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Capacità di resistere alle difese

dell’ospite

• La capsula di alcuni batteri produce gel

idrofilici che impediscono la sua fagocitosi

• Alcuni batteri producono proteine capaci di

inibire tutti gli eventi che seguono la loro

fagocitosi

• Alcuni batteri producono inibitori dei fattori

del complemento

Tossicità microbica

• E’ la capacità di produrre tossine

• Exotossine: proteine secrete molto tossiche

ed immunogeniche.

• Endotossine: polysaccaridi complessi(LPS)

parte odella parete batterica Sono poco

immunogeniche.

Patogenicità

E’ caratterizzata da:

– fattori e meccanismi di virulenza

– carica batterica (numero iniziale di batteri

infettanti)

– stato dei meccanismi di difesa dell’ospite.

HOST DEFENSES

• physiologic barriers

• immunological responses

Some defenses are non-specific, others are

highly specific.

Skin and mucous membranes

Provide the first line of defense through

• Mechanical factors: physical barrier to

penetration.

• Chemical factors: gastric acidity, unsaturated

fatty acids, lysozyme.

• Microbial factors: antagonism by normal flora

Phagocytic cells

Provide a secondary line of defense

• Mononuclear cells: monocytes (blood) and

macrophages (tissue).

• Neutrophils: polymorphonuclear (PMN)

granulocytes. Fagocitosi

Humoral factors

Antibody mediated defenses include:

• Antitoxins: specific antibodies that bind

certain exotoxins.

• Bacteriolytic antibodies: antibodies plus

complement can directly lyse Gram-negative

cells.

• Opsonizing antibodies: coat cell surface and

enhance phagocytosis (Fc receptors).

Cell-mediated factors:

• Cytotoxic T-lymphocytes: specific cells capable

of destroying altered host cells.

• K and NK cells: lyse altered or transplanted

host cells.

• Activated macrophages: phagocytes that

possess a greatly enhanced capacity for

intracellular destruction of ingested

microorganisms

Analisi microbiologica

Ha lo scopo di identificare l’agente patogeno

responsabile di una malattia infettiva allo

scopo di suggerire un appropriato trattamento

terapeutico

Analisi microbiologica

L’esito delle analisi microbiologiche dipende da

più fattori:

• Il prelievo del campione

• Le modalità di invio al laboratorio

• Le procedure analitiche adottate

• L’interpretazione del referto

PRELIEVO DEL CAMPIONE

• Deve essere effettuato rispettando le regole

dell’asepsi

• Deve essere idoneo in rapporto all’indagine

richiesta PRELIEVO DEL CAMPIONE

ZONE NORMALMENTE STERILI

• Sangue e midollo

• Liquido cefalo rachidiano (LCR)

• Liquido articolare o della cavità pleurica

• Tessuti profondi

• Vie respiratorie inferiori

• Urine (se il campione è opportunamente raccolto)

ZONE CON POPOLAZIONE BATTERICA RESIDENTE

• Bocca, naso, vie respiratorie superiori

• Cute

• Tratto gastrointestinale

• Tratto genitale femminile

• Uretra

MODALITA’ DI RACCOLTA DEL

CAMPIONE

• Raccogliere il campione in quantità sufficiente

• Scegliere un campione rappresentativo del processo

morboso facendo in modo che esso contenga il patogeno

da identificare

• Raccogliere il campione nella fase acuta di malattia e

comunque prima dell’inizio del trattamento antibiotico

• Se il trattamento antibiotico è invece già stato iniziato

segnalare al laboratorio quale terapia è stata

somministrata

• Evitare contaminazioni da parte di microrganismi esterni

MODALITA’ DI TRASPORTO

DEL CAMPIONE

• Usare contenitori idonei e opportuni terreni di

trasporto

• Etichettare adeguatamente i campioni

• Completare la richiesta di esame con la diagnosi

presunta

• Inviare rapidamente il campione al laboratorio

in appropriate condizioni di temperatura (+4°C

o al massimo a temperatura ambiente, mai a

37°C). Terreni di trasporto

La sopravvivenza dei microrganismi durante il

trasporto è variabile

Per preservare i microrganismi durante il

trasporto i terreni devono contenere

• Soluzione salina tamponata

• Stabilizzatori proteici

• Indicatori di PH

• Antibiotici nel caso di trasporto di virus

Tipi di indagine microbiologica

Metodi diretti:

• Osservazione microscopica

• Coltura su terreni idonei

• Isolamento della o delle specie sospette

• Esecuzione dei test di sensibilità agli antibiotici

Metodi indiretti:

• Indagini sierologiche tese ad identificare

anticorpi specifici circolanti

Tipi di indagine microbiologica

diversi a seconda se l’agente patogeno da

identificare sia un battere un micete o un virus

Si useranno metodi diagnostici

• diretti per i batteri (ad eccezione delle

ricketsie e clamidie) ed i miceti che hanno la

capacità di vivere extracellularmente

• Indiretti per i virus che sono parassiti obbligati

intracellulari

Metodi Diretti

• Osservazione microscopica

• Coltura su terreni idonei

• Isolamento della o delle specie sospette

• Esecuzione dei test di sensibilità agli antibiotici

ESAME MICROSCOPICO DIRETTO

L’esame microscopico può fornire precise indicazioni

diagnostiche:

• quando si esamini un materiale normalmente sterile o

comunque proveniente da zone non in comunicazione

con l’esterno (liquido cefalo-rachidiano, essudato

pleurico o peritoneale, materiale purulento proveniente

da raccolte chiuse)

• quando si esamini un materiale nella cui popolazione

batterica normale non siano compresi batteri con i

caratteri morfologici e/o tintoriali del batterio osservato

ESAME MICROSCOPICO A

FRESCO

Si esegue soprattutto per la ricerca di

microrganismi, difficilmente colorabili con

le tecniche disponibili, evidenziabili invece

in campo oscuro (Treponemi e Leptospire)

ESAME MICROSCOPICO A FRESCO

Evidenziazione di Treponema pallidum in materiale patologico

proveniente da una lesione mucosa.

Il materiale, non fissato, è osservato in campo oscuro

Da: Microbiologia e Microbiologia Clinica

R. Cevenini, V.Sambri

Piccin ESAME MICROSCOPICO DIRETTO

Il campione colorato può fornire indicazioni

relativamente a:

• Presenza o assenza di batteri

• Quantità assoluta di batteri presenti

• Localizzazione dei batteri intra o extra-

cellulare

TIPI DI COLORAZIONI

–Semplici prevedono l’impiego di un solo

colorante:

• Cristalvioletto

• Fucsina basica

• Blu di metilene

–Differenziali prevedono l’impiego di più

coloranti come:

• Colorazione di Gram

• Colorazione di Ziehl-Neelsen

Colorazione GRAM

Doppia colorazione con Cristal violetto e poi con

ioduro di potassio

Permette di distinguere i batteri in due

sottogruppi facilitandone l’identificazione:

Gram-positivi di colore viola

Gram-negativi di colore rosso

Cocchi GRAM-positivi

Batteri GRAM-negativi

COLORAZIONE DI ZIEHL-NEELSEN

Utilizzata per identificare

batteri che appartengo al

genere Mycobacterium

Striscio su vetrino di escreato di un paziente con tubercolosi polmonare. Bacilli

alcool-acido resistenti colorati in rosso.

Leucociti polimorfonucleati colorati in blu

Da: Microbiologia e Microbiologia Clinica R. Cevenini, V.Sambri Piccin

Metodi Diagnostici Diretti

• Osservazione microscopica

• Coltura su terreni idonei

• Isolamento della o delle specie sospette

• Identificazione

• Esecuzione dei test di sensibilità agli antibiotici

ESAME COLTURALE

Viene effettuato per

• Isolare i batteri patogeni da campioni

contenenti altra flora batterica

• Identificare batteri grazie alla loro capacità

di fermentare alcuni carboidrati, alla loro

resistenza antibiotica o alle loro capacità di

sopravvivenza

ESAME COLTURALE

I terreni di coltura si distinguono in base allo

stato fisico in:

• liquidi (brodo)

• solidi (brodo normale solidificato con

agar)

BRODO NORMALE o BRODO

NUTRITIVO

• peptone (composto derivato dalla

digestione parziale di proteine animali)

0,5%

• estratto di carne 0,3%

• NaCl (per renderla isotonica)

• tampone fosfato (pH 7,0)

• H 0

2 AGAR

• polisaccaride acido estratto da alghe rosse del genere

Gelidium, frequenti nei mari tropicali

• formato per il 70% da agarosio e per il 30% da

agaropectina

• non viene metabolizzato dalla maggior parte dei batteri

• liquido a temperatura 80°C

• addizionato ad un terreno di coltura nella proporzione

dell’1,5 - 2%

• gelifica a temperatura compresa tra 42-47°C.

