Microbiologia

Microbiologia

La microbiologia nasce quando nascono i primi microscopi. Si pensa intorno al 1664 con Robert Hooke. Fu il primo a notare e descrivere ciò che vedeva solo il microscopio e disegnò vegetaboli questi organismi. Vide muffe definite “”. Dopo Hooke, Antony Van Leven prosegue gli studi di Hooke con un microscopio modificato. Lo scopo era verificare la qualità delle stoffe essendone lui un commerciante. Fu il primo a descrivere i batteri.

Francesco Redi, 1650 circa, invalida la teoria della generazione spontanea. Nel 1700, dibattito a livello europeo sulla teoria della generazione spontanea. Conte di Buffon è stato uno dei primi creatori e sostenitori della teoria dell’evoluzione. Spalanzani e Voltaire: volevano demolire la teoria della generazione spontanea (→ con Pasteur muore questa teoria). Diederot e Lambert scrivono l’enciclopedia dove descrivono tutti i processi di trasformazione della materia in qualcosa di totalmente diverso mantenendo però delle caratteristiche positive.

Fermentazione

Lo step prima della putrefazione. Anche le malattie vengono viste come una fermentazione perché provoca gli stessi sintomi. Padre della chimica = Lavoisier. 1800 anno esplosivo – il risultato di una trasformazione di materia organica. Nel 1800 nasce il termine “biologia” da La Mark. Pieno periodo della rivoluzione francese. Si scopre che gli alimenti chiusi in contenitori ermetici e trattati con il calore (Lapertizzazione), non si degenerano così presto.

Nasce la microbiologia industriale. Bartolomeo Bizio (Venezia) ha correlato un batterio a un fenomeno che stava accadendo nella sua città. Nel 1828 Erenberg conia il termine “batterio”. Ferdinand Coon, padre della batteriologia, scopre le spore all’interno dei batteri. Il batterio del tetano è un anaerobio stretto. All’ossigeno non vive e produce spore. Se ci si graffia e il batterio entra nel nostro organismo e non c’è più ossigeno, il batterio germina e si moltiplica, produce una tossina, neurotossina. Charles de la Tour: la fermentazione è dovuta a dei microrganismi.

Membrana citoplasmatica

Accomuna tutte le cellule, procariotiche ed eucaristiche. Struttura dello spessore di 8 nm composta da un doppio strato fosfolipidico. Fisicamente separa l’interno della cellula, il citoplasma, dall’ambiente esterno. È coinvolta in differenti funzioni biochimiche, tra cui il trasporto e la trasmissione dei segnali. L’integrità delle membrana cellulare è fondamentale per la vita. Fosfolipidi come principale costituente. I lieviti possono contenere steroli mentre i batteri all’interno della membrana opanoidi, molecole planari rigide che stabilizzano la membrana e facilitano l’adattamento del microrganismo alle condizioni avverse. Rigidità e fluidità garantite a diverse condizioni ambientali.

Opanoidi: fluidità analoga funzione ma nei batteri. Non sono sufficienti a mantenere la pressione osmotica della cellula quindi deve esserci una parete. La fluidità è garantita dalla presenza degli acidi grassi. Al decrescere della temperatura aumenta la quantità di acidi grassi che hanno un basso punto di fusione.

• Introdurre i doppi legami – insaturazione (CIS); gli enzimi del nostro organismo riescono a digerire solo gli idrogeni CIS i TRANS non sono riconosciuti.
• Accorciamento della catena degli acidi grassi e fosfolipidi.
• Formazione degli acidi grassi ramificati.

Molti batteri hanno acidi grassi del ciclopropano, ciò avviene quando il microorganismo è sotto stress acido. Proteine di membrana immerse nella matrice: Proteine di trans membrana dal doppio strato all’interno proteine integrali di membrana. Le proteine devono essere in grado di muoversi e di modificare la loro conformazione. Gli steroli vengono prodotti quando il metabolismo del lievito è di tipo respirativo.

Negli archea a livello di membrana citoplasmatica. La catena degli acidi grassi è sostituita dall’isoprene legati all’ L-glicerolo mediante legame etere, molto più forte del legame estere tra il D-glicerolo e gli acidi grassi. Altri sono glicolipidi con isoprene e zuccheri.

Funzioni della membrana

• Barriera al passaggio di molecole polari e consente di mantenere elevate concentrazione di soluti nel citoplasma.
• Sede dei processi di trasporto e di secrezione e di esporto.
• Sede dei processi di formazione e mantenimento dell’energia come la catena di trasporto degli elettroni, fotosintesi, mantenimento della forza proton – motrice.

