Microbiologia - i micobatteri

Storia e classificazione dei micobatteri

I micobatteri, in particolare il ceppo responsabile della tubercolosi, furono scoperti nel 1872 da Koch, il primo micobatterio ad essere scoperto in assoluto risale però al 1870 ed è il m. lepre. Per molti anni poi gli studi sui micobatteri andarono a rilento, poi a partire dai primi del '900 iniziarono ad essere identificati numerosi mocobatteri. Oggi si avverte una necessità di classificazione tanto che si fa la distinzione tra i veri batteri della tubercolosi, si tratta di un gruppo limitato di micobatteri strettamente patogeni se presenti: m. tubercolosis, bovis, ulcerans, lepre, e un vasto gruppo di micobatteri che non danno mai una vera e propria tubercolosi ma delle forme infiammatorie di tipo tubercolare conformazioni di tubercoli abortivi cioè che si evolvono fino ad un certo punto e poi si arrestano che non danno mai manifestazioni sistemiche e che si manifestano, specialmente negli ultimi anni, negli individui immunodepressi.

Le tubercolosi che si possono osservare in questo periodo sono causate da bacilli che un tempo venivano indicati come pseudotubercolari o tubercolari atipici o ancoratubercoloidi che davano manifestazioni simili alla tubercolosi ma non erano bacilli della tubercolosi, questi bacilli da Runyon furono classificati in un certo n° di gruppi: 1) gruppo I: fotocromogeni, producono in presenza della luce un pigmento giallo, e a lenta crescita, tempo di divisione 12-24 h, 15-20 gg. Per formare colonie visibili. 2) gruppo II: a lenta crescita, scotocromogeni, sintesi di pigmento in assenza/presenza di luce. 3) gruppo III: non producono pigmento, sono a lenta crescita, sono patogeni e non patogeni. 4) gruppo IV: generalmente non patogeni, non producono pigmento e sono a rapida crescita, si trovano comunemente nell'ambiente ad esempio il m. phlei si trova nei prati. CARATTERISTICHE MICOBATTERI Genere micobacterium, famiglia micobacteriaceae, ordine actinomicetales. I micobatteri sono dei corti ebacilli da 1 a 4/5 micron di lunghezza, alcune volte sono anche coccoidi mai però il tubercolosis e il bovis, presenta forma coccoide il m. avium (non patogeno). Da parte dei micobatteri c'è la tendenza a formare un micelio cioè le cellule non si separano le une dalle altre ma si intrecciano tra loro e poiché questa è una caratteristica dei miceti dei funghi ecco spiegato il perché del nome micobatteri. I micobatteri presentano una superficie rugosa, irregolare che se viene trattata a pH alcalino i suoi costituenti vanno a formare delle strutture periferiche. I micobatteri presentano dei depositi intracellulari di natura lipidica, sono immobili, asporigeni e possiedono un involucro esterno ricco in lipidi. COLORAZIONE I micobatteri furono coltivati e colorati per la prima volta da Koch, sono di difficile colorazione a causa dell'involucro lipidico esterno ed è per questo stesso motivo che sono a lenta crescita perché.

L'involucro lipidico non favorisce il passaggio del colore e ostacola quello dei metaboliti. Koch riuscì a colorare i micobatteri con un metodo messo a punto da lui e dal farmacologo Ehrlich. Per colorarli, utilizzarono anche un mordenzante, una sostanza che favorisce la penetrazione del colore. I due studiosi utilizzarono fucsina fenicata in fenolo come mordenzante, o fenolfucsina. Lasciarono il preparato in colorazione per 2-3 giorni e poi, per decolorare, fecero regredire la dissociazione dei gruppi acidi/basi portando il tutto ad un pH molto basso utilizzando un solvente molto alcolico, essendo i coloranti solitamente apolari. Una volta completato il processo, osservarono il preparato al microscopio e notarono che i batteri avevano assunto il colore rosso della fucsina, risultando quindi resistenti alla decolorazione con acido e alcol. Questo metodo fu successivamente modificato da Ziehl e Neelsen e quello che oggi facciamo è il metodo dell'acido.

resistenza di Ziehl e Neelsen i quali anziché colorare per 24/48 h abbreviarono i tempi di colorazione ma riscaldando il preparato, il vetrino veniva riscaldato senza portare il preparato all'ebollizione, perché in questo caso il preparato precipita, ma ai primi vapori, la colorazione era poi la stessa come pure la decolorazione, si utilizzava poi un colorante di contrasto (blu di metilene). Il colorante usato è quindi la fucsina, si tratta di un metiltrifenil sottoforma di sale clorato, in alternativa alla fucsina possiamo usare il cristel violetto in questo caso il germe si colora di violetto e bisogna usare un colore di contrasto diverso. Si usa molto spesso l'audamina che è un colorante fluorescente. A proposito del metodo dell'acido resistenza bisogna ancora dire che nella diagnostica si usa un esame batterioscopico fatto con l'acido resistenza per dimostrare la presenza o meno di bacilli alcol-acido resistenti. Questo esame non ciconsente di dire se ci sono dei bacilli delle tubercolosi, ma solo se sono presenti bacilli alcol-acido resistenti sui quali si va poi ad investigare. Da questo esame si possono avere però dei falsi negativi e dei falsi positivi. I falsi positivi sono legati ad altri germi che possono avere caratteristiche di acido-alcol resistenza ma con un meccanismo diverso da quello dei micobatteri. Non è lo strato lipidico esterno a creare l'acido resistenza, ma sono altre strutture interne come ad esempio le spore. I falsi negativi sono invece più importanti. In soggetti trattati con un medicamento che si usa per la tubercolosi, l'idratide e l'acido isonicotinico, succede che questo medicamento agisce bloccando la sintesi degli acidi grassi degli involucri periferici, quindi la capsula lipidica è meno resistente. Allora, quando si va a fare l'estrazione con alcol-acido, si estrae il colore e il germe appare non colorato con acido resistenza. Questa

