Microbiologia

Microbiologia - Prof. Roberto Mattina

Introduzione

Viene definito microbo un organismo unicellulare, non visibile ad occhio nudo ma solo con il microscopio. Lo studio dei microbi è affidato alla microbiologia, che si divide in vari settori:

• Microbiologia generale: studia in generale le caratteristiche di tutti i microrganismi.
• Microbiologia industriale.
• Microbiologia agraria.
• Microbiologia veterinaria.
• Microbiologia medica: studia i microrganismi patogeni in grado di infettare l’uomo.

Nota Bene: I microrganismi (microbi) sono organismi presenti a tutti i livelli, senza i quali non potrebbe esistere alcuna forma di vita di tipo animale o vegetale. È perciò sbagliato dare sempre una accezione negativa al termine microbo.

Sono presenti diverse tipologie di microrganismi:

• Protozoi
• Alghe
• Funghi
• Batteri
• Cianobatteri
• Virus

Nota Bene: sono tutti organismi unicellulari, ad eccezione di alghe e funghi.

I microrganismi sono definiti ubiquitari: si possono trovare ovunque, a livello di ogni superficie. Sono presenti quindi microrganismi anche a livello dell’organismo umano, in particolare vengono distinti in:

• Saprofiti: sono organismi che, venendo a contatto con un individuo, non causano alcuna malattia infettiva. Spesso sono infatti microrganismi commensali, che vivono abitualmente all’interno di un individuo.
• Patogeni: sono microrganismi che, venuti a contatto con un individuo, sono in grado di scatenare un’infezione ed una conseguente malattia.
• Patogeni potenziali: sono microrganismi che generalmente rimangono isolati in un determinato distretto dell’organismo ospite comportandone dei benefici ma che, nel caso di spostamento in un altro distretto, hanno la capacità di scatenare un’infezione (es. l’enterobatterio Escherichia coli).
• Opportunisti: sono microrganismi che attendono un’“opportunità” per manifestare la propria patogenicità. In un individuo normale generalmente non danno problemi, ma nel caso di individui immunodepressi sono in grado di scatenare un’infezione.

I microrganismi che vengono a contatto con l’organismo umano vengono inoltre distinti in:

• Microrganismi autoctoni: quando vengono a contatto con l’organismo ospite sono in grado di aderirvi e di colonizzarlo.
• Microrganismi alloctoni: quando vengono a contatto con l’organismo umano vengono allontanati.

Postulati di Koch

Permettono di classificare un microrganismo come patogeno.

1. Il microrganismo deve essere associato alla malattia ed essere assente nei soggetti sani (sono presenti però eccezioni alla seconda parte).
2. Il microrganismo deve essere sempre isolabile dall’organismo infetto e deve essere ottenibile in coltura pura in laboratorio (anche in questo caso sono presenti eccezioni).
3. La coltura dell’organismo deve causare manifestazioni patologiche analoghe in un animale da laboratorio suscettibile al quale viene inoculato il microrganismo (ci sono eccezioni).
4. Un microrganismo analogo a quello ottenuto isolandolo dall’organismo infetto, deve essere ottenuto in coltura pura a partire dall’animale di laboratorio che è stato infettato.

Infezioni crociate nello studio odontoiatrico

Le infezioni crociate che si possono verificare nello studio odontoiatrico sono paragonabili, in un certo senso, alle infezioni nosocomiali: infezioni che si contraggono durante il periodo di degenza nelle strutture ospedaliere, ma che erano assenti (neanche in fase di incubazione) all’inizio del ricovero.

Le fonti di contaminazione nello studio odontoiatrico sono differenti: il cavo orale del paziente rappresenta una cavità in cui albergano numerosi microrganismi (commensali e non); le pratiche eseguite dal medico che sviluppino aerosol possono generare un concentrato di microrganismi:

• Nell’aria all’interno dell’ambulatorio
• Lungo le superfici del riunito e del mobilio
• Lungo le pareti
• A livello degli indumenti o dei DPI utilizzati dal medico
• A livello di tutta la strumentazione che viene utilizzata

Per questo motivo è opportuno controllare periodicamente il livello di contaminazione dell’ambulatorio:

• SAS: è un aspiratore di aria. Contiene una piastra di agar con la quale l’aria aspirata viene a contatto; la piastra viene poi esportata e posta in termostato a 37° per 24 h (tempo sufficiente allo sviluppo delle colonie monocitogenetiche). I risultati ottenuti possono essere i seguenti (nel primo caso l’aria aspirata è poco contaminata, nel secondo caso l’aria aspirata è invece molto contaminata).
• Controllo microbiologico delle superfici: si utilizzano dei kit che presentano 2/3 terreni di coltura, che vengono posti a contatto con le superfici dell’ambulatorio (riunito, mobilio, pareti, ecc.). Successivamente al prelievo il kit viene posto in termostato a 37° per 24 h, per controllare successivamente il numero di colonie sviluppate e le tipologie batteriche presenti.

