Microbiologia dei microrganismi

Microbiologia dei microrganismi

Microrganismi

Per microrganismi si intende:

• Batteri
• Funghi
• Alghe
• Protozoi

Questi insieme a piante e animali compongono gli alberi filogenetici: questi sono costruiti mediante confronti che hanno come risultati dei numeri (da cui si ottengono le dimensioni delle linee che costituiscono gli alberi filogenetici).

Differenze tra eucariota e procariota

I domini caratterizzati dalle cellule procariote sono gli Archea e i batteri. La maggior parte di essi ha dimensione tra i 100 nm e i 10 micrometri. Non hanno organelli ma un pool di enzimatico; sono rivestiti da una membrana citoplasmatica e da una parete cellulare (batteri di peptidoglicano archea no); il DNA cromosomiale è superavvolto in una forma CCC covalentemente chiusa; non hanno un nucleo ma una zona nucleare in cui si compatta il materiale genetico; hanno i ribosomi 70S per la sintesi proteica, sono aploidi (DNA in unica copia); possono avere elementi di DNA extracromosomiale: i plasmidi che gli forniscono funzioni aggiuntive per la sopravvivenza (per es. resistenza agli antibiotici); svolgono la mitosi ma non la meiosi né la riproduzione sessuata.

La cellula eucariote deriva dalla simbiosi tra una cellula eucariote ed una procariot ha dimensione tra i 10 e i 100 micrometri; non è rivestita dalla membrana cellulare; il nucleo è rivestito da una membrana nucleare; è compartimentata e possiede organelli dotati di membrana; il ribosoma è 80 S; svolge sia mitosi, meiosi e riproduzione sessuata; è diploide (due coppie di cromosomi).

Scoefficiente di sedimentazione in secondi che dipende dalla densità e dalla viscosità del mezzo e dalla temperatura. In una molecola si riferisce al valore che si otterrebbe se il mezzo fosse acqua e 20 gradi. L'unità di misura di s sono le unità Svedberg, 1 unità s corrisponde a 10^-13 secondi.

s= velocità di sedimentazione \ (velocità angolare del rotore in radianti\secondo x la distanza della particella dall'asse di rotazione in cm).

Nomenclatura dei microrganismi

Nella maggioranza dei casi i microrganismi si identificano con: “genere, specie” scritti in corsivo, es. Saccharomyces cerevisiae. È la tassonomia che si occupa di nominare i microrganismi identificandone la specie.

Nel 1886 Haeckel creò il regno dei “protisti”; successivamente, nel 1969, Whittaker suddivise i regni in:

• Protisti
• Protozoi
• Funghi
• Alghe
• Batteri
• Piante
• Animali

Infine, nel 1990, Woese suddivise i regni in:

• Batteri
• Achei
• Eucarioti

Regno dei batteri

I batteri si possono classificare in base a diverse, tra cui la forma:

• Streptococchi
• Tetrade
• Sarcine
• Stafilococchi
• Bacilli o catene di bacilli

Le forme più comuni sono:

• Bacilli
• Cocchi
• Vibrioni
• Spirilli

Microscopio

Virus microscopio elettronico: nanometri.

Microscopio ottico partendo dal basso i componenti del microscopio sono: fonte luminosa; diaframma: corona circolare il cui diametro può aumentare o diminuire, regola il passaggio della luce, più si deve ingrandire (più ci si avvicina) più si deve aprire per aumentare la quantità di luce che lo attraversa; condensatore; piano di appoggio per il vetrino; lenti nell’obiettivo che attuano un ingrandimento di 100x massimo 200x: possono essere a secco o immersione, nel secondo caso di mette una goccia di olio minerale con lo stesso indice di rifrazione del vetro per ottenere una migliore risoluzione; lenti nell’obiettivo ingrandimento 10x.

Preparato colorato

Dato che le strutture biologiche che dobbiamo studiare sono molto sottili, la luce che le attraversa le rende trasparenti, sono oggetti di fase. Si possono usare delle tecniche di colorazione per evitare il problema ma si corre il rischio di danneggiare i microrganismi, soprattutto le parti più piccole come i flagelli.

Microscopio ottico a contrasto di fase

Permettono di vedere oggetti di fase a fresco, senza bisogno di doverli colare. Esso è dotato di un diaframa anulare e un anello di fase. I fasci di luce generati attraversano il diaframma anulare, incontrano il condensatore che concentra la luce nel vetrino, a questo punto i raggi che non vengono deviati attraversano l’anello di fase nella parte più sottile subendo minor ritardo di fase, i raggi che incontrano qualcosa (il microrganismo per esempio) attraversano l’anello di fase nella zona più spessa subendo maggior ritardo di fase permettono di vedere il buio. In questo modo oggetti di fase vengono trasformati in oggetti di ampiezza.

