Microbiologia

Le tecniche di biologia molecolare applicata alla diagnostica

L'Indicatore del pH è il bromotimolo blu. Si visualizzano colonie di Aeromonas.

Dopo aver visto le tecniche tradizionali di tipo colturale che attualmente sono ancora le più utilizzate nei laboratori di microbiologia, spesso affiancate da tecniche immunologiche utilizzate quando non si può isolare il microorganismo o per avere una maggiore rapidità di risultato o come test di conferma, ci soffermeremo adesso su delle tecniche di ultima generazione che risultano ancora più rapide e valide di queste ultime perché sono tecniche dotate sia di elevata sensibilità che di elevata specificità, proprio quello che si chiede ad un test diagnostico, ovvero ottenere il numero più alto possibile di veri positivi e veri negativi.

Abbiamo a disposizione metodiche innovative che sono metodiche di biologia molecolare applicata alla diagnostica che si basano sull'amplificazione di geni target e l'amplificazione si

I vantaggi principali di queste tecniche sono:

• Si può effettuare la diagnosi direttamente su campione e non bisogna aspettare i tempi necessari alla messa in coltura, incubazione e crescita su terreno (minimo 24 ore).
• Non è necessario che il microrganismo sia vitale per identificarlo attraverso amplificazione del DNA.
• I campioni possono essere conservati per più tempo rispetto ai campioni per analisi tradizionale colturale (in questo caso il campione deve essere processato nel minor tempo possibile).

Si nota dalla slide come nei laboratori di microbiologia il peso delle innovative tecniche di diagnostica sia molto più elevato delle tecniche tradizionali, questo soprattutto in funzione dell'attendibilità diagnostica, ovvero alta sensibilità e specificità che in questo caso è maggiore del 90% (un test che è molto sensibile darà pochi FALSI NEGATIVI, ovvero evidenzia con molta attendibilità i soggetti).

Di completare la valutazione del patogeno saggiando la sua sensibilità agli antibiotici. Tutte le tecniche che rientrano nella terminologia di "tecniche basate sull'amplificazione degli acidi nucleici" (NATs), nelle diverse varianti: la nested-PCR, la multiplex-PCR la real-time, la single step PCR ecc sono tutte metodiche di biologia molecolare basate su amplificazione di geni o frammenti target con sensibilità e specificità superiore al 90%, quindi sono validissime.

La nested-PCR ha due o più tappe di amplificazione (generalmente nella prima tappa si utilizzano coppie di primers esterni al frammento da amplificare, nella seconda tappa due primers che sono interni alla coppia di filamenti e quindi ci vanno a amplificare sequenze che sono ancora più specifiche). Nell'immagine si vede un gel di poliacrilammide-urea al 6% dove sono stati caricati i prodotti di PCR ottenuti dall'amplificazione eseguita su campioni clinici oculari.

Perché Clamidia trachomatis è un patogeno responsabile del tracoma (infezione batterica degli occhi). Clamidia è uno dei batteri che non si riesce a coltivare su terreni classici quindi questa tecnica diviene ancora più valida in questo caso. La clamidia è un parassita intracellulare obbligato, ha caratteristiche comportamentali che lo fanno somigliare più a un virus che a un batterio ecco perché è difficile da diagnosticare con le tecniche classiche.

Esistono diversi sierogruppi di clamidia trachomatis, quelli che danno più frequentemente patologia sono quelli indicati a destra sul gel: il sierogruppo A (fluorocromo blu), il sierotipo B (fluorocromo verde). Quando si carica un gel bisogna sempre aggiungere gli standard e i controlli, questi in rosso sono gli standard e in questo caso questi sono i controlli, ovvero: abbiamo in laboratorio un sierogruppo A, B di clamidia, si amplifica e si carica in un pozzetto, mentre gli altri.