Problemi legati al riunito

All’interno del riunito scorrono le tubazioni dei fluidi che vengono aspirati durante lo svolgimento delle pratiche odontoiatriche (acqua, saliva, sangue), che sono ad alta contaminazione. Le tubature presentano valvole unidirezionali antireflusso: si aprono permettendo il passaggio del fluido durante l’aspirazione, poi si chiudono ermeticamente impedendo il ritorno del liquido. Nel caso di riuniti datati, è possibile che si formino delle incrostazioni a livello delle valvole: questo ne comporta una perdita di funzionalità e si può assistere ad un ritorno di parte dei fluidi aspirati.

Possibili fonti di contaminazione delle apparecchiature

• Microrganismi del cavo orale: sono numerosissimi. Se il paziente non presenta particolari patologie si tratta generalmente soltanto di microrganismi saprofiti, ma se sono presenti alcune specie patogene questo può comportare un rischio sia per l’operatore che per i successivi pazienti.
• Biofilm: largamente presente a livello delle tubazioni interne del riunito e non può essere rimosso con l’utilizzo di disinfettanti o antibiotici.
• Acqua.

Sistemi utilizzati per rimuovere i microrganismi

Utilizzo di disinfettanti: I disinfettanti scelti devono essere molto efficaci e presentare sull’etichetta le sigle:

• Battericida
• Germicida
• Sporicida
• Fungicida
• Tubercolocida
• Virucida

Utilizzo di acqua distillata sterile: Non è uno degli strumenti più consigliati in quanto, non appena viene a contatto con il cavo orale, si contamina immediatamente con il biofilm e con tutti i batteri presenti.

Filtri: Sono molto efficaci. È fondamentale che siano sostituiti frequentemente, in modo tale che non perdano la propria capacità.

Ozono: L’ozono è sicuramente un potente agente ossidante con azione germicida. Il problema dei macchinari ad ozono utilizzati in odontoiatria è che la quantità di ozono rilasciata è molto bassa e questo non permette di raggiungere l’effetto germicida. Inoltre, a differenza delle forme vegetative, le spore sono resistenti all’ozono.

"Regole" per limitare le infezioni crociate

• Verificare periodicamente il buon funzionamento dei sistemi di sterilizzazione (stufe a secco, autoclave).
• Disinfettare accuratamente le superfici del riunito, cercando di non utilizzare sempre gli stessi disinfettanti (in modo tale che i microrganismi non sviluppino forme di resistenza).
• Utilizzare correttamente i guanti: indossarli in maniera adeguata e non convincersi di essere completamente al riparo da tutto quando li si indossa.
• Effettuare autocontrolli periodici sui livelli di contaminazione, esporre i risultati per fornire maggiori garanzie al paziente.

Batteriologia Generale

Generalità

Batterio: microrganismo unicellulare procariota, che non presenta un nucleo ben organizzato, non contiene clorofilla e si riproduce per scissione binaria.

Classificazione dei batteri

I batteri possono essere classificati a più livelli: classe, ordine, sottordine, famiglia, tribù, genere, specie, tipo, varietà. Nota bene: sono in grassetto le classificazioni a cui facciamo riferimento durante il corso.

I criteri attraverso cui vengono classificati i batteri sono:

• Criteri morfologici: permettono di ottenere le più ampie discriminazioni.
• Criteri biochimici: permettono di discriminare per genere e per specie.
• Criteri antigenici: permettono di discriminare per tipo e per varietà.

Proprietà morfologiche dei batteri

• Aspetto macroscopico della coltura: una singola cellula batterica viene posta in un terreno di coltura, all’interno del quale si riproduce numerose volte formando una colonia visibile ad occhio nudo.
• Aspetto microscopico: viene osservata la singola cellula batterica, della quale è possibile apprezzare la dimensione, la forma e lo stato di aggregazione.
• Proprietà tintoriali: i vari batteri differiscono in base alla risposta data ai diversi coloranti.

