Microbiologia Clinica - Introduzione

ANTIBIOGRAMMA

Metodo della brodo diluizione

• Preparare una soluzione madre di antibiotico
• Allestire provette con 1ml di brodo Müeller-Hintone diluire serialmente l’antibiotico

Test battericidi sul siero

• Determina l’attività di un antibiotico presente nel siero contro un microorganismo isolato dallo stesso paziente
• Il campione più appropriato è il siero
• I campioni dovrebbero essere testati 30 min. dopo infusione IV, 60 min dopo infusione IM, 60-120 min. dopo somministrazione orale

Test battericidi sul siero

• Agar viene seminato con concentrazioni standard del microrganismo
• In pozzetti vengono poste aliquote di siero da testare o aliquote note dell’antibiotico da testare
• Dopo incubazione Over night si determina la capacità battericida del siero di MIC (Minimal Inhibitory Concentration) e MBC (Minimal Bactericidal Concentration)

Infezione Virale

• Isolamento virale da campioni biologici e successiva siero-tipizzazione
• Ricerca di anticorpi specifici verso antigeni virali nel siero del paziente
• Identificazione di particelle, acidi nucleici e antigeni virali nei campioni biologici

Analisi virologica

• Il tempo medio di identificazione virale è breve (<2 giorni)
• Tutti i metodi utilizzabili richiedono virus vitali per cui i campioni devono essere prelevati nella fase acuta della patologia

Colture virali

• Tessuti (topo appena nato o embrioni di pollo)
• Colture cellulari

Colture virali

10 days (C) of exposure to supernatantsof HIV-infectedM/M.

Valutazione dell'effetto citopatico CPE

Identificazione di un antigene viralenella coltura

• Si coltiva il campione per 2 giorni
• Si ricerca un antigene virale medianti :Anticorpi a fluorescenza

Identificazione virale

I metodi basati sulla coltura dei virus richiedonogiorni

Per una diagnosi rapida (ore) si possono usare

• Metodo immunologici
• Test immunoenzimatici
• Test molecolari

Test immunologici

Si basano sull'identificazione nel campioneinviato e non coltivato di antigeni viralimediante immunofluorescenza diretta

Test immunoenzimatici EIA

Servono a rilevare l'eventuale presenza dianticorpo o di antigeni in un campione

Diagnostica Molecolare

Analisi qualitativa e quantitativa degli acidinucleici virali:viremia per HIV, HBV, HCV

Metodiche: PCR, RT-PCR, NASBA

Diagnosi sierologica

Serve ad individuare la presenza di anticorpidiretti verso il virus nel siero di pazienti

fibrinogeno ed altre proteine che intervengono nei processi di coagulazione

Analisi del sangue

Per le ricerche ematochimiche di routine viene utilizzato:

• Sangue venoso
• Sangue capillare

Il sangue arterioso viene utilizzato per lo studio dei parametri dell'equilibrio acido-basico

Prelievo Venoso

• Il prelievo viene effettuato dalla vena cubitale o da una vena del dorso della mano negli obesi
• Il laccio emostatico va sciolto appena l'ago entra nell'avena per evitare emoconcentrazione

Prelievo Capillare

• Nell'adulto dal polpastrello o dal lobo dell'orecchio
• Nei bambini dal calcagno
• Scartare la prima goccia e raccogliere il sangue che defluisce con un capillare

Prelievo Arterioso

• Si usa l'arteria radiale, femorale o brachiale
• Immobi

  canule, siringhe sterili

  • Il sangue viene raccolto in provette in plastica a fondo emisferico con tappi di diverso colore a seconda dell'anticoagulante presente

  Identificazione del Campione

  • Sui contenitori sono applicate etichette non asportabili
  • Le etichette devono permettere l'osservazione del campione
  • Su di esse vanno riportati i dati di identificazione del campione

  Analisi del Sangue

  • Il sangue intero si usa solo quando la sostanza da analizzare ha la medesima concentrazione nel plasma e negli eritrociti
  • Nelle determinazioni su plasma si ottengono valori 10-12% maggiori rispetto al sangue intero a causa del diverso contenuto di acqua (93% nel plasma, 80% nel sangue intero)

  Analisi del sangue

  È generalmente indifferente l'uso di plasma o siero

  • Il siero si ottiene lasciando coagulare spontaneamente il sangue per 30' in vetro (Più a lungo in provette di plastica) e separando il coagulo mediante centrifugazione 10' a 3000 rpm
  del sangue • Nel siero sono presenti in maggior concentrazione enzimi come la fosfatasi acida e lalatticodeidrogenasi liberati nella coagulazione • Il plasma si ottiene impedendo la coagulazione con l'aggiunta di anticoagulanti (EDTA, eparina, citrato di sodio, ossalato o fluoruro di sodio) e centrifugando per separare la fase corpuscolata. (2000-3000rpm per 10 minuti) Metodi di conservazione del sangue dopo il prelievo • Se il campione di sangue intero non può essere centrifugato entro 1 ora dal prelievo deve essere refrigerato; • I campioni di plasma possono essere refrigerati o congelati, anche se il congelamento può interferire con alcuni test (controllare le istruzioni del materiale analitico specifico). • Se il plasma eparinizzato è stato conservato durante la notte (o comunque per un simile lasso di tempo), prima di eseguire i test deve essere centrifugato di nuovo per rimuovere ogni eventuale residuo di fibrina;rine• In caso di analisi chimiche o fisiche, le urine devono essere raccolte in un contenitore pulito e sterile• È importante evitare la contaminazione delle urine con sostanze esterne come carta igienica o peli pubici• Le urine devono essere conservate correttamente, preferibilmente in frigorifero, fino al momento dell'analisi• È consigliabile seguire le istruzioni fornite dal medico o dal laboratorio per una corretta raccolta delle urine.