Microbiologia industriale

CULTURA FED BATCH

La cultura feed batch è un misto tra culta batch e coltura continua. Abbiamo un flusso in entrata di

substrato ma non uno in uscita perciò il volume aumenta linearmente. Solitamente si parte con una

cultura batch con un volume V0 di substrato molto basso che serve a far arrivare i microrganismi in

fase esponenziale dove μ = μmax. A questo punto introduciamo substrato fresco con un flusso

costante.

Feed batch a ciclo unico Il vulume aumenta linearmente mentre la velocità di diluizione

diminuisce in quando se F è costante il volume non lo è D=F/V0+Ft.

Se la biomassa iniziale X0 risulta molto piccola rispetto a quella presente

nel reattore pieno al volume massimo (X0<<Xm), anche X0 può essere

trascurato e l' equazione semplificata in

il substrato aggiunto sia consumato non appena arriva nel fermentatore e, quindi, la

concentrazione di biomassa resti pressoché costante, bisogna imporre D <μm So deve essere

molto più grande di Ks. Mentre in un reattore in steady-state la biomassa X si mantiene costante

perché rimane costante il rapporto D=μ=F/V, in un fed-batch X si mantiene pressoché costante in

una situazione chiamata di quasi steady-state o steady-state dinamico in cui D, e quindi m, è in

costante decremento. Tale situazione può essere raggiunta soltanto con una portata costante e

sufficientemente bassa da mantenere μ praticamente uguale a D.

Bilancio biomassa

Bilancio substrato

Il substrato in entrata viene subito consumato

Bilancio prodotto

Qp è dipendente da μ!

FEED BATCH RIPETUTA RFB

dopo lo svuotamento parziale a fine ciclo, cosa che dovrebbe comportare un equivalente repentino

aumento di m. Quindi all'inizio del 2°ciclo si ha una portata di substrato eccessiva rispetto alla

successiva condizione di equilibrio almeno finché m non

si adegua all'aumentata disponibilità di nutrienti. Ciò comporterà il verificarsi una situazione

passeggera in cui è D>m questa situazione è analoga al wash-out del processo continuo. Nel

caso di un serie di fed-batch successivi comporta una

progressiva perdita di produttività del sistema poiché

all’inizio di ogni successivo ciclo la velocità di sviluppo di

partenza sarà lievemente inferiore alla precedente. A partire dal

secondo ciclo infatti il valore iniziale di D dal punto di

vista matematico è identico al precedente, mentre il

corrispondente valore di μ parte da un valore lievemente inferiore al

precedente. Ciò si verifica perché, quando μ arriva ad

adeguarsi alla nuova disponibilità di S, nello stesso

tempo il volume V in cui è dispersa X è aumentato e

quindi il substrato ha subito già una consistente diluizione tale da non supportare la μm iniziale.

Produttività

Si ha una produttività critica quando ho limitazione di substrato come dal trasferimeno di ossigeno

μ<μmax

Esempi di applicazione

Produzione di amilasi

Il glucosio non si presenta mai in forma libera, ma deriva da un idrolisi acida dal amido. È

necessario quindi produrre a livello industriale l’amilasi I che è un prodotto Bulck. Il problema

fondamentale nel produrre amilasi in batch è quello che una concentrazione elevata di amido

(substrato) è poco stabile e si ha un aumento della biomassa che rende più viscosa la cultura

diminuendo l’apporto di ossigeno OTR. Pe ovviare al problema si usano culture feed batch in

modo da regolare il flusso in entrata di substrato che viene consumato appena introdotto non

aumentando la OTR.

Produzione di biomassa da lievito

S. cerevisiae è un lievito aerobio facoltativo, ovvero può sia respirare che compiere fermentazione.

Nel primo caso produrrà acido lattico e biomassa, mentre nel secondo etanolo e biocarburanti.

Tuttavia subisce l’effetto Crabtree ovvero: l’inibizione della respirazione per aggiunta di glucosio.

A concentrazioni > di 9 g/l di glucosio manifestano difficoltà di sintesi e accumulo di ac. grassi nella

cellula. Tutto questo è dovuto ad una repressione reversibile sulla biosintesi del citocromo che non

premette la respirazione. Il glucosio verrà quindi utilizzato attraverso la fermentazione alcolica

anche in presenza di ossigeno. Per incrementare la biomassa ed evitare l’effetto crabtree si usano

le culture feed batch, dove il glucosio viene introdotto a poco a poco non superando la

concentrazione critica .

Produzione di antibiotici

I microrganismi dopo una prima fase di adattamento al terreno, si trovano in una fase esponenziale

dove la biomassa tende ad aumentare (Batch) poi vi è una fase diauxica (solo per alcuni batteri): in

questa fase il terreno di coltura diventa limitante per la crescita della popolazione a causa della

carenza del principale substrato che viene consumato durante la crescita batterica. Avendo

consumato quasi completamente i principali substrati inizialmente presenti nel terreno, le cellule

iniziano ad utilizzare substrati alternativi (possono essere anche le sostanze di scarto prodotte dal

loro stesso metabolismo). In questa fase la popolazione tende a rimanere costante. Infatti i

microrganismi hanno pian piano consumato tutto il glucosio presente.

