Microbiologia generale

Francesca Nasatti: microbiologia generale

Tutte le cellule viventi hanno bisogno dei prodotti codificati dalle sequenze genetiche per poter vivere. I regni in realtà sono 3: batteri, archea, e eucarioti. Le cellule dei batteri e archea non hanno nucleo, ma i cromosomi sono dispersi nel citoplasma (procarioti). Gli eucarioti hanno cellule compartimentate (compartimenti separati da membrane), che non c'è nei procarioti. La formazione delle cellule più semplici è avvenuta prima: i procarioti sono più antichi dal punto di vista evolutivo.

Poi si sono evoluti gli eucarioti originati dalla fusione/cooperazione di 2 cellule più semplici (organismi unicellulari): è più facile sopravvivere in un ambiente se collaboro. Riescono a usufruire di più sostanze nutritive, risorse energetiche. Fusione: all'interno di uno si è introdotta un'altra, quella in grado di gestire meglio il ricavo di energia dall'ambiente-->la cellula eucariota contiene i rimasugli delle cellule procariote entrate, ovvero i mitocondri, organelli deputati al metabolismo energetico.

Ciò è stato possibile dimostrarlo grazie all'evoluzione tecnologica: si è capito che le sequenze di DNA possono essere confrontate tra i diversi organismi, si sapeva che nel mitocondrio c'è DNA, che somiglia a quello di una cellula procariota. La cooperazione è alla base della formazione di organismi pluricellulari, formazione di tessuti.

• I procarioti hanno origine molto antica, sono le prime forme di vita che non sono in grado di usare l'ossigeno perché era scarso: organismi anaerobi e semplici, non compartimentati
• Organismi fotosintetici: contengono cloroplasti, nati dalla simbiosi di un'alga con una cellula eucariota, cooperazione sulle fonti energetiche: è in base al recupero di energia che vengono selezionati per i processi evolutivi, è grazie a ciò che si può vivere e riprodursi
• L'ossigeno inizia a svilupparsi, organismi di tipo aerobio

Morfologie cellulari dei batteri (procarioti)

Non aiutano molto a classificare i microrganismi, a dare informazioni di tipo tassonomico: all'interno di quelle tipologie ci sono migliaia di specie. L'identificazione di un batterio è molto più complessa di quella dei procarioti perché passa attraverso più analisi o analisi di specifiche sequenze del DNA. Sono sempre organismi unicellulari ma durante la divisione le cellule rimangono semiunite a formare grumi, bastoncini, catenelle, ecc.

Il microscopio

Indispensabile per poter osservare i microrganismi. Composto da diverse componenti che servono a visualizzare in maniera adeguata ciò che viene posto su un vetrino.

• Oculari dotati di un set di lenti
• Struttura che grazie a specchi convoglia energia luminosa che illumina l'obiettivo (formato da lenti) che ingrandisce l'immagine che viene trasmessa agli oculari e ulteriormente ingrandita
• Diaframma può consentire il passaggio di poca o molta luce a seconda che sia chiuso o aperto
• Condensatore viene convogliata la luce che viene concentrata in un punto di area molto piccola, la luce attraversa il vetrino e viene raccolta dall'obiettivo

La moltiplicazione dell'ingrandimento dell'obiettivo e dell'oculare genera l'ingrandimento del microscopio.

Lenti dell'obiettivo

Vetrino, sopra c'è un vetrino più sottile: tra i due viene schiacciata la goccia d'acqua con le cellule da osservare. La lente dell'obiettivo è sopra e molto vicina. I raggi vengono deviati in base a quello che incontrano (acqua o cellule). Maggiore è l'angolo, maggiore è la capacità della lente di raccogliere raggi, migliore è il potere di risoluzione dell'obiettivo, ovvero la capacità di distinguere due oggetti vicini. Posso migliorare il potere di risoluzione con apertura numerica maggiore. Olio minerale ha lo stesso indice di rifrazione del vetro, il raggio invece viene deviato dall'aria, con l'olio tra il vetro del vetrino e quello della lente non ho cambiamento di indice di rifrazione, consente alla lente di recuperare più raggi, raccogliere più info luminose e quindi avere maggiore risoluzione. Obiettivi a immersione si immergono nell'olio.

