Microbiologia industriale

Microbiologia industriale

Lo scopo della microbiologia industriale è quello di sfruttare i MO per produrre “cose” di interesse alimentare, in modo positivo.

Cenni storici

Quando l’uomo ha iniziato a produrre alimenti, è iniziata la microbiologia alimentare e la biotecnologia. Quando venivano preparati gli impasti, una porzione di questi veniva conservata come impasto madre. I MO che c'erano all'epoca erano sconosciuti e il loro utilizzo era inconsapevole. Dalla nascita del microscopio, la microbiologia è cambiata perché si è riusciti a vedere che, ad esempio, un MO dava fermentazione, dal 1600. Come si fa a partire da un MO e ottenere sempre quel prodotto? Da qui nasce la microbiologia industriale. La prima tappa risale al 1781, dove in Olanda si è utilizzato il lievito da pane, mentre prima si utilizzava il lievito da birra. Da qui le tappe si sono ravvicinate. Al secolo dopo risale la prima produzione industriale di acido lattico. Tra la prima e la seconda Guerra Mondiale, c’è stata la scoperta della penicillina che ha consentito agli americani di vincere la seconda Guerra Mondiale poiché era un farmaco in grado di guarire i soldati così da poter vivere più a lungo. Dal dopoguerra si ha la prima descrizione del DNA, da cui nascerà poi la tecnologia del DNA ricombinante.

Biotecnologia

Biotecnologia: applicazione deliberata e controllata di agenti biologici semplici (non uomo o animale) come cellule microbiche, animali o vegetali, vive o morte, o componenti cellulari in operazioni tecnologiche utili per la produzione di BENI e SERVIZI. La biotecnologia non è la manipolazione del DNA, è improprio poiché non è un fattore discriminante per definire un processo microbiologico o meno.

• Beni → biomasse microbiche per nutrizione animale e umana, come:
  • Commodities chimiche (acido citrico, acido glutammico, alcuni amminoacidi)
  • Specialità (antibiotici prodotti per via microbica, vitamine)
  • Probiotici e vaccini
  • Starters, enzimi (agenti chiave della moderna tecnologia alimentare, chimosina)
  • Inoculanti del suolo (azoto fissatori) e delle piante (flora biologica)
• Servizi → trattamento di rifiuti liquidi e solidi
  • Valorizzazione di residui agro-industriali
  • Diagnostica mirata (anticorpi monoclonali) e terapia mirata

I moderni impianti di depurazione si basano sul contatto di una popolazione microbica che utilizza come substrato le molecole presenti nell'acqua che viene depurata. I MO possono dare un valore aggiunto a uno scarto.

Fermentazione

Processo in assenza di O₂. Si usa anche in senso lato, ossia un processo in cui si usano MO sia con O₂ che senza O₂. Equazione semplificata di un processo biotecnologico: X + S → P, dove S è il substrato o terreno di coltura; X sono i MO o cellule microbiche; a dare (STEP FERMENTATIVO) il prodotto P, quello che si intende ottenere.

Cosa si può ottenere? Cellule, metaboliti primari e secondari. I MO per fare il processo industriale si prendono dalle culture in cui ce ne sono molti. I MO ricombinanti hanno subito una manipolazione genetica, hanno il DNA modificato. GRAS: Generally Recognized As Safe, sono certificati e si sa per certo che non producono tossine e non sono patogeni. Esistono convenzioni ufficiali di MO che si occupano di catalogare e mantenere il mondo microbico.

Substrato

È essenziale per un processo biotecnologico. Se si sbaglia a scegliere gli ingredienti colturali, l’azienda può fallire; costituisce il 40% del costo industriale. A livello industriale non è possibile usare gli ingredienti di laboratorio che usiamo noi, ma residui del settore agro-alimentare. Per substrato si intende la fonte di carbonio, vitamine e minerali. Dall’accoppiata MO-substrato, dipende l’intero processo fermentativo; è fondamentale scegliere ingredienti che al MO piacciono e che siano economici. Ottica legata al mondo produttivo. Di solito si parla di materie prime grezze, residui del settore agroalimentare. Bisogna vedere se sono disponibili lungo l’arco dell’anno. Deve essere sterilizzabile, controllo della schiuma. I terreni colturali devono essere aerati e quindi con formazione di schiuma potente. Devono essere evitati prodotti secondari, ovvero che non servono.