Sistemi di trasporto

Molecole idrofobiche (O₂, CO₂, N₂, benzene). Piccole molecole polari (H₂O, urea, glicerolo). Grandi molecole polari (glucosio, saccarosio). Ioni (H⁺, Na⁺, HCO₃^-, K⁺, Ca²⁺, Cl^-, Mg²⁺). Proteine di trasporto che consentono, attraverso la formazione di un canale e le variazioni conformazionali della proteina, il trasporto attraverso la membrana. Sistemi di simporto (due molecole entrano insieme) e antiporto (una molecola entra e l’altra esce).

Trasporto passivo o diffusione facilitata:

• Acquaporine
• Canali ionici
• Subunità ripetute della proteina di Ksca

Trasporto attivo: contro gradiente da bassa ad alta concentrazione. Necessita di energia perché avvenga. Trasporto attivo primario idrolisi di ATP fornisce energia. Trasporto attivo secondario energia liberata da gradiente elettrochimico. Traslocazione di gruppo si basa sul trasferimento di un gruppo fosforico. Attivo primario: sistema ABC, l’energia per il trasporto contro gradiente è fornita dall’idrolisi dall’ATP. Catene con non oltre 20 amminoacidi. Attivo secondario: l’energia libera del gradiente elettrochimico di membrana è impiegata per il trasporto (sistemi di simporto ed antiporto). Traslocazione di gruppo che si basa sul trasferimento di un gruppo fosforico. PEP – PTS.

Istidina:

• Donatore
• Accettore del gruppo fosfato

Gli enzimi arrivano ad un punto di funzionalità rispetto alla concentrazione dei soluti all’esterno. Quando arrivo al punto di saturazione l’enzima mantiene costante la velocità con cui fa entrare i soluti all’interno della cellula. Proteine ad alta affinità/bassa affinità per modulare il trasporto e la qualità di soluto da trasportare.

Secrezione delle proteine

Le cellule batteriche devono rilasciare nell’ambiente circostante differenti proteine coinvolte ad esempio nei processi di degradazione delle macromolecole, che per le dimensioni non possono essere trasportate attraverso la membrana. In questo caso gli enzimi responsabili dell’idrolisi vengono riversati all’esterno della cellula, che introduce al suo interno solo i prodotti derivanti dalla degradazione del substrato. Esempi di enzimi sono le idrolasi, quali le proteasi, le amilasi e le cellulasi. Alcune proteine secrete dalla cellula hanno invece importanti funzioni permettendo ad esempio l’adesione ai tessuti. Proteine APF (adesion promoting factor).

Secrezione: processo di trasporto di una proteina dal citoplasma attraverso la membrana all’esterno della cellula. Esporto: trasporto di una proteina dal citoplasma allo strato periplasmatico dei gram-. Non è corretto usare il termine esporto per le proteine dei batteri gram+.

Nei batteri gram+: le proteine vengono secrete nell’ambiente esterno attraverso il sistema GSP, general secretory pathway. Nei batteri gram-: il GSP viene impiegato per l’esporto delle proteine nello spazio periplasmatico. Esistono poi vari sistemi che consentono la traslocazione della proteina attraverso la membrana esterna. Il riconoscimento avviene mediante la coda del leader peptide. Una volta collegate il GSP con il leader peptide, si collegano a proteine di membrana che le fanno uscire dalla membrana. Qui trova il segnal peptidasi che taglia il collegamento con il leader peptide. Nei gram negativi manca ancora il passaggio dalla membrana citoplasmatica.

Parete cellulare

Gram+ : solo parete molto spessa. Gram- : parete e membrana più sottili. Danni: Meccanici dovuti alla pressione osmotica. Per osmosi la cellula tende ad assorbire l’acqua. La pressione osmotica porterebbe a lisi della cellula stessa. Deve rimanere comunque porosa ed elastica pur rimanendo rigida. Sempre permeabile. L’unico materiale che ha queste caratteristiche nei batteri è il peptidoglicano (o mureina). Cambia il modo in cui sono legati i peptidoglicani da battere a battere.

Il peptidoglicano è composto da:

• N - acetilglucosammina (G)
• Acido acetil – muranico (M) legati da un legame β-1,4. Comune sia ai gram+ che ai gram-.