COMPOSIZIONE CHIMICA DEI

TERRENI

Indefinita

contenenti sostanze naturali quali peptone,

siero, liquido ascitico, sangue, estratto di lievito

etc.

Chimicamente definita

molto costosi ed utilizzati esclusivamente per

l’identificazione di batteri con particolari

esigenze nutrizionali

Terreni Minimi

Contengono carbonio, azoto, zolfo e

fosforo sotto forma di sali inorganici,

aggiunti in concentrazione nota

Terreni di arricchimento

Vengono utilizzati per far crescere microrganismi

patogeni presenti in piccole quantità e

particolarmente esigenti

Sono addizionati di:

• sangue

• siero

• estratto di lievito

• infusi di cuore e cervello

• carboidrati

• amminoacidi

Terreni Selettivi

Contengono:

• coloranti (cristalvioletto, verde brillante, fucsina

basica)

• antibiotici con attività batteriostatica nei

confronti dei microrganismi contaminanti

Vengono utilizzati per far crescere microrganismi

patogeni che si trovino frammisti alla flora

microbica residente (campioni provenienti da

pelle, gola, naso, intestino, vagina)

FATTORI CHE INFLUENZANO

LA CRESCITA BATTERICA

OSSIGENO

Aerobi obbligati: crescono solo in presenza di ossigeno

atmosferico

Anaerobi facoltativi: crescono sia in condizioni aerobie

che anaerobie

Anaerobi obbligati: crescono solo in assenza di ossigeno

atmosferico

Microaerofili: crescono in ambienti con ridotta pressione

parziale di ossigeno; crescono bene in atmosfera

addizionata di CO

2

Condizioni di anaerobiosi

Si ottengono facendo crescere i batteri anaerobi

Terreni riducenti terreni che contengono dei

composti chimici (tioglicolato di sodio) che si

combinano chimicamente con l’ossigeno atmosferico

fino ad esaurirlo

Incubatori speciali a tenuta stagna, contengono

sostanze chimiche (bicarbonato di sodio e sodio

boroidruro) che, quando vengono umidificate,

producono CO e H e successivamente H O con

2 2 2

scomparsa dell’ossigeno.

FATTORI CHE INFLUENZANO

LA CRESCITA BATTERICA

TEMPERATURA

• Psicrofili 15-20°C 10°C)

(Listeria monocytogenes anche

• Mesofili 20-45°C

• Termofili 45-60°C

FATTORI CHE INFLUENZANO LA

CRESCITA BATTERICA

pH

Il valore ottimale di pH è compreso tra 6,5 e 7,5

Alcuni batteri preferiscono il pH alcalino, altri

preferiscono il pH fortemente acido

FATTORI CHE INFLUENZANO

LA CRESCITA BATTERICA

PRESSIONE OSMOTICA

I microrganismi replicano generalmente meglio in un

terreno con concentrazione osmotica più bassa della

propria, in quanto questa condizione permette la

penetrazione dell’acqua all’interno della cellula.

La pressione osmotica del terreno può essere

modificata in base alla concentrazione di cloruro di

sodio o di glucosio

TEMPO DI DUPLICAZIONE DEI

BATTERI

• Escherichia coli

(in condizione di coltura ottimali) 20-30 min

• Escherichia coli

(nell’intestino umano) 12 ore

• Mycobacterium tuberculosis 18 ore

• Treponema pallidum 33 ore

Metodi Diagnostici Diretti

• Osservazione microscopica

• Coltura su terreni idonei

• Isolamento della o delle specie sospette

• Identificazione

• Esecuzione dei test di sensibilità agli antibiotici

ISOLAMENTO BATTERICO

E’ necessario tenere conto del sito di provenienza del

campione:

• pus

• liquido cefalo rachidiano

• sangue

generalmente contengono un solo tipo di microrganismo

• materiale fecale

• tamponi oro-faringei

• altri materiali biologici

generalmente contengono microrganismi contaminanti,

oltre al patogeno o ai patogeni responsabili dell’infezione

ISOLAMENTO COLTURALE MEDIANTE

TECNICA DELLA DISSEMINAZIONE IN

SUPERFICIE

• Utilizzare terreni solidi in piastre di Petri del

diametro di 12 cm.