Prodotto

Il prodotto di un processo microbiologico sono: MO stesso oppure qualcosa che lui produce. Oppure può essere il prodotto finale che diventa un tutt’uno tra il MO e la materia prima di partenza. I composti che il MO produce sono classificati in due grandi categorie: metaboliti primari e metaboliti secondari. Una cellula è un’entità singola mentre quello che la cellula produce è una molecola.

I metaboliti primari sono quelli che la cellula produce sempre e produrrà sempre quando cresce, quindi quando si sviluppa. Esempio: un batterio lattico produce come metabolita primario, l’acido lattico. Sono metaboliti secondari i composti che vengono prodotti nella fase stazionaria di sviluppo della cellula. Grafico: curva di sviluppo primario. Al tempo zero si ha il MO appena inoculato nel fermentatore, il MO si adatta all’ambiente circostante → fase di latenza. Poi la crescita accelera, raggiunge la velocità specifica massima in cui cresce molto in poco tempo. Poi qualcosa nel terreno inizia a mancare e lo sviluppo rallenta fino alla fase stazionaria. I metaboliti primari si accumulano tanto nella fase esponenziale, il MO cresce tanto e accumula tanto acido lattico. I metaboliti secondari vengono prodotti in fase stazionaria. Nel primo caso, per produrre il metabolita primario, il processo si ferma alla fine della fase esponenziale, non si prolunga il processo perché anche se si prolungano i tempi non si produce più acido lattico di quello che si deve produrre. Nel secondo caso bisogna aspettare di più perché deve arrivare in fase stazionaria. Il processo produttivo durerà di più rispetto al processo che si usa per produrre un metabolita primario. L’acido lattico si fa in 2 giorni a livello industriale, mentre l’antibiotico in 10/15 giorni.

Che cosa si produce?

Biomasse ovvero MO come lievito da pane, probiotici, funghi. Le biomasse sono un prodotto fondamentale e possono essere classificate in biomasse prodotte per il loro contenuto oppure per la loro attività. I funghi, le biomasse per la dietetica, alghe, biomasse preparate e aggiunte per aumentare il valore nutrizionale di un alimento. Le biomasse si possono usare così come sono oppure si possono lisare prima di confezionarle e farne il preparato. Oppure si possono produrre biomasse che servono per la panificazione. Si producono cellule di lievito da pane che si impiegano impastate a farina, acqua e sale che fermentano nell’impasto. Poi ci sono le colture insetticide e i fermenti lattici, questi ultimi possono essere utilizzati per la preparazione del formaggio.

I metaboliti primari vengono prodotti come il risultato del catabolismo della fonte di carbonio. Es: glucosio al batterio lattico da cui si ottiene l’acido piruvico e poi quello lattico, che viene riversato nel terreno colturale dalle cellule. A fine processo si tolgono le cellule che non servono e si purifica l’acido lattico. Sono prodotti finali o intermedi del metabolismo. L’acido citrico non è un metabolita finale, è un intermedio del ciclo di Krebs, sta nel mezzo e non viene accumulato spontaneamente. Per accumularlo bisogna bloccare l’enzima che sta dopo l’acido citrico. Alcuni esempi di metaboliti primari prodotti da MO: acidi organici, aa e loro intermedi (acido glutammico), alcoli (il bioetanolo), polialcoli, carboidrati, vitamine, nucleotidi ed acidi nucleici, lipidi, proteine.

I metaboliti secondari, che sono anche conosciuti come prodotti di biosintesi, sono i più diversi composti che esistono, per molti di essi non si è ancora capito perché il MO inizi ad accumularli. Possono avere un ruolo metabolico ben definito, ma talvolta il ruolo è secondario o non precisabile. I funghi, le muffe e gli actinomiceti sono dei grandi produttori di metaboliti secondari. Hanno uno scheletro chimico molto complesso che ha delle parti riconducibili a qualche molecola che fa parte del metabolismo primario.

Prodotti complessi

Sono prodotti in cui il substrato che viene fornito a un MO viene trasformato e ingloba il MO stesso, per cui alla fine del processo non si riesce a separare il metabolita primario e il substrato. I tipici sono: tutti i tipi di latte fermentato. Le conserve alimentari sono generalmente vegetali o di origine animale come i salumi. Le olive contengono una sostanza che ha un aroma molto amaro e deve essere eliminata. Le olive sono commestibili solo perché sono state sottoposte a un processo fermentativo, poi ci sono i crauti e i formaggi insilati. Un altro tipo sono le macerazioni delle fibre tessili, ad esempio la scoloritura del colore dei jeans. Contenuto dei rifiuti urbani dove ci sono tanti MO. Ci sono prodotti che vengono ottenuti da MO che portano su di sé delle modifiche del codice genetico e sono ottenibili da MO ricombinanti, come riboflavina prodotta da un ceppo di Bacillus, dal punto di vista alimentare si ha la produzione di alfa amilasi; chimosina (caglio microbico, enzima che fa precipitare le proteine del latte); insulina, ormoni della crescita.

