Microbiologia industriale

TEMPERATURA

La temperatura è un parametro fondamentale, e deve essere controllata perché da essa

dipendono:

Solubilità ossigeno e nutrili

• Diffusione dei soluti nella coltura attraverso le membrane cellulari

• Viscosità della brodocoltura.

•

La temperatura tende a salire durante il processo, e posso tenerla controllata con:

Camicia esterna

 Serpentina interna

 Scambiatore a piastre.



La temperatura tende a salire a causa di:

Reazioni esotermiche del metabolismo microbico

✓ Trasformazione dell’energia meccanica dell’agitatore in calore.

✓

OSSIGENO © Laila Pansera - 31

Il controllo dell’ossigeno in una fermentazione viene fatto attraverso sistemi di aerazione e

agitazione.

Aerazione e agitazione

Il SISTEMA DI AGITAZIONE serve a:

Evitare la sedimentazione delle cellule

 Evitare la formazione di gradienti di concentrazione di metaboliti o sostanze nutritive

 Favorire il trasporto di ossigeno disciolto.



Solitamente i reattori sono dotati di un sistema di agitazione, formato da un albero motore

e una girante. Alcuni impianti, per esempio l’air lift, non ce l’hanno, perché sono impianti

verticali molto grossi e dovrebbero sostenere costi elevati, per cui si sfrutta la spinta

dell’aria per areare la coltura.

L’agitazione è solo rotativa e esistono diversi tipi di agitatori:

Lenti, per microrganismi filamentosi (muffe e funghi)

 Veloci, per unicellulari (batteri e lieviti).



Tra gli agitatori veloci, la girante più diffusa è la turbina Rushton, dotata

di un disco centrale con delle palette a 90° rispetto al disco, con

un’angolazione che può essere variata per ottenere un minor attrito, per i

microrganismi molto delicati.

L’agitazione crea una turbolenta sulla superficie della coltura, che favorisce lo scambio dei

gas. Per gli aerobi la CO è un prodotto di scarto, che fa il percorso inverso dell’ossigeno

2

(microrganismo, bolla, ambiente).

Il SISTEMA DI AERAZIONE serve per portare ossigeno all’impianto di fermentazione.

Quando acquisto un fermentatore, è preferibile che abbia un sistema di aerazione, che

posso tenere spento in caso in cui operi in anaerobiosi.

Le cellule utilizzano ossigeno, ma si fornisce aria, perché l’ossigeno puro è caro ed

esplosivo.

L’aria atmosferica viene immagazzinata e compressa nel compressore a 2 atm. All’uscita dal

compressore c’è una valvola riduttrice che abbassa la pressione dell’aria a 0.5-1 atm. Un

manometro controlla la pressione, poi l’aria passa attraverso una serie di step di

purificazione per essere:

Disoleata

 © Laila Pansera - 32

Deumidificata



Viene poi sterilizzata per filtrazione, attraverso 2 filtri: prefiltro e filtro sterilizzante. Poi

viene inserita nel fermentatore grazie a un flussimetro che ne controlla il flusso.

La portata di aria si misura in vvm: volume di aria per volume di brodocoltura al minuto.

Generalmente nei processi aerobi uso 1 vvm.

Nel fermentatore l’aria viene dispersa tramite il sistema sparger, in modo da passare dallo

stato di gas a quello liquido in piccole bolle, a quello solido nei microrganismi. Più le bolle

sono piccole più le superfici di scambio sono ampie, ma più rischio di creare schiuma.

Devo perciò trovare un compromesso.

Gli sparger sono messi sotto la girante, e possono essere anulari o a pettine.

Sterilizzazione del fermentatore

Durante la sterilizzazione mantengo una blanda agitazione nel fermentatore per:

Evitare la formazione di zone surriscaldate

 Uniforme scambio di calore.



Abbiamo 2 tipi di sterilizzazione:

1. STERILIZZAZIONE CONTEMPORANEA DI FERMENTATORE E BRODO COLTURALE

Può avvenire:

Per iniezione diretta di vapore diluisco il terreno

 

Con vapore compartimentato (camicia, serpentina)



2. STERILIZZAZIONE SEPARATA DI FERMENTATORE E TERRENO COLTURALE

Riduco i tempi morti perché il contenitore vuoto sterilizza in minor tempo

Fermentatore sterilizzato con vapore

 Terreno colturale sterilizzato secondo 2 tecnologie:

 © Laila Pansera - 33

Continua Discontinua

o o

(no danno termico)

Tipi di coltura e impieghi

Abbiamo 3 tecnologie di funzionamento del fermentatore:

BATCH FEED-BATCH CONTINUA

Vi=Vf Vf>Vi Vi=Vf

Sistema chiuso Sistema aerato in Sistema aerato in

ingresso ingresso o in uscita

L’inibizione a feedback segue il seguente principio:

Come funziona la linea di prefermentazione

Per attuare una fermentazione è necessaria una prefermentazione, che serve per passare

dalla scala di laboratorio a quella di produzione. Siccome il passaggio deve essere

graduale, si opera con diversi step, in cui le percentuali di inoculo devono essere tra 0.1-

20%. Solitamente lo scale up prevede incrementi di volume di un fattore di 10:

Beuta reattore da 25L reattore da 250L reattore da 2500L (2,5 m ) reattore da

3

   

35 m .

3

Ad esempio: © Laila Pansera - 34

Preinoculo 4 mL Preinoculo in 8 L di

Preinoculo in 400 Scarico 4 L dopo

in 40 mL di terreno nel

mL di terreno 24h.

terreno fermentatore.

inoculabile. Scarico i restanti 4

inoculabile. 30 °C Incubazione a 30

30 °C x 24h L dopo 48h.

