Microbiologia - Appunti

Colorazioni batteriche

Le colorazioni batteriche servono a:

• Dare contrasto ai microrganismi
• Individuare i diversi tipi di forma, struttura, organizzazione
• Evidenziare alcune parti del microrganismo come flagelli, capsule, endospore

I coloranti comunemente usati sono dei Sali e si combinano chimicamente con i batteri. Esistono:

• I coloranti basici composti da catione colorato e anione incolore (es. Cloruro blu di metilene), hanno carica positiva e affinità per le strutture acide come la superficie cellulare, le proteine e gli acidi nucleici
• I coloranti acidi composti da catione incolore e anione colorato (es. sodio eosinato), hanno carica negativa e affinità per le strutture basiche come il citoplasma (colorano il sottofondo)

Vi sono:

• Colorazioni semplici, date dall’applicazione di una sola soluzione di colorante basico
• Colorazioni differenziali, date dall’applicazione di due coloranti in successione, come la Colorazione di Gram, di Ziehl-Neelsen, etc.

Colorazione di Gram

I batteri sono per lo più classificati come Gram-positivi o Gram-negativi, in base alla loro risposta a questo tipo di colorazione. I Gram + hanno la capacità di trattenere un complesso di Cristalvioletto (colorante blu) e Iodio, indicato come CV-I, anche dopo un lavaggio di alcool o acetone. I Gram - si decolorano, quindi rilasciano il complesso sopracitato, ma possono essere ricolorati con Safranina (colorante rosso).

La base della colorazione di Gram sta nella composizione della parete cellulare dei due diversi tipi di batteri:

• La parete dei Gram + è formata dalla membrana citoplasmatica, dal peptidoglicano e da 3 componenti speciali: gli acidi teicoici, quelli teicuronici, e da polisaccaridi.
  • Acidi teicoici: polimeri di 30 o più unità ripetute che contengono gliceril fosfato o ribitol fosfato, responsabili della carica negativa della superficie cellulare. Sono di tipo WTA, cioè attaccati al peptidoglicano, o LTA, cioè legati alla membrana citoplasmatica.
  • Acidi teicuronici: polimeri simili a quelli precedenti ma contenenti glucidi anziché fosfati.
  • Polisaccaridi: glucidi neutri e acidi.
• La parete dei Gram - è formata dalla membrana citoplasmatica, dallo spazio periplasmatico con peptidoglicano, e dalla membrana esterna, la quale, insieme alle lipoproteine e ai liposaccaridi, fa parte dei componenti caratterizzanti il batterio. È una barriera selettiva per agenti tossici sia idrofobici che idrofili.
  • Spazio periplasmatico: Spazio che contiene il peptidoglicano, proteine leganti specifici substrati, enzimi idrolitici e detossificanti, e una soluzione proteica simile a gel. Occupa il 20-40% del volume cellulare.
  • Membrana esterna: Struttura a doppio strato con foglietto interno di composizione simile alla membrana citoplasmatica e foglietto esterno contenente lipopolisaccaride. Fornisce la capacità insolita dei Gram - di escludere, oltre alle idrofiliche, anche le molecole idrofobiche. Le idrofiliche passano attraverso porine, le idrofobiche difficilmente e con molta lentezza (resistenza agli antibiotici).
  • Lipoproteine: La proteina più abbondante, che lega il peptidoglicano e la membrana esterna.
  • Lipopolisaccaride (LPS): È una molecola con porzione idrofoba e lipidica, ed una idrofila e saccaridica. È formato dal Lipide A, immerso nel foglietto esterno, con attaccato un core, catena oligosaccaridica con zuccheri insoliti come l’eptoso e l’acido chetodeossioctonico, e un antigene O, una serie terminale di molte unità saccaridiche ripetute.
  • Porine: Proteine per il passaggio di molecole idrosolubili, è fondamentale il numero e il diametro e le differenze ad esempio di dimensione conferisce una diversa resistenza agli antibiotici.

Colorazione di Ziehl-Neelsen

La colorazione di Gram non è applicabile a tutti i batteri! È il caso degli acido-resistenti come i Micobatteri per i quali si utilizza la colorazione di Ziehl-Neelsen. Essa prevede:

• Versare fucsina fenicata
• Scaldare a fiamma per 5 min
• Lavare con acqua
• Decolorare con alcool acido
• Lavare con acqua
• Contrastare con blu di metilene
• Lavare con acqua

I batteri acido resistenti si saranno colorati di rosso. Anche la parete degli acido-resistenti è caratteristica: contiene grandi quantità di cere, idrocarburi ramificati complessi, detti acidi micolici (60%). A formare l’elevata quantità di glicolipidi che la compongono concorrono pure dei complessi lipidi-arabinogalattani e lipoarabinomannani. La parete risulta, dunque, molto idrofobica.