Quanto si ottiene da un processo microbiologico?

Tutti i processi, quasi tutti, devono essere classificati in base a quanto si ottiene. Ci sono due termini fondamentali per indicare le forme di resa:

Resa di conversione: esprime il rapporto tra il prodotto formato, in grammi, e il substrato consumato, in grammi. Se si ha una resa dello 0,5 o 50% la metà del substrato consumato è andata a fare prodotto. Se si hanno 100g di fonte di C e si ottengono 50g di prodotto: = 50/100= 0,5 =50%. Nell’acido lattico di solito se si inseriscono 100g di glucosio si ottengono 90g di acido lattico. La resa è =90/100=0,9 o 90%. È un numero adimensionale, esprime quanto il MO converte efficacemente il substrato nel prodotto, va da 0 a 1. 0 vuol dire che non c’è prodotto. =1 o 100% vuol dire che tutto il substrato va a formare il prodotto di interesse.

Resa di fermentazione: esprime i grammi di prodotto per ogni litro di coltura liquida. È un dato più impiantistico. Il nostro datore di lavoro sarà interessato a sapere quanti grammi di prodotto ci sono da rendere nel fermentatore da 100L. La resa di fermentazione è il dato più interessante dal punto di vista economico. Per le biomasse, di solito, è dell’ordine dello 0,5. La resa di fermentazione varia di 20-40 grammi per litro. Un’eccezione è la formazione di lievito da pane, si arriva a 60g/L perché è un processo studiato nei dettagli. Per i prodotti complessi non si riesce a superare la biomassa dal substrato, quindi non si calcolano per i prodotti complessi, solo per i metaboliti primari e alcuni secondari.

Composizione dei terreni colturali

Incide fino al 40% del costo totale del processo produttivo, si scelgono ingredienti che fanno crescere il MO al meglio, fare in modo che abbia gli ATP necessari per poi produrre le molecole che servono a noi. Il terreno colturale deve sempre contenere: una fonte di carbonio, una fonte di azoto, dei sali inorganici (solfato di magnesio perché è un cofatore di molti enzimi delle vie degradative; solfato di manganese e zinco e rame per alcuni terreni); fonte di vitamine che aiutano il MO e si chiamano fattori di crescita, e dei precursori. I terreni possono essere suddivisi in terreni sintetici e complessi.

Terreni sintetici

Costituiti da materie pure (glucosio, maltosio). Sono impiegati a livello di laboratorio, sono costosi però hanno il vantaggio di essere di facile standardizzazione, ovvero molto ripetibili. Forniscono rese di conversione fermentazione limitate, sia nel caso delle biomasse che a livello di metabolito. Purificazione dei prodotti facile. Scarso sviluppo cellulare.

Terreni complessi

Usati a livello industriale e costituiti da materie prime grezze. La fonte di carbonio può essere il melasso che è un residuo del processo di produzione del saccarosio. Sono terreni che possono essere usati su larga scala. Quando abbiamo a che fare con un residuo diverso, si compone un terreno colturale diverso. È più difficile la standardizzazione, di solito si prendono questi ingredienti da fornitori diversi, si mescolano e si usa il mix (valore medio di contenuto rispetto ai componenti inseriti). Sono più economici, perché si prendono gli scarti. Forniscono crescita microbica e composti di interesse maggiore rispetto ai terreni sintetici perché forniscono sostanze utili allo sviluppo e alle attività del MO. La formazione di schiuma è automatica, quindi si deve controllare. La purificazione è più complessa rispetto al terreno sintetico ma lo sviluppo cellulare è maggiore.

Nella scelta di un ingrediente di impiego in un terreno industriale si deve riuscire a trovare la massima resa di conversione ovvero un substrato adatto che fornisca il prodotto, poi si ha la massima resa di fermentazione e la massima velocità di formazione del prodotto. Il tempo è denaro in un’azienda. È necessario rifornirsi sempre degli ingredienti freschi. La fonte di carbonio è il terreno più importante: i MO usano la fonte di carbonio per produrre energia e la utilizzano per produrre il resto delle sostanze. Ha il peso maggiore nel terreno colturale, è quella presente in maggiore concentrazione e quindi incide di più sul costo del terreno.