Frequentemente coinvolti nella meningite batterica sono in ordine pneumococco, meningococco ed infine l'haemophilus influenzae. La tecnica permette di discriminare quale dei vari possibili è il microrganismo coinvolto e anche quale sierogruppo specifico del microrganismo ha prodotto la patologia (difficilmente le infezioni sono multiple).

Il campione clinico su cui si effettua la multiplex nel caso della meningite batterica sarà il liquido cefalorachidiano. La meningite si presenta in primo luogo con sepsi, quindi sono campioni validi sia sangue, plasma, siero.

Esistono 12 sierogruppi per meningitidis, 3 per haemophilus B (vaccino obbligatorio) e C (sierotipo più comune) e oltre una quarantina per lo pneumococco.

Queste tecniche di biologia molecolare risultano fondamentali, soprattutto nel caso ad esempio delle meningiti, per effettuare studi epidemiologici. È molto importante evidenziare in primo luogo il ceppo e non solo la specie batterica in quanto sappiamo che la.

virulenza è portata dal ceppo. Nel caso del meningococco il 20% della popolazione è carrier, quindi portatrice sana di questo microrganismo al livello del cavo oro-faringeo e lo dissemina con l'aria nell'ambiente (serbatoio umano). I ceppi che isoliamo dal portatore sano sono ceppi non virulenti, generalmente non rientrano all'interno di quelle che sono indicate come linee ipervirulente. Con queste tecniche è possibile effettuare la tipizzazione molecolare. Abbiamo descritto le tecniche di tipizzazione convenzionale sono quelle immunologiche, basate sull'utilizzo di antocorpi diretti contro antigeni di superficie come la capsula, l'antigene O il flagello il pilus, invece queste ultime si chiamano tecniche di tipizzazione molecolare perché hanno come bersaglio sequenze specifiche del cromosoma batterico e possono anche queste essere eseguite a scopo diagnostico e su qualsiasi campione. La più utilizzata è la multilocus sequence typing (MLST),

Una tecnica basata sull'amplificazione di specifiche sequenze bersaglio e sul sequenziamento del frammento genico amplificato. Questa tecnica risulta particolarmente utile ai fini epidemiologici perché ci permette di individuare quali sono i particolari ceppi coinvolti all'interno di focolai infettivi sia sporadici che epidemici, oltre che per la diagnostica (è meno utilizzata in diagnostica perché è complicata, oltre all'amplificazione necessita del sequenziamento quindi se ne prediligono altre per la diagnostica). La caratterizzazione genotipica attraverso la MLST permette di stabilire, poiché andiamo a determinare quale è la sequenza nucleotidica dei geni amplificati, le relazioni clonali, quindi costruire l'albero filogenetico e stabilire se i ceppi che abbiamo isolato sono ceppi correlati o distanti geneticamente. Se i ceppi sono vicini geneticamente vanno a ricadere in quelle che possiamo definire linee ipervirulente (in una

linea ipervirulenta sono compresi ceppidiversi, come ad esempio ST11 di neisseria meningitidis per quanto riguarda il meningococco). ST-11 sta per sequence type 11 perché identificata con questa tecnica appenavista(MLST), ET-37 è la stessa linea virulenta ma evidenziata con una tecnica che si basa sulla mobilità elettroforetica degli enzimi. Altra tecnica di tipizzazione molecolare che risulta fondamentale soprattutto per la sorveglianza sanitaria è quella che si chiama multilocus enzyme electrophoresis o enzyme typing(LA SLIDE SPIEGATA A LEZIONE SU QUESTA TECNICA NON POSSO AGGIUNGERLA PERCHÈ MANCA) e si basa sull'analisi del polimorfismo di diversi enzimi andando a valutare quella che è la differente mobilità elettroforetica appunto di particolari enzimi. Nel pannello in A sono mostrati i pattern di migrazione dell'enzima Gliceraldeide fosfatodeidrogenasi di 10 diversi isolati clinici di Lysteria ( lysteria che è un

Microrganismo molto presente nelle malattie alimentari e in questo ambito è molto importante la sorveglianza.