Altre colorazioni

Le altre colorazioni sono quelle della capsula, delle spore (coloraz. di Schaeffer-Fulton), e dei flagelli (coloraz. di Leifson).

Microscopio ottico

• Semplice o composto a luce trasmessa
• A contrasto di fase
• A fluorescenza

Microscopio elettronico

• A trasmissione in cui il fascio di elettroni attraversa il preparato
• A scansione dove il fascio di elettroni incide sulla superficie dell’oggetto

Caratteristiche cellula batterica

• Metabolismo
• Riproduzione
• Differenziazione
• Comunicazione
• Movimento
• Evoluzione

Principali costituenti

• Acqua 80%
• Componenti organici come acidi nucleici, lipidi, proteine e polisaccaridi
• Componenti inorganici: Calcio, zolfo, zinco, sodio etc.

Nucleoide batterico

È la regione nucleare dove è presente il DNA batterico; sono presenti proteine e istoni simili a quelli presenti nella cromatina eucariotica. La regione nucleare è ricca di fibrille e DNA, il nucleoide è costituito da una sola molecola circolare. Ci sono eccezioni: alcuni batteri hanno un cromosoma lineare. Numero nucleoidi = numero cromosomi. Tutte le cellule procariotiche sono aploidi.

Genoma batterico

Contiene i cromosomi e i plasmidi (frammenti di DNA nucleari non cromosomici e non necessari alla sopravvivenza). Vi sono geni determinanti patogenicità, determinano i fattori di virulenza e sono dette isole di patogenicità, sono presenti anche trasposoni. Formato da domini superavvolti isolati. Il DNA batterico è avvolto negativamente ma viene srotolato da due enzimi: topo isomerasi di tipo II che sono Girasi e Topoisomerasi IV. Il numero di geni e le dimensioni del genoma riflettono lo stile di vita del batterio. C’è un’ampia eterogeneità delle dimensioni del genoma anche in una stessa specie, in comune una specie conserva solo una parte di endogenoma il resto varia da ceppo a ceppo.

Escherichia coli

Il batterio Escherichia coli è un Gram - della famiglia Escherichia a forma di bastoncello diritto, vive nella parte inferiore dell’intestino di animali a sangue caldo, necessario per la corretta digestione del cibo. Fa parte degli enterobatteri e alcune forme sono patogene. Il genoma non è interrotto da introni ed è organizzato in operoni unità trascrizionali policistroniche.

Operone del lattosio

Codifica proteine per importare lattosio dall’ambiente e digerirlo ed è controllato dal repressore Lac e dall’attivatore Cap. In mancanza di Glucosio Cap accende i geni per ricavare il lattosio, ma in assenza del lattosio stesso, il repressore Lac mantiene inattivo l’operone. La regione di controllo reagisce positivamente solo se il glucosio è assente ed il lattosio presente.

Trascrizione inducibile

LAC si mantiene inattivo grazie all’induttore lattosio. Quando l’ambiente è ricco di triptofano gli enzimi prodotti dall’operone per la sua sintesi non sono più necessari. Interviene una proteina regolatrice nota come repressore del triptofano.

Trascrizione costitutiva

È la trascrizione senza presenza di un induttore. La replicazione inizia in corrispondenza del locus Ori e termina in una regione detta Ter.

RNA batterici

I ribosomi batterici hanno la stessa struttura di quelli eucariotici, hanno una sub unità maggiore e una minore. Differiscono per coefficiente di sedimentazione: eucarioti 80 S (60 + 40) procarioti 70 S (50 + 30). I ribosomi batterici differiscono tra loro, per questo alcuni antibiotici funzionano inibendo la sintesi proteica solo di alcuni di essi. Un m-RNA associato a più ribosomi viene detto polisoma e ciascun m-RNA può essere tradotto da più ribosomi simultaneamente. Questo fa sì che, nonostante gli m-RNA non rappresentino più del 5% dell’RNA totale di una cellula, la maggior parte dei ribosomi è impegnata nella traduzione. Trascrizione e traduzione sono simultanee.

Inclusioni citoplasmatiche

• Lipidi (polimeri dell’acido beta idrossi-butirrico)
• Polisaccaridi (glicogeno e amido)
• Zolfo (Solfobatteri)
• Ferro (FerroBatteri)
• Polifosfato
• Magnetite "magnetosomi"

Quasi sempre le inclusioni citoplasmatiche funzionano per l’immagazzinamento di energia o di materiali di riserva. Frammenti di DNA circolari, extra-cromosomici, autoreplicanti, non fondamentali per la vita batterica. Trasmessi per “coniugazione”.

