Microbiologia industriale

Microbiologia industriale

Lo scopo della microbiologia industriale è quello di sfruttare le capacità di alcuni microrganismi selezionati (e modificati) di produrre un particolare prodotto in condizioni di sviluppo controllato su scala industriale all'interno di bioreattori. In queste strutture è possibile non solo misurare i vari parametri come pH, ossigeno, temperatura e pressione, ma anche regolarli modificandoli in modo da ottenere un habitat costante per l'adeguata crescita dei microrganismi. Solitamente lo sviluppo avviene in cultura sommersa, ovvero in soluzione dove sono presenti anche tutti i nutrimenti indispensabili alla crescita della biomassa. Il nostro compito è perciò ottenere la maggior concentrazione di prodotto avendo substrati a basso costo e nel minor tempo possibile. Solitamente i substrati vengono da scarti di mangimistica (raw material) che non vengono smaltiti.

In un processo industriale è quindi fondamentale il guadagno sul prodotto a cui vanno tolti i costi del substrato non usato e quindi il provvedimento allo smaltimento e alla purificazione e separazione dei prodotti dalla biomassa. Alcuni infatti sono facili da purificare in quanto vengono secreti nel terreno dal microrganismo stesso, altri invece sono da estrapolare dalla biomassa. Le tecniche e i tempi di questi passaggi aggravano notevolmente il prezzo.

Tipologie di prodotti

Biomassa microbica: mi occupo di trovare il microrganismo più adatto per compiere un processo (per esempio fermentazione alcolica) e mi occupo di produrre biomassa che verrà poi usata per creare o trasformare altri prodotti. In questo campo occorre conoscere bene la tassonomia microbica e la trasformazione tramite vettori di clonaggio. Ha un prezzo ragionevolmente basso alta concentrazione e purificazione ottimale (il prezzo è dato dai raw material).

Proteine ed enzimi: mi occupo di produrre grandi quantità di prodotti o enzimi che possono over esprimere o silenziare geni o che migliorano il folding proteico. Un esempio sono i chaperon e l'amilasi. Hanno bassi costi per gli enzimi industriali come lipasi, proteasi idrolasi e pennicillina acilasi, mentre un costo elevato per proteine ricombinanti terapeutiche come insulina, GH, EPO e interferone.

Prodotti del metabolismo

I metaboliti primari sono prodotti che serviranno alla crescita di altri microrganismi come etanolo, acido citrico, acido lattico, vitamine (B12 e acido ascorbico), aminoacidi (glutammato, lisina, treonina e fenilalanina). I metaboliti secondari, come gli antibiotici, vengono prodotti solo da un gruppo ristretto di microrganismi in condizioni particolari, come attinomiceti (streptomiceti), funghi filamentosi e bacillus. Essi producono beta lattamici, tetracicline, microlidi, aminoglicosidi e glicopeptidi che servono per ottenere antibiotici biosintetizzati industrialmente. Il prezzo è elevato a causa della difficile purificazione che deve essere del 100%.

Tipologie di substrato (nutrimenti)

Tutti i microrganismi necessitano di un terreno ricco di nutrimenti che forniscono acqua, fonti di energia, carbonio, azoto, minerali, vitamine e fattori di crescita. La composizione del terreno varia a seconda delle esigenze nutrizionali e delle capacità metaboliche dei diversi microrganismi. È importante distinguere i microrganismi in base a:

• Fonti di energia, che possono essere luce (fototrofi) o chimica (chemiotrofi)
• Fonti di elettroni, che possono derivare da materia organica (organotrofi) o dalla materia inorganica (litotrofi)
• Fonti di carbonio, che possono derivare da CO₂ (autotrofi) o molecole organiche (eterotrofi)

Per i processi industriali si utilizzano esclusivamente organismi chemio-organotrofi. Vi sono però anche organismi che sono incapaci di produrre una molecola (AUXOTROFI) in quanto, grazie a una pressione selettiva da parte del loro habitat, hanno perso il gene (mutazioni). Questi microrganismi possono crescere solo in un terreno con quella molecola presente.

Usiamo terreni o complessi derivati dagli scarti agroalimentari la cui composizione non è ben definita ma che danno rese elevate, oppure terreni sintetici a composizione definita.