ISOLAMENTO COLTURALE MEDIANTE

TECNICA DELLA DISSEMINAZIONE IN

SUPERFICIE

• Deporre una piccola quantità di materiale patologico

da esaminare al margine della piastra (se il materiale

è molto denso stemperarlo con soluzione fisiologica

o brodo sterile)

ISOLAMENTO COLTURALE MEDIANTE TECNICA

DELLA DISSEMINAZIONE IN SUPERFICIE

• Utilizzando una spatola distribuire il materiale sulla

superficie del terreno in modo da avere la

formazione di colonie ravvicinate nel primo tratto di

semina e di colonie

isolate nell’ultimo

ISOLAMENTO COLTURALE MEDIANTE

TECNICA DELLA DISSEMINAZIONE IN

SUPERFICIE

• Successivamente prelevare

sterilmente i batteri di una

colonia isolata (formata cioè

da una sola cellula batterica

iniziale) ed allestire una

coltura pura

Metodi Diagnostici Diretti

• Osservazione microscopica

• Coltura su terreni idonei

• Isolamento della o delle specie sospette

• Identificazione

• Esecuzione dei test di sensibilità agli antibiotici

Identificazione

• Prove biochimiche

• Prove sierologiche

• Indagini biomolecolari

Terreni differenziali

Contengono carboidrati (zuccheri) ed indicatori di

pH, che consentono di distinguere tra

microrganismi in grado di fermentare specifici

carboidrati, in base alla colorazione delle colonie e

alla loro morfologia.

Indicatori di pH sono:

• rosso fenolo

• blu di bromofenolo

Terreni Differenziali

Agar-sangue

Terreno allestito l’aggiunta di 5% di sangue (di

con

montone o di cavallo) utilizzato per evidenziare

la capacità di emolisi dei batteri

α-emolisi = emolisi parziale che dà luogo alla

formazione di un alone verde intorno alla

colonia per degradazione della bilirubina a

biliverdina

β-emolisi = emolisi completa che dà luogo alla

formazione di un alone trasparente intorno alla

colonia

γ-emolisi = mancanza di emolisi

EMOLISI

INDAGINI SIEROLOGICHE

Servono per la:

– identificazione e quantificazione di antigeni

batterici

– valutazione della risposta anticorpale

dell’ospite agli agenti infettanti

La medesima tecnica può essere utilizzata per

valutare sia l’antigenemia che l’assetto

anticorpale

INDAGINI SIEROLOGICHE

• Il dosaggio di anticorpi che aumentano in

risposta ad un agente infettivo generalmente

può solo aiutare nella diagnosi ma non può

sostituire l’isolamento e l’identificazione

diretta del microorganismo in esame

• Possono avere valore diagnostico solo quando

sia difficile isolare l’agente infettivo

(es.Toxoplasmosi)

INDAGINI SIEROLOGICHE

La presenza di strutture antigeniche specifiche

dei batteri può essere messa in evidenza

mediante impiego di anticorpi in

– Reazione di agglutinazione

– Reazione di immunofluorescenza

– Tecniche immunoenzimatiche (ELISA)

– Western blot

– Sonde molecolari

– Limulus test

Test di Agglutinazione

Un campione di fluido cerebrospinale contenente batteri (p. es. Haemophilus

influenzae) viene mescolato con una sospensione di particelle di lattice ricoperte

di anticorpi specifici (anticorpi contro la capsula di H. influenzae). L’interazione tra

antigene e anticorpi causa un’immediata agglutinazione di particelle visibile ad

occhio nudo. Test di agglutinazione

Test di Agglutinazione

Agglutinazione su vetrino

Prevede l’impiego di anticorpi, ottenuti in un animale

immunizzato, messi a contatto con il batterio o con suoi

antigeni solubili

Agglutinazione al lattice (AL)

Utilizzato per evidenziare gli antigeni polisaccaridici della

capsula batterica, costituiti da sequenze ripetitive di

zuccheri in grado di legare gli anticorpi in più punti. Per il

test si utilizzano anticorpi legati a particelle di lattice

REAZIONE DI IMMUNOFLUORESCENZA (IF)

PER EVIDENZIARE ANTIGENI BATTERICI

IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTA

Si utilizza un anticorpo coniugato con fluoresceina

isotiocianato, che sia specifico per l’antigene in esame

IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA

Si utilizza un anticorpo specifico per l’antigene in esame ma

non coniugato, che viene riconosciuto da un secondo

anticorpo coniugato e diretto contro regioni costanti delle

immunoglobuline della specie in cui è stato prodotto il primo

anticorpo l’identificazione

Test con anticorpi fluorescenti per la ricerca e di antigeni microbici (o tessutali) o di anticorpi

l’anticorpo e’

diretti contro entrambi. Nel test diretto, marcato con colorante fluorescente applicato su una

l’antigene, l’anticorpo l’anticorpo

sezione di tessuto che contiene quindi in eccesso viene lavato e rimasto

e’ l’antigene e’

legato visualizzato attraverso microscopio a fluorescenza. Nel test indiretto, rilevato mediante

aggiunta di un anticorpo non marcato e successivamente con un anti-anticorpo marcato con una sostanza

e’ sara’

fluorescente, che amplifica il segnale (se il primo anticorpo umano, il secondo anticorpo un anticorpo