È un polisaccaride. All’acido N – acetil muranico si legano:

• L - alanina
• Acido D - glutammico
• Acido meso diamino pimelico
• Alanina

Nei gram+ il terzo acido è sostituito dalla lisina e così cambia la capacità di creare legami. Legame diretto tra le catene polipeptidiche. Nei gram- i polipeptidi hanno poche possibilità di creare legami.

Negli archea

La parete cellulare non contiene mai peptidoglicani. In caso sono composte da proteine, glicoproteine o pseudomureina. Negli archea il legame tra i due mattoncini è β-1,3, per la sua posizione non può essere attaccato dal lisozima. Lisozima: taglia il legame β-1,4, digerisce il peptidoglicano.

Glicerofosfato (Legame estere) residui glicosidici o di esteri di D - alanina → Ribitolfosfato. Acido teicoico: hanno una carica negativa, consentono alla parete di mantenersi elastica. Sono legati alla parete mediante legame covalente. Acido lipoteicoico: immerso in acidi grassi. Possono venir persi nell’ambiente dove vive il battere. Responsabile dell’idrofobicità. Autolisine: enzimi che partecipano nella sintesi del peptidoglicano.

I gram negativi sono differenti dai gram positivi per lo strato lipopolisaccaridico. Formato da un core polisaccaridico e il “vero e proprio”. Inoltre è ancorato alla membrana.

Lipopolisaccaride: è la componente che determina la risposta immunitaria dell’organismo. Caratteristiche antigeniche: stimola la reazione dell’anticorpo. Code di acidi grassi legate con legame estere al polisaccaride, portante gruppi fosfati (portano carica negativa). Al lipide A è attaccata il core polisaccaridico:

• Deossizuccheri: Lo Ko jo

Colorazione di gram

Si basa sulla differenza di permeabilità dei coloranti alle membrane di gram+ e gram-. Serve: cristal violetto, safranina: serve solo come colorazione di contrasto. Fuori dalla parete le cellule batteriche possono avere lo strato s o S-layer. È costituito da uno strato proteico o glicoproteico. Se rompiamo l’S-layer le ioduro di potassio proteine hanno la capacità di riaggregarsi. Riassociazione. (soluzione di lugol/salda d'amido) S-layer facilita i processi di adesione. È importante anche per la risposta immunitaria dell’organismo. All’esterno dell’S-layer può esserci la capsula o glicocalice: strato polisaccaridico che può avvolgere il battere. Viene formato da alcuni batteri oppure no. Fra quelli che lo producono, dipende dalle condizioni di crescita del microorganismo.

Bacillus antracis capsula proteica:

• Con capsula: possono diffondere la malattia
• Senza capsula: non arrivano a diffondere

Gram- → rosa/rosso

Gram+ → viola

Esopolisaccaridi: sono responsabili per esempio della densità dello yogurt. Nel vino portano al filante.

Appendici associate alla parete cellulare

2 tipi di appendici:

• Flagelli: criterio di identificazione tassonomica dei microorganismi.
• Pili o fimbrie (tipiche dei gram-).

Monotricoo anfitrico 3 – 12 di lunghezza, lofotrico 12 – 30 nm di diametro, peritricoo. I flagelli possono venire rotti per danni tecnologici alla cellula quindi perdita della motilità. Posizione e numero di flagelli è dettato dal corredo genetico.

Flagello:

• Placca
• Uncino: parete rigida curvata che permette la rotazione dell’elica. Possono cambiare senso di rotazione.
• Filamento: viene ancorata tramite l’uncino alla parete basale. È costituito da una proteina: la flagellina.
• Cappuccio: parte apicale del flagello.

La parte responsabile del movimento è quella basale. Anelli MS e anelli C tenuti insieme da un albero motore. Proteine MOT. L’energia che serve per muovere questo motore è la forza proton-motrice. Proteine mot attivano un’attrazione/repulsione di carica che provoca la rotazione degli acidi.

Chemiotassi positiva → si muovono a seconda della concentrazione di sostanze nutrienti.

Chemiotassi negativa → secondo luce.

Pili e fimbrie: sottili appendici lunghe circa 1 μm e del diametro di 3-5 nm, tipiche delle gram-. Costituiti da sub unità proteiche che si ripetono disposte, secondo la simmetria elicoidale attorno a una cavità vuota. Non sono coinvolti nel movimento. Sono deputati all’adesione della cellula ad alcuni, detti pili sessuali, sono coinvolti nel trasferimento del materiale genetico da una cellula maschile ad una femminile.