Membrana plasmatica

È un doppio strato fosfolipidico in cui sono immerse 200 proteine diverse. Queste proteine non sono glicosilate e non vi sono steroli. Ci sono però gli opanoidi di composizione lipidica semplice, essi danno rigidità alla membrana e strutturalmente sono molto simili agli steroli.

Funzioni:

• Barriera idrofobica selettiva
• Genera il potenziale di membrana
• Accoglie le proteine di trasporto
• Sintesi delle molecole di ATP
• Punto di ancoraggio per i flagelli
• Idrolisi di substrati complessi

Funzioni della parete batterica

• Fornisce alla cellula: forma, carica negativa (anti-fagocitosi e anti-complemento), protezione osmotica, protezione da sostanze tossiche
• Contiene determinanti antigenici
• Media il contatto cellula-cellula
• Permette adesione di fagi
• È bersaglio di farmaci antibatterici (beta lattamici e glicopeptidi)

La parete batterica è costituita anche da peptidoglicano. È un polimero complesso composto di tre parti:

• Spina dorsale di N-acetilglucosamina e acido N-acetilmuramico alternati
• Una serie di catene laterali tetrapeptidiche variabili nella terza posizione da Gram+ a Gram-
• Una serie di ponti trasversali peptidici variabili

Trasporto di membrana

1. Trasporto semplice = (trasporto attivo) uniporto, simporto, antiporto
2. Trasporto ABC = (trasporto attivo) operato da tre diverse proteine: una per il trasporto della molecola alla membrana, una proteina canale che trasporti la molecola all’interno, una terza che rilascia la molecola. Tutto ciò avviene grazie all’energia fornita dall’ATP
3. Trasporto di gruppo o metabolismo vettoriale = non è un trasporto attivo in quanto non è coinvolto un gradiente. Trasporto in cui una molecola di zucchero durante il trasporto viene fosforilato da una proteina trasportatrice che la rilascia nel citoplasma (sistema fosfotransferasi)

Il peptidoglicano (o mucopeptide batterico o mureina), è il componente fondamentale della parete cellulare dei batteri. È un enorme polimero le cui unità strutturali sono rappresentate da due carboidrati azotati, l’N-acetilglucosamina (NAG) e l’acido muramico, legati tra loro mediante un legame β,1-6. Al gruppo carbossilico dell’acido muramico è legato un tetrapeptide i cui aminoacidi di solito rappresentati, nell’ordine, da L-alanina, acido D-glutamico, L-lisina o acido mesodiaminopimelico (quest’ultimo di solito presente nei Gram-negativi, con l’eccezione delle spirochete) e D-alanina. L’acido muramico di un’unità strutturale è legato all’N-acetilglucosamina dell’unità adiacente mediante un legame β,1-4 che può essere scisso dal lisozima. I diversi polimeri sono poi collegati trasversalmente tra di loro in corrispondenza delle catene aminoacidiche mediante legami peptidici che si stabiliscono generalmente tra la D-alanina terminale di un tetrapeptide e l’aminogruppo della lisina mediante un ponte pentaglicinico se si tratta di batteri Gram-positivi o tra la tra la D-alanina e l’acido mesodiaminopimelico se si tratta di batteri Gram-negativi. Questa struttura generale può subire variazioni a seconda della specie batterica che si va a considerare.

Gram + e Gram -

Le PBP sono proteine implicate nella regolazione della forma della cellula nella formazione del setto e nella divisione del setto. Le PBP sono transpeptidasi in quanto formano legame peptidico, transglicosidasi formano legame glicosidico o carbossipeptidasi tagliano i ponti peptidici non usati. Fanno parte della famiglia delle proteine serin-trasferasi, si trovano sulla parte interna della parete e il numero varia a seconda della specie. Inoltre, sono proteine con attività enzimatica che permettono la formazione del legame crociato fra la D-alanina e il terzo amminoacido, questo grazie all’energia fornita dal taglio di una d-alanina terminale. Poiché le penicilline hanno una struttura simile alle molecole di D-alanina possono legarsi alle PBP impedendo la formazione del legame crociato e quindi la sintesi della parete batterica.

Glicocalice

Il glicocalice è uno strato contenete polisaccaridi che riveste esternamente la superficie della cellula. Se la circonda strettamente, è denso e definito ed esclude le particelle, è detto capsula. Se vi è associato in modo lasso e non esclude le particelle è detto strato mucoso. È un fattore di virulenza.

