Microbiologia industriale

LE SCHIUME

Un’altra cosa fondamentale da inserire nel terreno di coltura è l’antischiuma; in un fermentatore da 100 L

quando si inocula un microrganismo aerobio, dal basso bisogna far entrare l’aria che gorgoglia e bolle

venendo dispersa omogeneamente. Ciò che succede è la formazione di una schiuma; il sistema è agitato e

succede che dopo due ore la schiuma si alza talmente tanto di livello che sborda fuori, blocca e si hanno

rischi grandi per l’impianto. È fondamentale aggiungere un antischiuma, ovvero una sostanza aggiunta il

meno possibile che abbassa la tensione superficiale e limita la formazione della schiuma. Le caratteristiche

di un antischiuma ideale sono che costi poco, che faccia effetto subito, che sia efficace a basse

concentrazioni, che abbia un’attività prolungata nel tempo, che sia sterilizzabile e non termolabile e che

sia compatibile con il processo microbiologico. Esistono due tipi: quelli naturali e quelli di sintesi, la cui

struttura chimica non esiste in natura. Gli antischiuma naturali sono gli oli di cotone e di mais: con essi la

schiuma si abbassa di colpo ma il problema è che possono essere una fonte di carbonio e aggiungendoli i

microrganismi li usano e quindi la schiuma risale. È un fastidio perché è necessario monitorare il processo

ma si può fare in modo che a fine processo sia finito e non presente nel prodotto.

Gli antischiuma di sintesi sono molecole che non si trovano in natura, come il PPG o i siliconi composti ad

alta viscosità che si aggiungono a bassissime concentrazioni, non vengono metabolizzati, perdurano per

tutto il processo ma potrebbero interferire nel processo di purificazione.

Correttori di pH

In un terreno colturale serve controllare il pH, il quale tende a diminuire a causa degli acidi organici che

vengono prodotti (lattico o acetico); è fondamentale che il pH sia a livelli compatibili con il processo

microbiologico. Esistono dei correttori che possono essere dei tamponi o acidi o basi aggiunti in risposta a

un segnale; i sistemi tamponanti sono aggiunti alla formulazione dei terreni colturali: in particolare, due

Sali di fosfato vengono aggiunti alla formulazione in modo da bilanciare il pH del terreno oppure possono

essere aggiunte delle polveri come il carbonato di calcio, ovvero il calcare. Il calcare è insolubile a pH

neutri: per togliere il calcare si usa un acido che lo scoglie e lo rende solubile; quando si formula il terreno

colturale si aggiunge un po’ di calcio carbonato così se il pH è neutro si deposita sul fondo ed è inerte. Nel

corso del processo si ha una produzione di acidi organici e quindi si scoglie liberando Ca++ e CH3—e a fine

processo se si misura non c’è più perché è disciolto nel terreno e lo ione calcio può essere utile per il

microrganismo. In alternativa si possono usare degli acidi o delle basi, c’è sempre un pHmetro, ovvero una

sonda che misura l’acidità del terreno: se esso è troppo acido si aggiunge una base come l’ammoniaca; se

invece (raramente) il pH si alza si aggiunge l’acido solforico e questo riporta al pH desiderato.

I precursori

I precursori si usano quando si hanno delle molecole complesse che si vogliono far costruire al

microrganismo; se ci sono molecole complesse da produrre si può facilitare il microrganismo e inserire parti

delle molecole già pronte in modo che il microrganismo non spenda energia per costruirseli da sé (zuccheri,

metili, catene ecc.). Si possono aggiungere parti della molecola per facilitare la costruzione; ad esempio, si

può aggiungere l’acido fenil-acetico che è presente nella penicillina G per la produzione dell’antibiotico.

Questo composto viene legato allo schema della molecola in un secondo memento quindi il microrganismo

deve solo fare il legame; il cobalto è un atomo presente nella vitamina B12 ed è quindi un fondamentale

precursore per la sua costruzione.

L’acqua

Tutti gli ingredienti del terreno sono sciolti in acqua; in laboratorio si utilizza l’acqua distillata pura che non

contiene residui. In un impianto industriale l’acqua distillata si usa molto raramente perché costa molto;

quindi si utilizza l’acqua di rete del rubinetto che costa molto meno e contiene dei Sali che possono anche

aiutare il microrganismo, ovvero dei minerali interessanti. In alcune produzioni come quella della birra

l’acqua di rete deve essere controllata perché sono presenti alcuni elementi deleteri per il processo

produttivo (come il cloro). L’acqua non serve solo a formulare il terreno colturale ma anche per la

termostatazione, ovvero a mantenere il fermentatore a una temperatura adatta durante tutto il processo

fermentativo. L’acqua distillata si usa solo quando serve trasformarla in vapore per usarla nella

sterilizzazione.