La spora batterica: endospora: sporulazione e germinazione. Consente al microorganismo di passare da uno stato vitale a uno stato criptobiosi.

Fasi della sporificazione

• Divisione asimmetrica
• Sporofito (meiosi con produzione di spore): organismo pluricellulare diploide terrestri 3 generazioni in contemporanea
• Tutte le piante dotate di fiore hanno ciclo biologico aplodiplonte.

Nutrizione microbica

Rappresenta l’insieme dei processi in cui i microorganismi assumono e utilizzano i nutrienti per ottenere energia ed intermedi metabolici da impiegare nella sintesi dei loro costituenti cellulari. L’acqua è il primo componente in quanto rappresenta l’80/90% del peso totale di una cellula vegetativa. Per la restante parte la cellula è costituita da macromolecole:

• Proteine 55%
• Acidi nucleici 24%
• Lipidi 9,1%
• Polisaccaridi 5%
• Amminoacidi, zuccheri

Altri elementi:

• Carbonio
• Ossigeno
• Azoto
• Fosforo
• Zolfo, sodio, potassio
• Cobalto, cromo, nikel, zinco, calcio

Carbonio

Rappresenta lo scheletro delle molecole biologiche funzionali:

• Autotrofi: Dipende dalla fonte di carbonio utilizzata
• Eterotrofi: usano altre fonti di carbonio per poter ricavare il carbonio organico per le vie di biosintesi. Usano fonte organiche come zuccheri. Vie fermentative.

Azoto

È la costituente base di amminoacidi e basi azotate; viene utilizzato in forma elementare (N₂) dai batteri azoto fissatori. I microorganismi incapaci di fissare l’azoto lo utilizzano in forma combinata inorganica e organica (NH₄⁺, proteine, amminoacidi). Alcuni microrganismi sono capaci di sintetizzare azoto utile a partire dalla (?)tiamina. Batteri lattici aa, piccoli peptidi, basi azotate → Lieviti nitrati, ammonio, area, aa, piccoli peptidi, composti purinici e pirimidinici.

Ossigeno

Componente universale. I microorganismi si differenziano in base alle loro esigenze di ossigeno molecolare.

• Anaerobi obbligati: risulta addirittura tossico
• Aerobi obbligati: è il nutriente essenziale poiché è l’accettore finale della catena di trasporto degli elettroni.

Catalasi: degrada l’H₂O₂ e la ritrasforma in O₂. Per ossidasi:

• Anaerobi facoltativi: richiedono ossigeno per la biosintesi ma possono usarlo o meno come accettore finale della catena degli elettroni.
• Aerobi aerotolleranti: dotati di metabolismo fermentativo e anche se non utilizzano l’O₂ lo tollerano.

Fosforo

Esiste sotto forma di fosfato organico e inorganico. È indispensabile per la sintesi di acidi nucleici e fosfolipidi. Utilizzato sotto forma inorganica PO₄^-3. Fosfatasi idrolizzano il P organico esterificato per produrre P inorganico libero. Nei terreni colturali è da aggiungere sotto forma di sale anche per mantenere il pH nel mezzo (soluzione tampone).

Zolfo, potassio, magnesio, calcio e sodio

Zolfo: cisteina, metionina, biotina, tiamina e coenzima A.

Fattori di crescita

Composti organici come micronutrienti, la cui presenza è indispensabile per i microrganismi non sono in grado di sintetizzare:

• Vitamine del gruppo B
• Amminoacidi
• Vitamine: biotina, tiamina (B1), acido nicotinico, la cobalamina (B12)
• Basi azotate: acidi nucleici

Fototrofi = luce ATP → Chemiotrofi = composti chimici ATP.

Terreni culturali

Qualsiasi substrato, liquido o solido, contente i nutrienti necessari per la crescita di microorganismi. Terreni semplici quelli la cui formulazione prende l’uso di concentrazioni note di un numero variabile di ingredienti chimicamente definiti. Terreni complessi quelli di cui si conosce in maniera dettagliata la composizione chimica.

Isolamento diretto

L’isolamento diretto viene effettuato su terreni colturali selettivi, differenziali o differenziali selettivi e i metodi di più comunemente impiegati per ottenere colonie isolate su terreno solido sono lo striscio a colonia singola, lo spatolamento e inclusione in piastra.

• Spatolamento = per microrganismi prevalentemente aerobi
• Inclusione = si riduce lo strato di ossigeno
• Isolamento per arricchimento