Cellula

Membrane cellulari

Archea: Sono di due tipi: a doppio strato lipidico o monostrato lipidico di tetraedri di diglicerolo.

Eucarioti e procarioti è formata da un doppio strato fosfolipidico con le teste idrofila (gruppo polare, fosfato e glicerolo) esposte verso il mezzo acquoso mentre le code idrofobe (catene di acidi grassi) sono rivolte verso l’interno. Proprio per la loro caratteristica anfifilica ogni volta che vengono a contatto con l’acqua si organizzano a doppio strato. La membrana può essere più o meno fluida in base al tipo di fosfolipide da cui è composta e un aumento di temperatura ne aumenta la fluidità. Questa membrana è detta a mosaico fluido perché le molecole proteiche inserite al suo interno possono muoversi. Le sue funzioni sono: barriera permeabile in quanto separa l’interno della cellula con l’ambiente esterno ma permette il passaggio di nutrienti e metaboliti da interno a esterno e viceversa; permette di conservare l’energia in quanto mantiene la forza protonmotrice: tiene separate le cariche, e la concentrazione più elevata di ioni OH^- all’interno permette di avere un pH più elevato rispetto all’esterno. Sito di ancoraggio per le proteine di trasporto, metabolismo energetico e chemiotassi.

Sistemi di trasporto

I sistemi di trasporto si dividono in: trasporto attivo in cui la sostanza si muove contro gradiente di concentrazione, per il quale serve energia; trasporto passivo in cui le sostanze si muovono secondo gradiente di concentrazione, quindi non è necessario l’utilizzo di energia.

Sistemi di trasporto attivo secondario avvengono grazie a delle proteine di trasporto poste sulla membrana:

• Sistema uniporto trasporta una unica tipologia di molecole o classe di molecole verso una sola direzione, di solito per molecole tossiche che devono essere trasportate all’esterno.
• Sistema simporto: l’ingresso della molecola è abbinato ad un’altra per differenza di gradiente (da dove è più concentrata a dove lo è meno) e trascina suddetta molecola.
• Sistema antiporto: è il trasporto contemporaneo di due specie che attraversano la membrana in direzioni opposte. Una sostanza si muove secondo gradiente mentre l’altra contro gradiente sfruttando l’energia generata dalla prima.

Traslocazione di gruppo complessa PEP, PTS avviene grazie a 5 proteine di cui una è posta transmembrana. Lo zucchero quando entra viene fosforilato, perché questo avvenga è necessario fornire ATP. Il gruppo fosfato viene donato dal PEP che diventa piruvato che poi viene donato a tutti i componenti della catena finché arriverà allo zucchero che potrà entrare nella cellula.

Esempio trasporto lattosio

Nello yogurt Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus trasportano al loro interno il lattosio mediante simporto con ioni H⁺, a questo punto il lattosio viene scisso dalla beta galattosidasi in galattosio e glucosio (questo entra nella glicolisi). All’aumentare della concentrazione di galattosio questo viene secreto in antiporto con il lattosio.

Parete cellulare

La parete cellulare è una struttura che si colloca al di sopra della membrana cellulare; conferisce rigidità e resistenza agli stress osmotici. Se la parete è integra e la metto in una soluzione, qualunque essa sia non succede niente, se la tratto con lisozima, la elimino. Mettendo la cellula in una soluzione isotonica essa assume la forma di sferoplasto, al fine di esporre la minor superficie possibile. Se la soluzione è ipotonica (maggiore concentrazione di sale nella cellula) l’acqua entra nella cellula secondo gradiente osmotico e la fa gonfiare fino a scoppiare.

Gram positivi

Sono dotati di una parete cellulare molto spessa monostrato. Essa è costituita da uno spesso strato di mureina in cui sono inseriti gli acidi teicuronici e teicoici che sprofondano fino alla membrana cellulare. La parte sottostante è comune a quella dei gram negativi, è composta da peptidoglicani. È quindi composta da catene di polisaccaridi formate dall’alternanza di N-acetilglucosamina (NAG) e acido N-acetil-muramico (NAM) tenuti insieme da legame beta 1-4 glicosidico e trasversalmente queste catene sono unite da legami isopeptidici tra i peptidi attaccati a NAM. Per disgregarla servono delle proteasi, degli enzimi specifici come lisozima perché questi legami sono molto forti.