Diaframma

Regola il diametro del fascio di luce che arriva al condensatore, quindi l'intensità della luce che arriva sul vetrino. Più devo ingrandire più luce ho bisogno che si concentri nel punto di osservazione, e bisogna anche avvicinarsi di più all'oggetto da osservare. Batterio: 1 micrometro, deve essere ingrandito 1000 volte per essere visibile. Virus: 10 nm, ci vuole il microscopio elettronico. Man mano che gli ingrandimenti diminuiscono il diaframma si chiude per far convogliare meno luce.

Microscopio ottico a contrasto di fase

I microrganismi sono trasparenti se attraversati da un fascio luminoso. Essi vengono definiti oggetti di fase. Se l'onda luminosa che colpisce la cellula non subisce variazioni perché l'oggetto è di fase, ovvero trasparente. Se l'oggetto è di ampiezza, l'onda subisce una variazione nella sua ampiezza, che di dimostra come variazione della intensità della luce. Quindi come facciamo a visualizzare i microrganismi? Trasformando oggetti di fase (le cellule trasparenti) in oggetti di ampiezza, colorando le cellule e quindi aumentando il loro contrasto nel mezzo acquoso in cui si trovano-->in questo modo riusciamo a visualizzare i microrganismi utilizzando il microscopio ottico. Ma quando coloro i microrganismi c'è un limite: le cellule muoiono, non si muovono (se sono cellule mobili). Per ovviare a questa difficoltà si ha un passaggio tecnologico al microscopio ottico a contrasto di fase perché rende i microrganismi non trasparenti, aumentando il contrasto tra le cellule e il mezzo acquoso in cui si trovano. Per fare ciò il microscopio deve agire sulla fase dell'onda luminosa. Quando un raggio passa attraverso un oggetto trasparente esce un raggio diretto più una serie di raggi diffratti. Questa caratteristica più il principio descritto nel paragrafo 4 sono alla base del funzionamento di questo microscopio.

Diaframma

È un diaframma anulare: costituito da anello (bianco) che può assumere uno spessore > o <. La luce passa attraverso questo anello, raggiunge le lenti del condensatore che convogliano i raggi verso la zona di osservazione (vetrino), dove incontrano un oggetto trasparente (vetro, acqua) e la sospensione di microrganismi: quando incontrano i batteri, i raggi luminosi subiscono una diffrazione che li ritarda di 1/4 di lunghezza d'onda. Questi raggi non sono raccolti nella stessa regione della lente che raccoglie quelli non diffratti ma in una regione centrale. I raggi non diffratti passano attraverso un anelli trasparente in una posizione diversa, regione con uno spessore doppio di quella attraversata dai raggi diffratti (regione centrale), in questo modo vengono ritardati di 1/4 di lunghezza d'onda. Viene raggiunta una differenza di fase sufficiente così che quando i raggi si uniscono vadano ad annullarsi per avere assenza di luce. Introduzioni tecnologiche: diaframma anulare, condensatore adeguato, anello di fase che sfasa in maniera sufficiente i raggi diffratti e diretti in modo che al loro incontro si annullino le lunghezze d'onda. L'allineamento di queste componenti di fase è indispensabile, il disallineamento è deleterio per la visualizzazione delle cellule. Si usano obiettivi ad immersione per poter ingrandire di più avvicinandosi molto al vetrino. Questi obiettivi sono sfruttati anche da questo tipo di microscopio.

Membrane cellulari

Nella cellula procariota la membrana cellulare è l'unica membrana che esiste, divide l'interno dall'esterno. In quelle eucarioti ci sono anche le membrane che dividono gli organelli dal citoplasma. La chimica delle membrane conferisce loro delle caratteristiche chimico-fisiche che impattano sulle loro funzioni. Essa è fatta da un doppio strato fosfolipidico. I fosfolipidi hanno una base di glicerolo. Testa polare, code idrofobiche: i fosfolipidi sono molecole anfifiliche; questa caratteristica fa si che essi formino un doppio strato che divida l'ambiente acquoso esterno e quello interno.

La membrana cellulare non è rigida per la natura delle molecole di cui è sostituita, quindi non è selettiva dal punto di vista fisico. È una barriera selettiva di tipo chimico per ciò che può entrare e uscire dalla cellula. La membrana può essere attraversata da molecole anfifiliche, non da molecole cariche, idrofobiche o idrofiliche.