Fase post-diauxica (solo per alcuni batteri): una volta attivati i pathway adatti a sfruttare i substrati

secondari presenti nel terreno, le cellule continuano a crescere e a dividersi sebbene più

lentamente rispetto alla fase esponenziale. Nella fase stazionario utilizzano non più glucosio ma

etanolo e si produrranno i metaboliti secondari come appunto gli antibiotici. Se confrontiamo la

resa di questo processo in batch e in feed batch ci accorgiamo che in feed batch c’è una resa

nettamente superiore in quando la fase stazionaria è allungata dal continuo apporto di nutrimento.

Ossigeno

La maggior parte delle reazioni è in condizioni aerobie, perciò è importantissimo l’apporto di

ossigeno alla cultura. La cellula assimila ossigeno esclusivamente dalla soluzione acquosa è

quindi necessario solubilizzare l’ossigeno. La solubilizzazione del ossigeno è determinato da molti

fattori come temperatura soluti e pressione.

La legge di Henry ci dice che la solubilità p legata alla pressione parziale del gas.

C* = Pi/H dove Pi è la pressione parziale (solitamente un atmosfera) e H è la costante di henry che

a 25 gradi è 38.8. C* indica la concentrazione di saturazione del terreno. Solitamente è posta

uguale a DOT 100% ovvero a un terreno saturo di ossigeno.

Tre sono le principali fasi di trasferimento dell’O2 dall’aria alla cellula:

• Trasferimento di O2 dalla bolla d’aria alla soluzione (bulk liquid)

• Trasferimento di O2 disciolto nella soluzione attraverso il brodo fino alla cellula (↑ agitazione)

• Assunzione (uptake) di O2 disciolto da parte della cellula (molto veloce)

Nella cultura l’ossigeno viene fornito attraverso un sistema di areazioni indichiamo OTR la velocità

con la quale l’ossigeno si solubilizza nel terreno. OTR = Kla (C*-C). Si ha che Kl è il coefficiente di

trasferimento e a l’area di scambio. Insieme ci danno l’efficienza del bioreattore nel fornire

ossigeno. Per C invece si intende la concentrazione di ossigeno disciolto.

La velocità è 0 quando il microrganismo non respira e se Kla è piccola la riserva di ossigeno è

rapidamente esaurita e C scende sotto Cc. In un sistema non all’equilibrio ovvero nella fase

esponenziale, la concentrazione di biomassa aumenta e la C cala progressivamente, questo

determina a un flusso crescente di apporto di ossigeno che controbilancio il consumo.

Se l’ossigeno è il substrato limitante si avrà una crescita lineare che porterà l’ossigeno a scendere

sotto il livello critico e DOT 100 < 0

IL MICRORGANISMO INDUSTRIALE

I microrganismi a livello industriale devono essere isolati dall’ambiente prima di tutto, ovvero

essere coltivabili, poi eventualmente resi migliori tramite ingenerizzazione attraverso la

ricombinazione con Dna derivato da vettori di clonazione. Successivamente devono essere

produttivi, ovvero dare una concentrazione elevata di prodotto in poco tempo (resa elevata),

semplici da mantenere, ovvero il costo del substrato e il mantenimento delle condizioni favorevoli

deve essere basso. Semplicità della separazione e purificazione del prodotto, la stabilità genica,

ovvero deve rimanere costante nel tempo senza alterare il suo genoma e infine non essere

patogeno per l’uomo.

Esistono un immensità di microrganismi, alcuni crescono ovunque e influenzano cambiamenti nella

biosfera, altri vivono in un ecosistema ristretto

come per esempio all’interno del corpo umano

(i colonali).

L’evoluzione è determinata dalle mutazioni

casuali che sono indotte dal ambiente, che può

offrire una selezione positiva o negativa

determinando la sopravvivenza del organismo

con mutazione migliore. Nei primi anni della

loro comparsa oltre il trasferimento genico

verticale dato dalla prole, c’era anche una

maggior tendenza al trasferimento genico

orizzontali che permetteva alle diverse specie di ricombinarsi.

Questo determina la presenza di sequenze conservate in

tantissimi microrganismi come per esempio la sequenza del

gene che codifica per 16S.

Quando il genoma non era ancora codificato, molti studiosi

cercarono un metodo di classificazione per le diverse specie.

Sulla terra sono presenti moltissime varietà di procarioti circa 4-

6 10 circa il 60% del Carbonio totale è contenuto nei procarioti che si trovano nei sedimenti

oceanici e nel sottosuolo.

La lunghezza dei bracci di questo diagramma sono misurate in base alla differenza genica,

fisiologica e metabolica dei microrganismi il punto di origine è detto LUCA. Ricordiamo i funghi, i

batteri gram+ che sono distinti in alto contenuto di G+C e quelle a basso contenuto di G+C.

La tassonomia si occupa della classificazione dei microrganismi ingruppi affine e dare un nome ad

essi. Esistono diverse classificazioni:

Classificazione fenetica ovvero mi baso sono su caratteristiche morfologiche biochimiche e

metaboliche.La classificazione Regno, phylum classe ordine famiglia genere e specie. Solo gli

ultimi due vengono usati nella nomenclatura con ec. B. subtilis dove Bacillus è il genere e subtilis

la specie.

Oggigiorno esistono collezioni interazionali dove posso comprare i diversi ceppi. Se scopro una

nuova specie devo brevettarla mandandone un campione alla collezione internazionale.

METAGENOMICA il metagenoma consiste nel raccogliere un campione in un habitat di

microrganismi e sequenziare tutto il DNA. Questo ha permesso di scoprire anche specie che non

sono coltivabili. Ovvi