).

contro le immunoglobuline umane, prodotto in una specie diversa da quella umana

REAZIONE DI IF PER EVIDENZIARE

ANTIGENI BATTERICI

La fluoresceina è un fluorocromo che quando viene

eccitato da una luce ad una certa lunghezza d’onda

emette una luce ad una lunghezza d’onda maggiore. Il

microscopio a fluorescenza utilizza una lampada che

emette luce ultravioletta che eccita la fluoresceina che

emette quindi una luce verde brillante.

Il limite della tecnica è rappresentato dalla necessità di

una adeguata consistenza numerica del batterio

ricercato

IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA

Evidenziazione di

Treponema pallidum in

materiale patologico

proveniente da una lesione

mucosa.

Il materiale è stato fissato e

colorato con la tecnica

dell’immunofluorescenza

indiretta

Da: Microbiologia e Microbiologia Clinica R. Cevenini, V.Sambri Piccin

Test immunoenzimatico (ELISA =

enzyme-linked immunosorbent assay)

Utilizzato per

la ricerca di

antigeni in

campioni

biologici Western blot

• Le molecole antigeniche di un microrganismo patogeno

vengono separate su gel di poliacrilammide in base al peso

molecolare (elettroforesi)

• trasferite su membrana di nitrocellulosa

• incubate con il siero del paziente

• aggiunto un anticorpo anti-immunoglobuline umane marcato

con un enzima (perossidasi).

• La presenza di anticorpi marcati viene evidenziata dall’aggiunta

di un substrato sul quale agisce l’enzima, che provoca la

precipitazione di colorante

ELETTROFORESI

Da: Microbiologia e Microbiologia Clinica

R. Cevenini, V.Sambri

Piccin SONDE MOLECOLARI

Utilizzato per la ricerca di sequenze significative del

genoma batterico in campioni biologici

Frammento del genoma batterico vengono clonati ed

amplificati in idonei vettori e marcati con traccianti

Le sonde molecolari si combinano specificamente con le

sequenze omologhe del genoma in esame mediante

tecniche di “amplificazione” degli acidi nucleici PCR

(polymerase chain reaction)

Permettono di individuare anche esigue quantità di acidi

nucleici Limulus test

Utilizzato per individuare minime quantità di

endotossina batterica (lipopolisaccaride dei batteri

Gram negativi) in liquidi organici quali liquido cefalo

rachidiano, plasma, siero, liquido articolare, urine.

Si basa sul principio che le proteine presenti nel lisato di amebociti (le sole

cellule circolanti) di Limulus polyphemus (artropode) hanno la capacità di

gelificare formando un “coagulo” in presenza di tracce anche minime di

LPS.

Tipi di indagine microbiologica

Metodi diretti:

• Osservazione microscopica

• Coltura su terreni idonei

• Isolamento della o delle specie sospette

• Esecuzione dei test di sensibilità agli antibiotici

Metodi indiretti:

• Indagini sierologiche tese ad identificare

anticorpi specifici circolanti

RILEVAZIONE DI ANTICORPI

• Reazione di fissazione del complemento

• Test immunoenzimatico

(ELISA=enzyme-linked immunosorbent

assay)

• Test di immunofluorescenza indiretta

(IFI)

REAZIONE DI FISSAZIONE DEL

COMPLEMENTO

Utilizzata per documentare la

presenza di anticorpi nel siero

– Siero del paziente viene

privato del

complemento (30’ a

56°C)

– Siero inattivato viene

cimentato con

l’antigene, in presenza di

complemento fresco di

cavia


PAGINE

167

PESO

6.31 MB

AUTORE

kalamaj

PUBBLICATO

+1 anno fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in medicina e chirurgia (a ciclo unico - 6 anni)
SSD:
Università: Foggia - Unifg
A.A.: 2012-2013

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher kalamaj di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Medicina di Laboratorio - Microbiologia Clinica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Foggia - Unifg o del prof Sarracino Annalisa.

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