Fonti di carbonio

Le fonti di carbonio sono monosaccaridi (glucosio, xilosio), disaccaridi (lattosio, maltosio e saccarosio), oligosaccaridi (matodestrine) o polisaccaridi (amido e cellulosa). Oppure alcoli come l'etanolo, polioli come il glicerolo o acidi organici come acido lattico, acido acetico, aminoacidi e peptidi. Il glucosio in concentrazioni elevate può sfavorire il processo industriale in quanto attua una repressione catabolica su altre vie biosintetiche per la produzione di metaboliti secondari.

La principale fonte di carbonio deriva dal melasso, prodotto di lavorazione della barbabietola da zucchero (la parte acquosa residua dopo l'estrazione dello zucchero), che si presenta come un fluido viscoso di colore bruno rossiccio. Esso contiene circa il 50% di saccarosio e fattori di crescita come le vitamine (tiamina, riboflavina e acido folico). Il melasso può derivare anche dalla canna, tuttavia contiene solo il 30% di saccarosio ma è ricco di biotina.

Altre fonti di carbonio sono il liscivio solfitico (20% esosi), il siero di latte (4-5% lattosio) e la cellulosa (usata però da pochi microrganismi). Posso usare anche il metano o oli come fonte di carbonio.

Fonti di azoto

La maggior fonte di azoto organica si ottiene dal corn steep liquor, un sottoprodotto del processo di estrazione dell'acido dal mais. Ha una concentrazione del 50% di sostanze azotate, minerali e vitamine del gruppo B. Tuttavia, conferisce acidità al terreno culturale, perciò occorre addizionare calcio. Altre fonti sono le farine di soia e di cotone che hanno circa un 45-55% di proteine. Come fonte inorganica è l'azoto atmosferico che, grazie agli azoto fissatori, diventa NH₃, NO₃^-, NO₂^-. Anche i peptoni possono essere usati come fonte organica di azoto e si presentano come polvere bianca molto igroscopica derivata da carne, lievito, soia e caseina.

Fonti di zolfo e vitamine

Le fonti di zolfo includono la cisteina e la metionina come fonti organiche, oppure solfuri e solfati come fonte inorganica. La maggior fonte di vitamine è l'estratto di lievito, che oltre a essere ricco di peptoni è anche ricco di tiammina, riboflavina, biotina, acido folico, ecc. La quantità di biomassa prodotta è correlata alla tesa di ATP da usare per i processi anabolici grazie a fonti di carbonio e potere riducente.

Bioreattori (stirred tank reactor STR)

Il bioreattore è il reattore dove avviene l'intero processo. In laboratorio si utilizzano le beute con capacità fino a 10L, dove è possibile registrare i parametri ma non modificarli. Per processi di scala industriale di portate che variano dai 100000 ai 300000L si usano i bioreattori dove non solo si possono registrare i vari parametri ma si possono modulare. Il bioreattore deve essere costruito con un materiale appropriato:

• Essere sterilizzabile con vapore sotto pressione (sia all'interno sia nell'intercapedine) in modo da mantenere l'asepsi.
• Permettere uno svuotamento rapido e la pulizia completa.
• Resistenza ad agenti chimici e a variazioni termiche.
• Essere resistente alla corrosione.
• Non essere tossico.
• Non deformabile.
• Trasparente.

Per questo si usano materiali lisci e trasparenti facilmente pulibili e senza angoli morti dove possa formarsi del biofilm, come vetro e acciaio elettro lucidato.

Sistemi del bioreattore

Il bioreattore deve avere anche:

• Sistema di agitazione: Serve per il trasferimento di ossigeno, evitando la formazione di bolle molto grandi, mantenere l'omogeneità della cultura e lo scambio termico. Sono caratterizzati da due parametri; numero di flusso (Nq) che indica la capacità di pompaggio del liquido spostato e il numero di potenza (Np) che indica la velocità.
• Esistono due diverse tipologie di agitazione meccanica:
  • Agitatori a flusso assiale che spostano il flusso lungo l'albero come giranti a pale piatte inclinate e eliche marine.
  • Agitatori a flusso radiale che spostano il flusso aspirato sia dall'alto che dal basso e lo spingono verso le pareti come le giranti Rushton, le riganti paddle e agitatori a barre e a disco.
• Sistema di aerazione: Si ha l'insufflazione alla base del fermentatore, mentre la corrente gassosa esausta ricca di anidride carbonica viene raffreddata attraverso uno scambiatore e poi fatta uscire. Per migliorare l'aerazione possono essere presenti spargers che inducono la formazione di bolle più piccole per aumentare la superficie di scambio. È un anello con tanti buchi.
• Termoregolazione: La termoregolazione viene svolta facendo passare acqua calda o fredda o all'interno di una camicia che avvolge tutto il bioreattore o attraverso una serpentina all'interno dello stesso in modo da modulare la temperatura del processo.
• Sensori per misurare i parametri: Vi sono diversi tipi di sensori che permettono di monitorare il processo online. Si misurano temperatura, pH, concentrazione di ossigeno, velocità e potenza dell'agitatore, flusso di gas, pressione, livello di schiuma, concentrazione di biomassa, ecc. Il monitoraggio permette eventualmente di regolare parametri quali pH (introducono acido o basi), temperatura, ossigeno, ecc.

Cultura batch

La coltura batch può essere vista come un'estensione volumetrica di una coltura in provetta o in beuta ed ha una durata temporale definita poiché costituisce un sistema chiuso che contiene un limitato ammontare di nutrienti. In fase esponenziale non solo la concentrazione cellulare aumenta ma lo fa in maniera esponenziale. Avviene un processo definito auto-catalitico in cui, se gli altri parametri restano costanti, la velocità di aumento della biomassa (cellule) dipende dalla concentrazione di cellule presenti nel bioreattore.

μ = Velocità specifica di crescita [kg kg^-1 h^-1]
Rappresenta la quantità di cellule prodotta per unità di tempo e quantità di cellule. Descrive l'evoluzione della coltura nel tempo. μ è costante in fase esponenziale. Dove grazie alla scissione binaria abbiamo una crescita esponenziale della biomassa e dove 2 N a un Tempo di dimezzamento costante pari al ln 2/μ che è caratteristico di ciascun microrganismo in un dato ambiente di sviluppo.

Durante un processo in batch, la variazione della concentrazione di biomassa [x] (o del numero di cellule) nell'unità di tempo, dipende dalla biomassa stessa x (numero di cellule n) e dalla velocità specifica di crescita in quelle condizioni μ. In fase lag e in fase stazionaria la velocità specifica di produzione di biomassa è zero mentre in fase esponenziale è uguale a μ_max. Sebbene μ sia legata ad una serie di variabili in un bioreattore, queste possono essere mantenute tutte costanti tranne la concentrazione di un unico componente S del substrato. Pertanto, se ipotizziamo di mantenere costanti tutte le altre variabili, il valore istantaneo di μ può essere legato esclusivamente all'unico componente essenziale S dalla relazione.

Il consumo di un componente del substrato essenziale allo sviluppo S fa sì che la sua concentrazione prima sufficiente divenga limitante per la crescita cellulare. Equazione di Monod. I valori di μ_max e Ks dipendono dall'organismo, il substrato limitante, il terreno di coltura, condizioni ambientali quali pH e temperatura. Il range di valori per μ_max è tra 0.01 e 3 h^-1. La costante di Monod assume tipicamente valori al di sotto di 0.1 gL^-1. KS è la costante di affinità, ossia la concentrazione del substrato limitante alla quale il valore di μ è la metà della massima. Rappresenta quindi un indice dell'efficienza con cui un microrganismo riesce ad utilizzare il substrato. Se s >> Ks μ = μ_max se invece s << Ks μ è proporzionale a [s].

La resa del processo

La resa di un processo batch è la percentuale di substrato trasformato in biomassa ed in uno o più prodotti: può essere calcolata solo alla fine del processo quantificando i materiali e rapportandoli al substrato utilizzato. La bioconversione può essere quantificata utilizzando il coefficiente di resa Y (è la media delle rese delle varie fasi del processo) che indica la quantità di cellule o di prodotto ottenuti per peso unitario di substrato utilizzato. Y_X/S è coefficiente di resa di biomassa per substrato consumato [g g^-1] in un intervallo di tempo definito Δt. Esprime in termini quantitativi il fabbisogno nutrizionale. qs è proporzionale alla velocità di sviluppo μ, alla sintesi del prodotto qp ed al metabolismo basale della biomassa m.