Funzioni:

• Antifagocitosi
• Protezione
• Antigenico (S.pneumoniae, H.influenzae, N.meningitidis)
• Adesione a substrati (S.mutans)
• R a antibiotici (P.aeruginosae - k di alginato)
• Contiene recettori per fagi

Flagelli

I flagelli sono appendici filiformi costituite da migliaia di molecole proteiche di flagellina che fungono da organi di locomozione. Sono attaccati alla cellula batterica grazie ad un uncino e ad un corpo basale. L’energia per il movimento è data dal potenziale di membrana e il movimento è condizionato da chemio-recettori (attrazione chimica).

Possono essere:

• Monotrichi-polari
• Lofotrichi-polari
• Anfitrichi-bipolari
• Peritrichi

Fimbrie o pili

Le fimbrie o pili sono strutture proteiche corte abbondanti formate da piline che hanno forma ad elica (proteine) tipiche dei Gram - sono fattori di virulenza e si dividono in:

• Pili ordinari: mediano l’adesività dei batteri patogeni alle cellule ospiti tramite le adesine poste sulla punta dei pili.
• Pili sessuali: responsabili dell’attacco tra la cellula donatrice e la ricevente nella coniugazione in cui si ha scambio genetico.

Sporigeni di importanza clinica

Gen. Bacilli (Gram+ aerobi/anaerobifacoltativi):

• B.anthracis: carbonchio /antrace
• B.cereus: tossinfezioni alimentari

Gen. Clostridi (Gram+ anaerobi):

• C. Perfringens: gangrena gassosa + tossinfezioni alimentari
• C. Difficile: colite pseudomembranosa
• C. Tetani: tetano
• C. Butulinum: botulismo

Bacillus anthracis

I suoi fattori di virulenza sono la capsula e la tossina. Ne esistono tre forme che variano a seconda del sito di ingresso della spora:

• Antrace cutaneo: l’ingresso delle spore avviene attraverso una ferita. Si forma una papula pruriginosa che diventa una vescicola o un’ulcera necrotica che si secca e si stacca, colpisce spesso braccia e mani. È la più comune (95% casi di antrace) malattia dei cardatori ha bassa letalità e il vaccino è disponibile.
• Antrace gastrico: l’ingresso della spora avviene per ingestione di cibo infetto, attraverso le mucose intestinali, è raro e la letalità è tra il 25-60%.
• Antrace polmonare: per inalazione della spora, è rarissimo ma fatale, le spore sono tante e piccole. 80-90% di letalità quando si manifestano i sintomi.

La tossina di B anthracis è multifattoriale, ed è composta da tre proteine:

• Antigene protettivo (indicato con PA) che si lega ai recettori cellulari specifici presenti sulla membrana della cellula ospite.
• Fattore di edema (EF) che congiunto a PA produce la tossina di edema.
• Fattore letale (LF) con cui forma invece la tossina letale.

I complessi PA+LF o PA+EF sono internalizzati da un recettore che media l’endocitosi e la successiva acidificazione di questo endosoma rilascia questi fattori nel citosol.

Bacillus cereus

Causa delle tossinfezioni alimentari e ha due diverse tossine:

• Tossina T stabile e acido stabile: ha effetto emetico dalle 1-6 h dopo l’ingestione del cibo e i sintomi spariscono entro le 24 h. Spesso per ingestione di riso fritto.
• Tossina T labile (cambia con la temperatura) che dà effetto diarroico e crampi addominali 8-16 h dopo l’ingestione del cibo e i sintomi persistono per 20-24 h. Per ingestione di carni e di salse.

Clostridi

C. Perfringens possiede anch’esso 2 tossine:

• Alfa tossina: una lecitinasi, che rompe le membrane cellulari ed è una fosfolipasi zinco dipendente, provoca gangrena gassosa o mionecrosi che si presentano sottoforma di cellulitica anaerobica e infezioni delle ferite.
• Enterotossina: che dà tossinfezione alimentare diarrea e crampi però è autolimitante in 24h.

Clostridium difficile

Causa la colite pseudo membranosa e ha due tossine:

• Tossina A: è un’enterotossina poco citotossica
• Tossina B: potente citotossina

Entrambe stimolano la produzione di molecole proinfiammatorie che portano ad un danno tissutale dell’orletto a spazzola e della mucosa e causano la colite pseudomembranosa perforazione intestinale e megacolon. È antibiotico resistente.

Clostridium tetani

Provoca il tetano una malattia caratterizzata da contrazioni toniche della muscolatura volontaria. Gli arti superiori sono flessi, gli altri inferiori stesi. Il malato è cosciente e la morte spesso avviene per interferenza con l’apparato respiratorio durante le contrazioni. Il tetano può essere:

• Generalizzato
• Localizzato
• Cefalico
• Neonatale

È letale se non trattato: 90% neonati, 40% adulti. Le tossine sono:

• La tetanolisina: è una emolisina
• Tetanospasmina: che agisce