Gram negativi

Sono circondati da una membrana esterna particolare. Essa è asimmetrica, è formata da fosfolipidi all’interno e lipolisaccaridi all’esterno, qui sono inserite proteine transmembrana che sporgono all’esterno.

Colorazione di Gram

1. Mettere le cellule sul vetrino e scaldarlo per fissarle.
2. Colorazione primaria: trattare il batterio con cristal violetto.
3. Mordente: coprire il preparato con il liquido di Lugol: una soluzione di ioduro di iodio e potassio sia i G+ che i G- sono viola.
4. Decolorazione: aggiungere etanolo che scioglie la membrana fosfolipidica, a questo punto i G+ rimangono viola, invece i G- trasparenti.
5. Colorazione di contrasto: aggiungere safranina, i batteri G- diventano rossi mentre i G+ rimangono viola.

Come viene costruita la parete cellulare

La parete cellulare viene costruita partendo dall’interno. Dentro la cellula vengono creati dei monomeri polari che legati a dei lipidi apolari possono attraversare la membrana cellulare. Tutti questi componenti vengono poi assemblati all’esterno della cellula tramite degli enzimi. Tutto ciò che interferisce può causare la morte della cellula.

Antibiotici

Gli antibiotici che trasportano H⁺ possono entrare nella cellula “nascondendo” la loro carica e provocandone la morte; alcuni bloccano i precursori o i peptidi che servono a costruire la membrana oppure bloccano il meccanismo stesso come la Penicillina, la vancomicina invece si lega con il peptide D-ala D-ala, in generale sono molto specifici. I microrganismi possono disgregare l’antibiotico o altri sono in grado di cambiare il peptide in questione, nel caso della vancomicina questo viene trasformato in D-ala D-lattato che non può essere più riconoscibile dall’antibiotico. La capacità dei microrganismi di resistere agli antibiotici può essere trasferibile, per questo motivo non possono essere dati antibiotici a scopo preventivo agli animali da allevamento e non possono essere usati microrganismi con questa capacità per produrre alimenti.

Parete di Saccharomyces cerevisiae (lieviti)

La parete dei lieviti è diversa per ogni specie, è spessa tra i 100 e i 200 nm. Sopra la membrana cellulare si trova lo spazio periplasmatico al di sopra del quale c’è la parete. Il primo strato che si incontra è la chitina, un polimero di NAM, può essere del tutto assente in alcuni lieviti, ce n’è di più in quelli filamentosi, in Saccharomyces cerevisiae che si concentra nelle zone della gemmazione perché è il maggior costituente delle cicatrici di gemmazione, ha anche funzione di recezione delle tossine killer; poi c’è uno strato più spesso di beta glucani: polisaccaridi formati da glucosio, il cui primo strato conferisce rigidità e il più esterno elasticità; infine c’è uno strato di mannoproteine legate alle microfibrille di glucano con legami covalenti.

La conformazione della membrana può portare a due diversi eventi durante le fermentazioni alcoliche:

• Flottazione se la matrice del lievito intrappola la anidride carbonica sta sulla superficie del liquido in cui è immerso; top yeast se invece ha densità maggiore del liquido andrà a fondo: bottom yeast.

Altro: strutture esterne del movimento

Innanzitutto c’è da dire che quando si vedono muoversi le cellule sul vetrino non significa che si stanno muovendo ma semplicemente che la fase acquosa in cui sono collocate le “sposta”.

Le strutture del movimento sono:

• Ciglia
• Flagelli: alla base ci sono proteine; una parte di queste sta all’interno della membrana mentre un’altra sta al di fuori. Quest’ultima è sinuosa ed è proprio questa caratteristica a permettere il movimento (rotazione). Il movimento non è diffuso perché comporta utilizzo di molta energia.

Batteri e molecole antibiotiche

Le molecole antibiotiche sono prodotte da microrganismi e sono attive contro specifici microprocarioti:

• Battericida: ha concentrazioni elevate, uccide.
• Batteriostatica: blocca i meccanismi vitali della cellula, la sintesi della parete e si ha una perdita di vitalità dei microrganismi.
• Biocida: ha azione antisettica; interagisce con molte strutture della cellula ma non ha un bersaglio preciso (es. candeggina).