Ci sono fonti rinnovabili e fonti non rinnovabili. Quelle rinnovabili sono di origine naturale, che derivano dal mondo vegetale e animale. Le fonti non rinnovabili sono quelle di origine fossile, petrolchimica che sono derivate o sottoprodotti dell’industria di lavorazione del petrolio; o alcoli a catena corta. Un’altra classificazione delle fonti di carbonio è: forme pure o forme grezze, oppure in forme carboidratiche come disaccaridi o polisaccaridi oppure non carboidratiche come gli oli.

Fonti di carbonio carboidratiche

Si possono suddividere in fonti pure e fonti grezze.

Fonti pure

Contengono prevalentemente uno zucchero e poche altre cose. Possono essere monosaccaridi come sciroppi di glucosio, prodotti dall’idrolisi dell’amido di mais; saccarosio e lattosio come disaccaridi (saccarosio come dimero di glucosio e fruttosio, mentre il lattosio di glucosio e galattosio); oligosaccaridi come le maltodestrine che sono le ramificazioni della catena dell’amido; polisaccaridi come amido e cellulosa.

Fonti grezze

Più utilizzate e meno costose. Quello più utilizzato è il melasso che può essere da barbabietola da zucchero o canna da zucchero. Poi c’è il corn molasses, il liscivio solfitico, l’orzo maltizzato, il siero di latte, e i residui cellulosici.

Melassi

Sottoprodotto dell’industria saccarifera, quello che residua da un’azienda che produce saccarosio. Il saccarosio, comune zucchero, si può estrarre da due fonti vegetali diverse: la barbabietola da zucchero e la canna da zucchero. Sono molto diversi: la prima è un tubero tipo patata o carota, il saccarosio è quasi totalmente localizzato nel tubero; la canna da zucchero è un arbusto e il saccarosio è concentrato nel fusto. La distribuzione delle coltivazioni e quindi la disponibilità dei melassi sono geograficamente molto diverse. La barbabietola è frequente in Europa (zona mediterranea), USA, Russia, Ucraina. Le canne da zucchero sono frequenti in: Brasile, India, Cina, Messico, Australia, Thailandia.

Come si ottiene il melasso. Il saccarosio deve essere estratto. Bisogna tagliare a striscioline la barbabietola o la canna per aumentare la superficie di estrazione, si mettono a bagno in acqua e il saccarosio passa in soluzione. Alla fine si avrà una fase solida rappresentata dal materiale vegetale, e un liquido brunastro che contiene lo zucchero e altri componenti come le vitamine, i sali minerali, pietrisco non lavato. La fase liquida viene separata dalle impurità. Il concentrato di saccarosio viene evaporato e ne risulta un liquido viscoso molto concentrato da cui si cristallizza il saccarosio. Quando arriva il melasso al 50% di saccarosio non è più conveniente recuperarlo. Il melasso si presenta come un liquido marrone scuro molto viscoso che contiene ancora il 50% di saccarosio che non conviene più cristallizzare perché sarebbe troppo sporco. Il melasso di canna da zucchero contiene il 30-35% di saccarosio, contiene una parte importante di zucchero invertito, che può arrivare al 50% (miscela di componenti del saccarosio singoli, cioè glucosio e fruttosio, 20%). I due melassi contengono il 20% di azoto (proteine vegetali), vitamine come la Biotina, vitamina del gruppo B di cui il melasso di canna è molto ricco rispetto a quello di barbabietola. La biotina è molto utile per il metabolismo microbico, per cui se si fornisce direttamente con un ingrediente non si deve spendere per comprarla singola e aggiungerla. È una caratteristica fondamentale del melasso di canna da zucchero, infatti le industrie se lo fanno sempre spedire perché molto ricco di vitamine.

Il termine melasso indica un sottoprodotto di un processo di cristallizzazione del saccarosio ma può essere inteso anche come residuo dell’ottenimento di uno zucchero. Il corn molasses è quello che rimane dopo il processo di produzione del glucosio dall’amido di mais. Il mais viene tagliato a fettuccine ed estratto per ottenere l’amido che subisce un processo di idrolisi e ne residua il corn molasses che contiene il 50% di glucosio.