Coefficiente di mantenimento m (kg kg^-1 h^-1)

La velocità di consumo del substrato qs è data dalla somma di qm (coefficiente di mantenimento detto q sen) + q_sam (biomassa) + q_sem,g (energia). Il mantenimento è necessario a mantenere gradienti di concentrazione attraverso la membrana cellulare, sostituire proteine ed altri componenti che sono degradati, sostenere processi che non supportano la crescita ma prevengono la morte. Il mantenimento è tipicamente 1-10% di qs,max; ma può essere più alto in cellule stressate: poiché il mantenimento è in parte usato per mantenere gradienti di concentrazione ambienti estremi rispetto a concentrazione salina, pH e temperatura determinano un aumento del mantenimento e una riduzione del coefficiente di resa.

Bilanci di materia

La cultura batch è un sistema chiuso perciò non abbiamo né flussi in uscita né in entrata e il volume è costante.

Bilancio di biomassa

Kd è la velocità specifica di morte. Anche nelle migliori condizioni colturali una certa quota della popolazione microbica va incontro a morte con una certa velocità Kd quindi la massa microbica presente ad un qualunque tempo t dovrà essere decurtata di un certo fattore di correzione. Se è trascurabile. Questo fattore è trascurabile in fase log in cui μ >> Kd ma in fase stazionaria diviene rilevante poiché μ ≥ Kd.

Bilancio di substrato

-qs è negativo in quanto è consumato il substrato (cala). M= velocità specifica di consumo di substrato. Se m è trascurabile e Y è circa Y_{x/s em}

Bilancio di prodotto

dove Q_p = αμx+βx velocità di formazione dei prodotti legati parzialmente allo sviluppo. K_den = coefficiente di denaturazione Se è trascurabile avremo uno [p] legata solo allo sviluppo o non legata allo sviluppo.

Produttività nel processo batch

Con il termine di produzione si indica la quantità di biomassa o di prodotti ottenuti alla fine del processo mentre con quello di resa si indica la percentuale di substrato convertito in biomassa o prodotti. La produzione totale si limita a quantificare il prodotto P ottenuto alla fine del processo senza tener conto del tempo e può essere espressa in g. La produttività specifica q_p corrisponde alla velocità di produzione del prodotto/o biomassa e viene calcolata come g di P o di cellule/h. La produttività volumetrica Q è legata alla concentrazione delle cellule o di P per volume unitario è espressa in g/l • h.

Cultura continua

La cultura continua è un sistema aperto dove vi è un flusso in entrata e uno in uscita di volumi uguale, questo permette di mantenere il volume della cultura costante. Nelle culture continue vi è una fase di transizione in cui il microrganismo si adatta ai nuovi parametri e all'habitat. Abbiamo tre tipi di bioreattori continui: chemostato che mantiene μ costante, turbidostato con [x] costante e nutristato con [s] costante.

Il flusso in entrata ci dà un importantissimo parametro ovvero D la velocità di diluizione D=F/V, siccome il volume e il flusso sono costanti anche D è costante. In un chemostato che raggiunge uno stato stazionario, la velocità di crescita specifica è regolata in base alla scelta della velocità di diluizione D, entro il limite μ_max ottenibile, secondo l'equazione di Monod, a concentrazioni S >> Ks ovvero D = μ. Siccome μ dipende da D che a sua volta dipende da F e da Sin, avrò un D critico quando avrò un flusso massimo. D critico è circa uguale a μ_max. Se si supera questa soglia si va in WASH OUT.

Se la velocità della rimozione della biomassa eccede quella della crescita della biomassa, DX >Μx Allora: D > μ. Di conseguenza, la concentrazione della biomassa diminuisce, la concentrazione di substrato aumenta, la velocità specifica della crescita dell'organismo aumenta. Il fermentatore raggiungerà un nuovo steady state X, S, μ. New steady state μ = D.

Bilancio biomassa

Se μ = D e allora Ks - D[x] = Y (Sin- ) μ_max - D ovvero [x] dipende dal Sinem. Se D diminuisce μ è diverso da μ_max se invece aumenta, μ è circa μ_max (vicino alla diluizione critica). Se μ<< μ_max il substrato va in mantenimento dX/dT <0

Bilancio substrato

Bilancio prodotto

Produttività