Proprietà biochimiche dei batteri

• Condizioni ottimali di crescita: si valutano la temperatura ed il pH ideali, l’utilizzo o meno di ossigeno per il proprio metabolismo e la pressione osmotica.
• Capacità di fermentare determinati prodotti.

Proprietà biologiche

• Patogenicità: capacità del batterio di scatenare un’infezione.
• Caratteristiche sierologiche: evidenziare nel siero di un paziente la presenza di anticorpi contro un determinato batterio.
• Sensibilità al batteriofago: come si comporta un batterio nei confronti del batteriofago, un virus in grado di attaccare solamente i batteri.

Osservazione dei batteri

Osservazione a fresco

Il batterio viene osservato direttamente sul vetrino. Vengono distinte due osservazioni:

• Osservazione su strato sottile: vengono osservati i batteri a livello di un campione di urine o di uno striscio di sangue.
• Osservazione a goccia pendente: permette di comprendere se il batterio ha capacità di movimento.

Preparati microscopici

I batteri vengono osservati al microscopio dopo che il vetrino è stato trattato con coloranti. Questo permette al microbiologo di discriminare tra batteri differenti.

• Colorazioni semplici: i preparati vengono colorati ponendo a contatto il materiale da osservare con un’unica tipologia di colorante. Possono essere:
• Monocromatiche: tutta la cellula batterica assume la medesima colorazione.
• Metacromatiche: le diverse strutture cellulari assumono gradazioni (o sfumature) differenti del colorante utilizzato.
• Colorazioni speciali: i preparati vengono colorati ponendo a contatto il materiale da osservare con due o più tipologie di coloranti differenti.

Coloranti

I coloranti sono sostanze chimiche colorate, in grado di legarsi ad un substrato colorandolo. Una sostanza viene definita colorata quando, per le sue qualità atomiche o molecolari, assorbe o modifica alcune radiazioni luminose (manifestando quindi un certo colore). I coloranti hanno la capacità di legarsi stabilmente al substrato grazie alla presenza di un gruppo auxopromo che, in base al batterio che deve legare, può avere un carattere acido o basico. Le soluzioni utilizzate come colorante possono essere naturali (derivanti da animali o vegetali) o artificiali (derivanti dall’anilina) e possono essere classificate come:

• Soluzioni acquose
• Soluzioni alcoliche
• Soluzioni idroalcoliche
• Soluzioni mordenzate

Nota Bene: Le soluzioni mordenzate ricorrono all’utilizzo di un mordente, una sostanza in grado di rafforzare maggiormente il legame del colorante al substrato. I coloranti più frequentemente utilizzati sono i seguenti: violetto di Nicolle (colora di viola), bleu di metilene (colora di blu), safranina (colora di rosso), fucsina (colora di rosso).

Allestimento di un preparato microscopico

1. Prendere un vetrino portaoggetti, pulirlo, sgrassarlo, sciacquarlo ed asciugarlo.
2. Distendere il materiale biologico da osservare sul vetrino porta oggetti. Il materiale può essere:
• Materiale liquido: sangue o saliva. Viene disteso senza particolari accorgimenti.
• Materiale solido: frammento di tessuto. Viene prima dissolto con acqua distillata o soluzione fisiologica e poi disteso sul vetrino.
3. Fare essiccare ed asciugare il vetrino con disteso il materiale biologico.
4. Fase di fissazione: il vetrino viene passato all’interno della fiamma di un becco Bunsen, in modo tale che il calore faccia aderire al massimo i batteri al vetrino.
5. Colorazione: può essere semplice o speciale.
6. Lavaggio del vetrino con acqua ed asciugatura.
7. Osservazione del vetrino al microscopio ottico, con l’utilizzo di un obiettivo ad immersione: sulla superficie del vetrino viene posta una goccia di olio di cedro che impedisce il frapporsi di aria tra vetrino ed obiettivo.

Colorazione di Gram

Esecuzione

1. Prime fasi di allestimento del preparato viste sopra.
2. Colorazione del preparato con violetto di Genziana anilinato o con violetto di Nicolle.
3. Utilizzo del liquido di Lugol per circa 30’’.
4. Decolorazione con alcol etilico (o con una miscela di alcol etilico ed acetone) per circa 30’’.
5. Colorazione con safranina diluita (rosso) che permette di colorare i batteri che hanno perso il colore violetto al passaggio 4).

Nota Bene: Questa colorazione permette di distinguere: batteri Gram+ colorati con il violetto, e batteri Gram- colorati con la safranina.