Struttura della membrana degli archea

Spesso le strutture della membrana sono costituite da dieteri del glicerolo, più rigide. Questi batteri vivono solitamente in ambienti estremi per l'uomo ma non per loro: fondali marini, emissioni di zolfo allo stato gassoso, temperature o concentrazioni saline molto alte. Per forza la struttura della membrana cellulare si deve adattare per poter vivere in quegli ambienti, essa deve essere un po' più rigida della nostra cosicché sia fluida alla temperatura dove vivono quei microrganismi, poiché la sua fluidità è fondamentale. La fluidità fa sì che possano essere ospitate altre molecole, come le proteine, che però devono avere caratteristiche specifiche per poter interagire sia con la parte idrofilica che idrofobica: la membrana diventa un supporto, un sito di ancoraggio oltre che una barriera. La composizione degli acidi grassi varia in base alla temperatura in cui vengono coltivati. È necessario internare i nutrienti-->passaggio attraverso le proteine. Ma la funzione più importante della membrana cellulare è la conservazione dell'energia: è talmente selettiva che persino molecole piccole ma cariche non passino liberamente--> ciò ha garantito che la cellula diventi una "pila ricaricabile", il che è alla base del metabolismo energetico della cellula, pila che si autoricarica con la sua attività di metabolismo energetico. Quando la separazione di cariche non c'è più la cellula muore.

Sistemi di trasporto

Sono specifici per molecole o categorie di molecole. Tutti i sistemi di trasporto consumano energia e c'è una proteina che dà la specificità al trasportatore. Il passaggio delle molecole attraverso la membrana è gestito da sistemi di trasporto per le molecole che non hanno le caratteristiche per passare liberamente.

Trasporto semplice

Sistemi a simporto/antiporto/uniporto. Sistemi a simporto: sfruttare la elevata concentrazione di una molecola (x) (si sfrutta il passaggio secondo gradiente) all'esterno per trascinare anche la molecola di interesse (s), che può essere uno zucchero, all'interno della cellula. Batteri yogurt: Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus, Streptococcus thermophilus. Queste due specie fermentano, usano il lattosio del latte e producono acido lattico (idrolisi). Sistema di trasporto per l'utilizzo del lattosio (zucchero, idrofilico) attraverso la membrana: permeasi, funziona come simporto in una fase iniziale--> gli H trascinano il lattosio. Il glucosio finisce nel catabolismo, il galattosio viene espulso, la permeasi inizia a funzionare da antiporto (esterna galattosio e internalizza altro lattosio). Nello yogurt restano il galattosio e il lattosio come zucchero (1 mole di lattosio entra, 1 mole di galattosio esce, 2 moli di acido lattico si forma).

I microrganismi fanno processo di fermentazione, che è il loro metabolismo, che forma acido lattico, che interferisce sul pH del prodotto--> le proteine del latte coagulano. L'abbassamento del pH sia all'esterno che all'interno della cellula blocca il metabolismo, interferisce con il processo di trasformazione del glucosio in acido lattico, che esce dalla cellula ma ci rientra anche. C'è una permanenza di zuccheri. Il latte non ha conservazione elevata, veniva lasciato fermentare così da restare stabile (perché acido) per diversi giorni. Acido impedisce sviluppo di altri batteri patogeni ecc. Questi microrganismi sono usati anche nella produzione di formaggio. Lo Streptococcus thermophilus è usato nella produzione di mozzarella. Più galattosio c'è, più la mozzarella imbrunisce durante la cottura. Nei formaggi stagionati (es. Grana Padano, Parmigiano Reggiano) lo zucchero residuo usato da microrganismi anaerobi, producono gas che produce bolle, occhiature (problema di tipo qualitativo). Per evitare ciò prima della caseificazione del Grana Padano introduco nel latte l'enzima lisozima che idrolizza la parete cellulare, controllando lo sviluppo di microrganismi (GRAM positivi anaerobi). Questo non viene aggiunto nel Parmigiano Reggiano, perché per il Grana Padano, che viene prodotto tutto l'anno, le vacche mangiano cibo non fresco in cui sono presenti questi microrganismi che quindi fluiscono più frequentemente nel latte destinato alla produzione di Grana Padano.