°C

x 24h © Laila Pansera - 35

Biomasse microbiche

Le biomasse microbiche trovano applicazione:

1. Per il loro contenuto: come fonte proteica non convenzionale

2. Per la loro attività su substrati complessi e su molecole particolari

3. Per l’estrazione di metaboliti particolari: lipidi, vitamine, etc.

Gli animali e le piante sono sempre stati le fonti alimentari tradizionali, ma anche i

microrganismi, anche se in minima parte, entrano nella nostra catena alimentare.

Per indurre all’utilizzo delle biomasse microbiche, occorre che i loro prezzi siano

concorrenziali rispetto a quelli delle fonti proteiche tradizionali. La voce che incide

maggiormente sui costi di produzione delle biomasse è il costo del substrato, che incide

per il 50-60% sul costo del prodotto.

Le biomasse presentano delle limitazioni d’uso, dovute a diversi aspetti:

Contenuto di acidi nucleici, che possono causare problemi a livello metabolico in uomo

• e animali

Presenza di sostanze tossiche o cancerogene che residuano nel substrato

• Digeribilità, che in certi casi è limitata

• Possibilità di reazioni allergiche.

•

Il processo di produzione di una biomassa microbica segue alcuni step:

APPROVVIGIONAMENTO dei PREPARAZIONE del terreno

singoli ingredienti che STERILIZZAZIONE del

colturale formato da fonti

formano il terreno colturale di C, N, fattori di crescita, terreno e dell'impianto

ed eventuale pretrattamento etc

delle materie prime grezze

TRATTAMENTO FINALE SEPARAZIONE della STADI DI FERMENTAZIONE

della biomassa e biomassa dal filtrato

STOCCAGGIO colturale

© Laila Pansera - 36

Biomasse da batteri, lieviti e muffe

Esistono diversi tipi di biomasse, delle quali occorre fare qualche considerazione.

BIOMASSE DA BATTERI

pH tra 5-7, non selettivo, ad alto rischio di contaminazione

 Proteine 80%

 MA acidi ribonucleici e RNA, che possono indurre la formazione di acidi urici e causare

 la gotta

Buon profilo amminoacidico, carente di aa solforilati

 Difficili da separare perché molto piccoli, la centrifugazione incide sui costi di

 produzione

Vengono prodotte sia per le preparazioni, sia per la mangimistica.



BIOMASSE DA LIEVITI

pH tra 3.5-5, più selettivi

 Proteine 55%

 Contenuto medio di acidi nucleici

 Più grandi dimensioni, più facilmente separabili

 Colture di lieviti da molto tempo

 © Laila Pansera - 37

Più veloci a crescere rispetto a batteri

 Buon profilo amminoacidico, carente di aa solforilati

 Fonte di vitamine B, integratori alimentari



BIOMASSA DA MUFFE

pH tra 3 e 8, fatti crescere sotto il 5 per contaminazione bassa

 Contengono chitina, non digeribile

 Buon profilo amminoacidico, carente di aa solforilati

 Alcune possono produrre micotossine.



Alcuni sostengono che le biomasse microbiche possono sostituire le fonti proteiche

vegetali e animali, anche perché hanno dei tempi di produzione molto brevi.

© Laila Pansera - 38

Lievito per panificazione

Storicamente i primi ceppi impiegati, residui del processo di produzione della birra,

Saccharomyces uvarum S. carlsbergensis

appartenevano alla specie ( ), in seguito sono stati

S. cerevisiae

sostituiti da , utilizzato per la produzione di etanolo, fino alla messa a punto

del lievito specifico per panificazione (in Olanda, 1781).

Saccharomyces cerevisiae è dotato di un doppio metabolismo:

METABOLISMO FERMENTATIVO

etanolo e CO : fermentazione alcolica

2

Glicolisi 2 acido

1 glucosio

(anaerobia) piruvico METABOLISMO OSSIDATIVO

Ac-CoA, ciclo di Krebs: intermedi

metabolici ed energia

S. cerevisiae

L’utilizzo del metabolismo adeguato da parte di è regolato da 2 effetti:

S. cerevisiae

1. Effetto Pasteur: in assenza di ossigeno fermenta

S. cerevisiae

2. Effetto crabtree: in presenza di ossigeno fa un metabolismo ossidativo

solo se la concentrazione del substrato (fonte di carbonio) è bassa, ossia <50 g/L; se

la concentrazione di substrato è maggiore si passa al metabolismo fermentativo;

sopra a concentrazioni di substrato di 50 g/L, si bloccano gli enzimi del ciclo di

Krebs.

Produzione del lievito da pane

Il processo di produzione del lievito da pane è multistadio, di cui i primi stadi sono in

condizioni di semi-anaerobiosi, in cui fornisco poca aria in modo da mantenere attivi i 2

S. cerevisiae

metabolismi e preservare la capacità fermentativa di ; gli ultimi stadi, sempre

per gli stessi motivi, sono condotti in totale aerobiosi, mantenendo però vivi gli enzimi

fermentativi. Se dovessi condurre il processo in totale aerobiosi avrei più cellule, ma esse

non sarebbero più attive quando si inseriscono nell’impasto, perché non fermenterebbero.

Per cui l’unico sistema per ottenere un numero elevato di cellule che abbiano attività

fermentativa è il multistadio.

L’inoculo è elevato (circa 20-30%), di conseguenza lo sviluppo microbico è limitato a poche

generazioni. Il ruolo chiave è dato dalla concentrazione di substrato: affinché si abbia una

© Laila Pansera - 39

produzione di biomassa occorre che la concentrazione zuccherina sia <50 g/L;

concentrazioni superiori fanno deviare il metabolismo verso la fermentazione.

Il terreno colturale è