Classificazione dei microrganismi

I microrganismi si classificano in quattro categorie sulla base di come recuperano ed utilizzano l’energia:

• Fotoautotrofi: energia dalla luce e carbonio dalla CO₂
• Fotoeterotrofi: energia dalla luce e carbonio dalla sostanza organica
• Chemioautotrofi: energia dalla sostanza organica e carbonio dalla CO₂
• Chemioeterotrofi: energia e carbonio dalla sostanza organica

Microrganismi in laboratorio

Terreno di coltura può essere liquido (brodocoltura) o solido che può esserlo naturalmente o reso tale tramite l’aggiunta di agar agar 15 g/l, in questo caso viene messo nella piastra petri. L’agar agar è una polvere solubile in soluzione acquosa a 100 gradi, indurisce a 40 e rimane solida fino a 80. È un gelificante inerte: non viene utilizzato dai microrganismi come fonte di carbonio; non interagisce né con il pH né con la disponibilità dei nutrienti.

Tecniche di semina

Le colture possono essere inoculate con un’ansa in superficie, in superficie per spatolamento per inclusione.

Con la tecnica di superficie con la coltura viene distribuita sulla piastra Petri con la tecnica dello striscio, i microrganismi il più possibile distanziati l’uno dall’altro. Poi si chiude la piastra col coperchio e la si pone nel contesto atmosferico più adatto a tali microrganismi, dopodiché la piastra viene chiusa e messa a testa in giù per evitare il ricadere della condensa. Alla fine del periodo di incubazione si possono vedere sulla piastra le colonie batteriche.

In sup. per spatolamento, in questo caso si diluiscono i batteri in una soluzione, se ne preleva una goccia per poi metterla sulla piastra, e distribuirla con la spatola. Se vedo molte colonie vicine sono in presenza di un tappeto. Se invece si inocula per inclusione si deve prima inserire i microrganismi nella piastra e poi mettere sopra il terreno che ingloba le cellule e poi solidifica. Da questa tecnica si otterranno sia colonie in superficie che in inclusione.

Colonia

Ciò che è macroscopicamente visibile a occhio nudo su un terreno solido di coltura nato partendo da una sola cellula, può essere formata da catenelle o ammasso di cocchi.

Coltura pura

Fatta a partire da una singola unità di cellule di una colonia a partire da uno stesso ceppo, si classificano per forma, colore, margine, spessore.

Sterilità

Il terreno di coltura dovrà essere sterile prima di eseguire l’inoculo, significa che si dovrà distruggere ogni microrganismo vivente (si usano come indicatori le spore di Bacillus e Clostridium che devono essere assenti). Solitamente si esegue un trattamento in autoclave con aria umida ad alta pressione (raggi gamma, calore, aria secca). Un terreno sterile se messo in incubazione senza inocularlo non deve produrre colonie.

Scissione binaria nei procarioti

È una riproduzione asessuata e consiste fasi dette generazione: la cellula madre si divide in due cellule figlie in egual dimensione, è tipica dei batteri.

1. La cellula madre si allunga e duplica il DNA.
2. Nella cellula madre si forma un setto che deriva dalla introflessione della membrana plasmatica e della parete cellulare verso il centro della cellula da due direzioni opposte.
3. Il setto viene completato e si formano due pareti distinte.
4. Ogni figlia riceve una molecola di DNA cromosomiale, composti organici, inorganici e tutte le macromolecole che le permettono di vivere. Eventuali DNA extracromosomiali non è detto che le due cellule figlie li ricevano in egual misura, una delle due potrebbe anche non riceverne.

Il tempo di generazione è il tempo necessario alle cellule per raddoppiare:

Nt=N0 x 2ⁿ

dove Nt è il numero di cellule al tempo t, N0 è il numero di cellule all’inizio e n è il numero di generazioni dopo un tempo t.

n=(logNt-logN0)/log2

velocità di crescita=n/t

Tempo di riduzione decimale

Parametro per misurare la termoresistenza di un microrganismo, rappresenta il tempo necessario per inattivare il 90% della popolazione microbica ad una certa temperatura. Il tempo di riduzione decimale è funzione della temperatura secondo la legge di Bigelow:

Log (N/N0)=t/D

N e N0 sono il numero di microrganismi iniziale e finale. t è il tempo di esposizione ad una data temperatura. D è la diminuzione di un Log del numero di cellule vive (riduzione decimale).

Ciclo di crescita delle cellule batteriche

La prima fase è di latenza in cui il microrganismo deve adattarsi alle condizioni ambientali in cui si trova, non c’è una crescita numerica.