Traslocazione di gruppo (PEP-PTS)

Le proteine coinvolte sono più di una. Una proteina a livello della membrana, una serie di proteine all'interno del citoplasma. Il glucosio (o altro zucchero) interagisce con la prima proteina e riceve un fosfato, quindi non entra come zucchero semplice ma fosforilato (aumenta il suo livello energetico). Il fosfato arriva dal PEP (fosfoenolpiruvato), intermedio della glicolisi (parte del metabolismo energetico della cellula) piruvato (ultimo elemento della glicolisi). Le proteine nel citoplasma sono delle fosfotransferasi (PTS), trasportano e cedono il fosfato allo zucchero che entra nella cellula. Lo zucchero entra così pronto per entrare nel metabolismo energetico, si è già fatto il passaggio necessario della fosforilazione. Di solito quando uno zucchero entra nella cellula inizia a far parte di un metabolismo. Energia consumata indirettamente: tolgo un fosfato (fosfoenolpiruvato) alla glicolisi, quindi non gli permetto di produrre energia.

ATP-binding cassette

Componente transmembrana (dà la specificità), componente intracellulare che usufruisce della idrolisi della ATP. Una proteina riconosce la molecola da trasportare. C'è un costo energetico (ATP) ma la molecola entra liberamente, senza fosforilazioni. La membrana per mantenere la vita della cellula deve mantenere la differenza di carica. Butta fuori i protoni per ricavare energia. I protoni sono più concentrati all'esterno della cellula, quindi il pH extracellulare è inferiore di quello intracellulare.

C'è necessità di avere dei sistemi di trasporto specifici. Di solito quando uno zucchero entra nella cellula inizia a far parte di un metabolismo. Se entra glucosio deve essere fosforilato da un enzima specifico; il lattosio deve essere idrolizzato in glucosio e galattosio da un altro enzima. Tutte le informazioni della cellula sono contenute nel DNA. Il fatto di avere trasportatori specifici fa in modo che ci siano segnali che arrivino fino al DNA e che facciano fare trascrizione ecc. che creano gli enzimi giusti.

Gli acidi organici interferiscono con il pH intracellulare abbassandolo a livelli che non consentono le attività enzimatiche della cellula, costringe a usare energia per buttare fuori dalla cellula i protoni che si formano fino a che l'energia non esaurisce. Gli acidi deboli, la loro forma indissociata attraversa facilmente la membrana, ma una volta all'interno tornano in equilibrio con la loro forma dissociata e interferiscono con il pH poiché liberano ioni H+. Il pH si abbassa e la cellula reagisce portando fuori i protoni, ma a discapito di energia (ATP). Se si consuma eccessiva energia si ha una crisi energetica, che se prolungata porta alla morte cellulare. Essi hanno quindi una attività antimicrobica.

La parete cellulare (batteri)

Ci sono organismi unicellulari eucarioti (lievito) che hanno una sorta di parete cellulare, anche se diversa da quella dei batteri. La parete conferisce rigidità, struttura e forma alla cellula. È costituita da materia organica (polisaccaridi e amminoacidi), è insolubile in acqua.

Batteri GRAM positivi: rispondono positivamente a una colorazione. Un gruppo di questi batteri è dotato di parete molto spessa. Batteri GRAM negativi: rispondono negativamente a una colorazione. La parete è più sottile e c'è un'ulteriore membrana esterna (separate da spazio periplasmatico). In ogni caso la parete è fatta di peptidoglicano (2 amminozuccheri che formano polimeri, le cui catene sono tenute insieme dai peptidi). La membrana era tenuta insieme da legami deboli (interazioni idrofobiche, idrofiliche-->la membrana è fluida), mentre nella parete ci sono legami covalenti (peptidici e glicosidici). Specie diverse di batteri possono avere sequenze diverse di quegli amminoacidi.

Per distruggere la parete cellulare servono enzimi che rompano i legami. (es. lisozima, che non ha origini microbiche ma è associato ai mammiferi ed è presente nella saliva, lacrime, latte, albume). Tutto il nostro corpo, sia all'esterno che all'interno, è colonizzato da microrganismi che prendono il nome di microbiota umano (esiste anche quello delle piante, degli animali, ecc..): la componente microbica si è evoluta insieme agli organismi superiori creando una simbiosi tale per cui questi microrganismi traggono vantaggio dall'uomo dal pdv nutrizionale, e quest'ultimo trae vantaggio dai microrganismi per i loro effetti positivi sulla fisiologia, sistema immunitario… tuttavia, per evitare che ci sia uno sviluppo eccessivo di questi microrganismi c'è l'enzima lisozima che interviene destrutturando la parete dei batteri.