TIPI D COLTURA

Per far crescere un microrganismo su scala industriale bisogna considerare una serie di fattori, non basta

un bioreattore per fare un processo efficiente. Bisogna scegliere il tipo di organismo che può essere un

batterio piccolo/lievito/fungo/muffa/cellula vegetale (diverse da microbiche con esigenze diverse) in

quanto ogni tipologia di cellula è trattata in modo diverso; i reattori per le cellule microbiche sono utilizzati

per i batteri i lieviti e le muffe. Bisogna chiedersi se il microrganismo ha necessità di ossigeno o no; dal

punto di vista impiantisco è fondamentale capire se bisogna aggiungere la linea dell’aria o no. Ci sono poi

altri quesiti: il tipo di substrato da usare che può essere solido/gas/melasso; serve anche capire se il

processo va condotto in sterilità o no (non è detto perché processo di produzione della birra non avviene in

sterilità, lievito da pane ultimo stadio non conviene sterile). È fondamentale anche la dimensione: si parla

di scala industriale ma esiste una distinzione. I processi su scala di laboratorio prevedono colture liquide in

beuta; la scala pilota si ha in fermentatori piccoli da 10 a 30 L; la scala industriale si ha per volumi

superiori. Fare uno scale up di un processo vuol dire trasferire i risultati dalla procedura di laboratorio,

all’impianto pilota e poi alla produzione.

Il terreno colturale è l’insieme di tutti gli ingredienti sciolti nell’acqua, il microrganismo non c’è; si tratta di

un mix di ingredienti e non il microrganismo. Quando si preparano i fermentatori si prepara il terreno

colturale, lo si immette, si sterilizza e poi si aggiunge il microrganismo operando un inoculo; di solito si usa

un volume ridotto di cellule nel fermentatore. Le cellule si adattano e iniziano a crescere; il mix tra terreno

e cellule che crescono è la coltura microbica, è un mix di cellule microbiche nel proprio terreno colturale. Il

fermentatore va avanti, il microrganismo raggiunge la fase stazionaria e si scarica il fermentatore: dalla

coltura si possono separare le cellule dalla parte liquida: le cellule sono la biomassa, la parte liquida è il

filtrato colturale dove sono presenti i residui del terreno inizialmente preparato e i metaboliti che il

microrganismo produce e rilascia nel terreno.

Scala di laboratorio

Le prove di colture sono allestite in beuta, ovvero in contenitori tronco-conici che hanno una base larga e

riducono il loro diametro verso l’imboccatura del collo della beuta. Le colture liquide possono essere

allestite in alto strato o basso strato. Nel basso strato il terreno occupa 1/10 del volume della beuta (1L

100mL di terreno), si riempie solo la parte bassa della beuta; si ha molto spazio disponibile. In alto strato il

terreno colturale occupa metà del volume della beuta. Nella coltura a basso strato si ha un’ampia

superficie a contatto con l’aria e l’ossigeno e quindi va bene per i microrganismi aerobi. La coltura in alto

strato invece ha una limitata superficie a contatto con l’ossigeno perché il terreno arriva al restringimento

del collo stretto e quindi è usato per i microrganismi che non tollerano l‘ossigeno. Per far crescere i batteri

lattici si usano colture in alto strato in quanto essi crescono e depositano le cellule più lontano possibile

dall’ossigeno quindi sul fondo della beuta in quanto lì stanno meglio, lontano dalla superficie. Con un

microrganismo aerobio, esso farà un film superficiale vicino all’ossigeno il più possibile. Per migliorare gli

scambi di ossigeno in basso strato si può aggiungere anche l’agitazione, si può agganciare le beute su un

sistema che impone alla beuta un grado di agitazione che muove la superficie e favorisce gli scambi dei gas.

Le colture agitate sono allestite in beute che hanno nella parte in basso una rientranza detta frangiflutto

che fa in modo che quando si ha il sistema agitazione non si formi un vortice centrale o una preferenza di

direzione della coltura ma permette di avere un ambiente turbolento; serve per rompere gli eventuali flussi

e aumenta la turbolenza del sistema. Gli agitatori possono essere esterni oppure dei box a temperatura

controllata.

Scala del fermentatore

Quando i volumi devono essere aumentati si ha un impianto diverso e più complesso; tutta la parte delle

operazioni che vengono svolte per la preparazione terreno, la sterilizzazione e la fermentazione compresa

prende il nome di upstream; quando si spegne, si scarica, la separazione della biomassa e del filtrato e di

lavorazione si ha la fase di downstream. In un impianto industriale si formulano 1000 m^3 di terreno quindi

si necessitano zone per lo stoccaggio della fonte di carbonio, dei Sali, dell’azoto e per il controllo dell’acqua;

tutti questi ingredienti sono pesati singolarmente in un serbatoio che non è quello definitivo ma di

preparazione. Dal serbatoio è poi portato nel fermentatore; la sterilizzazione può avvenire in questo

passaggio o quando è dentro al fermentatore. Se il processo è aerobio c’è una linea dell’aria.

Il fermentatore (domanda!!) Il fermentatore è un contenitore generalmente cilindrico in cui avviene il

processo microbiologico su scala industriale o pilota. Le pareti sono in

vetro pirex quando sono piccoli, mentre di acciaio inox quando sono più

grandi. Il fermentatore è un contenitore cilindrico ad asse verticale, più

alto che largo; di solito l’altezza è almeno il doppio del diametro (se d=1m

h=2m). Questo reattore è munito di un certo numero di entrate e uscite

regolate da valvole che si aprono e chiudono a disposizione; il reattore

non viene riempito per tutta la capacità ma il volume utile è 2/3 di quello

totale (6L massimo 4L). Lo spazio vuoto in testa si chiama testata o

cupola; la parte bassa e quella alta possono avere geometrie diverse

stondato/fine a cono/volume più grande in alto; N è il punto di massimo

del livello di