Spiegazione

La differenza tra batteri Gram+ e Gram-, evidenziata da questa colorazione, si trova a livello dello strato più esterno del batterio. In particolare i batteri presentano:

• Batteri Gram-: presentano uno strato esterno lipopolisaccaridico, che viene facilmente solubilizzato dall’alcol etilico (passaggio 4) comportando una perdita di colorante violetto.
• Batteri Gram+: lo strato lipopolisaccaridico è assente, per questo motivo l’alcol non è in grado di penetrare e di rimuovere il colorante violetto.

Colorazione di Ziehl-Neelsen

Esecuzione

1. Prime fasi di allestimento del preparato viste sopra.
2. Colorazione con fucsina (rosso) mordenzata con acido fenico (i batteri acido-alcol resistenti hanno una parete cellulare ricca in lipidi, questo rende necessaria la mordenzatura affinché il colorante penetri).
3. Decolorazione con alcol etilico a 96° e con acido solforico al 10%.
4. Colorazione con bleu di metilene (blu) che permette di colorare i batteri che hanno perso il colorante al passaggio 3).

Nota Bene: I batteri acido-alcol resistenti risultano colorati con la fucsina, gli altri (non resistenti) perdono la colorazione durante il trattamento con alcol etilico ed acido solforico per cui risultano colorati con il bleu.

Spiegazione

Alcuni batteri, come i micobatteri, sono molto ricchi in lipidi a livello della parete cellulare; questo permette che si formi una guaina protettiva dal trattamento acido-alcol (e quindi permette di non decolorarsi).

Colorazione di Neisser-Gins

Esecuzione

1. Vengono utilizzate miscelate due tipologie di colorante:
   • Soluzione A: bleu di metilene, alcol etilico a 96°, acido acetico, acqua distillata.
   • Soluzione B: cristal violetto, alcol etilico a 96°, acqua distillata.
2. Il preparato viene colorato con questa miscela.
3. Si aggiunge al preparato un colorante giallo definito crisodina.

Nota Bene: Con questa colorazione si ottiene una colorazione metacromatica dei granuli di volutina, che si colorano in modo diverso a seconda della loro posizione nella cellula batterica. Questo permette di distinguere le forme saprofite (presentano i granuli in posizione centrale o sub-polare) da quelle patogene (presentano i granuli in posizione polare).

Struttura dei batteri

Morfologia batterica

I batteri possono presentare forme differenti, che sono costanti all’interno dei generi, specie e famiglie. Le morfologie più ricorrenti tra i batteri sono:

• Cocchi: rotondeggianti.
• Bacilli: allungati e cilindrici.
• Coccobacilli: leggermente allungati.
• Vibrioni: ricurvi su un piano.
• Spirilli: ricurvi su più piani.

Stati di aggregazione

Sono le diverse modalità con cui i batteri, dopo aver proliferato, rimangono uniti tra loro:

• I cocchi possono aggregarsi sotto forma di:
  • Diplococchi: a due a due.
  • Streptococchi: uno di seguito all’altro.
  • Stafilococchi: a grappolo d’uva.
  • Tetradi: a gruppi di quattro.
  • Sarcine: a gruppi di otto.
• I bacilli possono aggregarsi sotto forma di:
  • Diplobacilli: a due a due.
  • Streptobacilli: uno di seguito all’altro.
  • A forme convergenti.

Composizione chimica

Dal punto di vista chimico i batteri sono costituiti da diverse componenti essenziali, comuni a tutte le cellule viventi: carbonio, idrogeno ed azoto; possono inoltre essere presenti, in minor quantità: zolfo, fosforo, potassio, sodio, manganese, zinco, cobalto.

Le varie componenti chimiche dei batteri possono formare diversi composti:

• Composti inorganici: acqua (70-95%) e sali minerali.
• Composti organici: proteine (15%), lipidi e carboidrati.

Anatomia della cellula batterica

Le cellule batteriche sono costituite da strutture diverse, che possono essere:

• Strutture fondamentali: strutture presenti in tutte le cellule batteriche e la cui presenza risulta indispensabile per la vita del batterio.
• Strutture facoltative: strutture presenti soltanto in alcune cellule batteriche e la cui rimozione permette comunque la vita del batterio.

Ciglia o flagelli

Strutture facoltative. Si tratta di estroflessioni del corpo cellulare, la cui lunghezza supera spesso quella del corpo cellulare. Sono catene polipeptidiche, contenenti una proteina elastica definita flagellina.