Tipologia di germe è poco virulenta, esiste invece l'opposto: germi altamente virulenti che hanno un denso involucro lipidico periferico che non consente il passaggio all'interno del colorante, quindi non si mettono in evidenza e sono altamente idrofobici. Sempre a proposito dell'acido resistenza Koch aveva osservato che cellule tritate in un mortaio perdevano l'acido resistenza, era quindi necessaria l'integrità della cellula e la coltivazione in terreno ottimale. Oggi sappiamo che l'acido resistenza dipende dall'integrità della cellula e dagli acidi micolici che si trovano negli strati esterni e che legano il colorante e incrementano l'involucro idrofobico esterno facendo sì che il colorante non venga più estratto. Per mettere in evidenza i micobatteri possiamo usare anche il metodo di Gram, però quello che poi risulta se si usano i germi in quanto tali è un risultato non corrispondente al metodo di Gram.

Bensì a quello dell’acido resistenza. Sesi vuole utilizzare il metodo di Gram è necessario prima estrarre le strutture lipidiche di superficie saponificando i grassi, a questo punto si può applicare il metodo di Gram e si osserva che i micobatteri sono Gram positivi. In virtù di questo primo passaggio iniziale il metodo di Gram per i micobatteri non si usa mai. TECNICHE DI COLTIVAZIONE DEI MICOBATTERI I micobatteri ed in particolare il batterio della tubercolosi sono strettamente aerobi. Premesso che quando i batteri confluiscono su di un terreno di coltura solido si forma una colonia e quando confluiscono su di un terreno liquido si forma una patina, ebbene per quanto riguarda i micobatteri si considera una pallone da batteriologia con tanto di terreno liquido e patina (il terreno al di sotto della patina resta limpido), quando la patina ha coperto tutta la superficie del terreno a disposizione tende ad incresparsi e tende a risalire lungo le pareti del recipiente.

crescita questa che gli antichi batteriologi definivano a velo increspato. Man mano che aumenta la crescita ci sono dei frammenti che si staccano e precipitano al fondo, essendo il terreno liquido è difficile avere germi isolati si dovrebbero usare particolari accorgimenti quindi si hanno sempre aggregati. I micobatteri crescono in comune brodo di batteriologia arricchito con glucosio per favorirne la sintesi di grassi e glicerolo. Il terreno usato da Koch per l'isolamento, si doveva usare un terreno solido e ricordiamo non c'era l'agar per solidificare i terreni liquidi, era la patata: una fetta di patata con l'aggiunta di glicerina che serviva ad incrementare la crescita. La patata è ricca di asparagina amminoacido che il micobatterio utilizza come sorgente di azoto, quindi la patata forniva il glicerolo per la sintesi di acidi grassi e l'asparagina. Successivamente sono stati utilizzati altri terreni tra cui il più comune: il brodo

glicerinato e glucosato, poi ci sono anche brodi sintetici, è necessario che siano ricchi in lipidi e proteine e l'arricchimento avviene mediante l'uovo, in Italia ad esempio è utilizzato il terreno di Petragnani. Da ultimo a questi terreni sintetici vengono aggiunti batteriostatici per altri eventuali batteri, per i micobatteri si usa il verde di malachite. Oggi i terreni sono stati riunificati sotto un'unica sigla IUTM. Sul terreno solido da isolamento le colonie, che impiegano 15-20 giorni per svilupparsi, appaiono piccole, rugose in superficie, dall'aspetto secco. Il terreno solido oggi è di solito un brodo solidificato con agar a becco di clarino cioè si fa solidificare inclinando la provetta contenente il tutto dopo che si è messo l'agar in modo tale da aumentare la superficie. Per il micobatterio tubercolosis il terreno solido si ottiene con siero di sangue coagulato al calore e messo a becco di clarino.

ARCHITETTURA DELLE

COMPONENTI CHIMICHE DEGLI STRATI ESTERNI DEI MICOBATTERI Procedendo dall'interno verso la superficie per quanto riguarda gli strati esterni nei micobatteri incontriamo: 1) la membrana citoplasmatica 2) la mureina 2 3) almeno tre strati con tessitura diversa ed elementi chimici diversi. La membrana citoplasmatica presenta le stesse caratteristiche comuni agli altri batteri. La caratteristica del peptidoglicano o mureina dei micobatteri è che nell'acido muramico c'è un costituente che è un residuo di glicina e altra caratteristica è la presenza dell'acido. (non si riesce proprio a capire mi dispiace). Al di fuori del peptidoglicano c'è un'ampia massa di acidi grassi di costituenti vari, ci sono poi peptidi, glicidi, lipoglicidi, lipopeptidoglicidi, composti che compaiono quasi esclusivamente nei micobatteri e che sono responsabili delle varie attività biologiche esercitate dai micobatteri sulle cellule dell'ospite. Trail peptidoglicano e gli strati più esterni c'è un grosso costituente l'arabino-galattani: si tratta di un polimero di arabinosio e galattosio con catene laterali di arabinosio e con ad un'estremità un gruppo fosfato.