DNA accessorie che codificano per funzioni aggiuntive e si chiamano plasmidi.
• Granuli di materiale da accumulo da usare nei momenti di “carestia” tipo il glicogeno, polifosfati e i beta-idrossi-butirrati.

Membrana plasmatica

Come per le cellule eucariote, anche questa è fatta da un doppio strato di fosfolipidi ciascuno dei quali presenta una testa idrofila e due code idrofobiche. Le code si affrontano e formano questa struttura trilaminare che costituisce una barriera idrofobica che trattiene proteine e soluti nel citoplasma e regola il trasporto dei metaboliti. Al posto del colesterolo, nei batteri si trovano gli opanoidi che hanno funzioni simili agli steroli.

Insieme ai fosfolipidi e agli opanoidi, ci sono anche proteine di membrana che svolgono varie funzioni:

• Trasportatori (permeasi): la membrana è molto permeabile all’acqua e ai lipofili, mentre le molecole idrofile e le cariche hanno un grado di permeabilità molto basso e quindi hanno bisogno di questi trasportatori per il passaggio attraverso la membrana.
• Enzimi del metabolismo energetico: nelle cellule eucariote gli enzimi del metabolismo si trovano nel citoplasma e nelle membrane mitocondriali, nei batteri invece sono nella membrana cellulare. I batteri accumulano energia proprio a livello della membrana plasmatica sotto forma di una differenza di potenziale che si crea in conseguenza di un gradiente di protoni. Questa energia viene usata o direttamente oppure viene sfruttata da una ATPsintetasi.
• Sistemi per la secrezione di proteine (dato che i batteri non hanno Golgi e RER): ci sono più sistemi di secrezione di proteine. Il primo è il sistema generale detto sistema SEC che funziona trasportando attraverso la membrana e con dispendio energetico delle proteine specifiche che sono riconosciute tramite sequenze segnale. Quindi le proteine passano nel sistema di trasporto, attraversano la membrana, vengono private della sequenza e così liberate all’esterno come proteine mature. Poi ci sono sistemi particolari fatti diversamente, cioè sono complessi macromolecolari fatti da più proteine che formano una specie di siringa molecolare che si chiama injectisoma. Questo mette in comunicazione il citoplasma batterico con una cellula eucariota bersaglio, quindi i sistemi in questione servono per iniettare proteine nelle cellule eucariote. Le proteine trasferite spesso servono ad alterare queste cellule eucariote a vantaggio del batterio.
• Enzimi per la biosintesi della parete.
• Sensori per parametri ambientali: esempi di parametri sono la temperatura, il pH, l’osmolarità, la concentrazione di ossigeno atmosferico, i nutrienti, la densità della popolazione batterica, le sostanze tossiche (antibiotici). Questi sensori di membrana sono fatti da due componenti proteiche e infatti si chiamano sistemi a due componenti per la trasmissione del segnale. Il primo componente è una proteina trans-membranaria; il dominio esterno di questa proteina percepisce il suo segnale ambientale e quando lo riconosce subisce una modificazione strutturale detta modificazione allosterica che porta ad una autofosforilazione del dominio intracitoplasmatico della proteina trans-membrana. Il sensore attivato trasferisce il fosfato a una seconda proteina che è citoplasmatica e solubile e si chiama regolatore della risposta, la quale in seguito alla fosforilazione cambia struttura e questo cambiamento influenza il legame di questa proteina con sequenze regolative a livello genomico, quindi porta a attivazione/repressione di certi geni che permettono l’adattamento ambientale.

Parete batterica

La parete cellulare è la quarta struttura fondamentale dei batteri che si trova in tutti i batteri tranne nei micoplasmi. Ci sono 3 tipi diversi di parete cellulare:

1. I batteri Gram + sono dotati di una parete fatta da più foglietti concentrici di un polimero che si chiama peptidoglicano.
2. I batteri Gram - sono dotati di una parete fatta da uno strato di peptidoglicano e all’esterno di questa parete c’è una membrana esterna, con struttura diversa da quella della membrana cellulare.
3. I micobatteri (causano la tubercolosi) sono provvisti di una parete costituita da 1 o più strati di peptidoglicano rivestiti prima da polimeri di zuccheri (arabinogalattano) e poi, ancora più esterni, da una sorta di palizzata di lipidi a lunga catena detti acidi micolici. La parete dei micobatteri è:
   • Poco permeabile alle sostanze idrofile, questo aspetto rappresenta una fonte di difesa da molti disinfettanti e antibiotici e anche dall’essiccamento (cioè facilita il trattenimento dell’acqua).
   • Permeabile alle sostanze lipofile.