Microbiologia clinica - Appunti

Cap1

Branche e scopi della microbiologia

La microbiologia è la scienza che studia i microorganismi, ossia le forme di vita invisibili ad occhio nudo. I microorganismi possono essere suddivisi in quattro gruppi sulla base di caratteristiche morfologiche e funzionali: batteri, miceti o funghi, alghe e protozoi. Si è così stabilita una differenziazione classificativa tra protisti inferiori procarioti e protisti superiori ovvero eucarioti. I virus di dimensioni tali da essere visibili solo al microscopio elettronico, sono privi di strutture necessarie alle funzioni vitali e dipendono per loro replicazione da cellule viventi che forniscono energia, molecole e strutture; la necessità di entrare in una cellula li rende parassiti obbligati.

Nonostante le cellule abbiano solo due diverse architetture (procarioti ed eucarioti), esse possono essere distinte in tre tipi fondamentali che corrispondono ai tre domini. Le cellule procariote sono divise in due domini: bacteria e archea poiché, pur avendo stessa organizzazione cellulare, presentano significative differenze strutturali. Il terzo dominio, eucarya, comprende tutte le cellule eucaristiche e quindi oltre ai gruppi microbici dei miceti, alghe e protozoi, anche le piante e gli animali.

Cap2

Procarioti ed eucarioti: forma, disposizione e dimensioni dei batteri

Tutti i protisti per definizione sono unicellulari. La suddivisione del regno dei protisti in procarioti ed eucarioti. Chiaramente il termine procariote è legato alla presenza di un nucleo sprovvisto di membrana, mentre il termine eucariota è dato dalla presenza di un nucleo provvisto di membrana. Le due hanno differenze importanti dal punto di vista strutturale e metabolico. Le diversità coinvolgono il nucleo, il citoplasma e la parete.

L’eucariote si assume materiale nutritizio attraverso la membrana e quindi di un trasporto di materiale aggregato e anche di piccoli microorganismi con un meccanismo distinto da quelli della permeabilità e semipermeabilità mentre gli eucarioti, l’assunzione avviene attraverso pori di natura proteica. Nei procarioti la riproduzione avviene di norma in via asessuata per fissione binaria o per formazione di spore, mentre gli eucarioti si riscontrano fenomeni di sessualità.

Procarioti

Presentano il materiale nucleare costituito da un unico cromosoma, sprovvisto di membrana e ne fanno parte i batteri, le alghe blu verdi e gli archaea.

Eucarioti

Pur essendo unicellulari, posseggono strutture e organelli ed organuli fondamentalmente riportabili a quelli delle cellule superiori: sono dotate di un nucleo con due o più cromosomi e presentano organelli (mitocondri, reticolo endoplasmatico, apparato del Golgi). Fanno parte di questa categoria:

• Alghe: in grado di produrre energia tramite processi fotosintetici, processi che hanno luogo nei cloroplasti, i quali contengono clorofilla e pigmenti tipici nei diversi gruppi. Posseggono una parete piuttosto spessa, costituita da cellulosa. Possono essere mobili od immobili. Possono attuare simbiosi con spugne e coralli. Non provocano malattie all’uomo. Le alghe agar sono spesso utilizzate in microbiologia per solidificare terreni di coltura e in campo alimentare.
• Protozoi: unicellulari, mobili con membrana flessibile, senza parete.
• Miceti e funghi: microrganismi che si presentano organizzati in aggregati multicellulari che tendono a differenziarsi.
• Licheni: si tratta di organismi simbiotici, originati da una simbiosi tra un fungo ed un’alga o un ciano batterio. Sono capaci di sopravvivere e di riprodursi in ambienti sfavorevoli. Vengono usati come rilevatori biologici; essi infatti possono essere considerati indicatori della qualità dell’aria essendo molto sensibili agli inquinamenti atmosferici.

Cap3

Struttura della cellula batterica: strutture obbligatorie e facoltative

I batteri sono organismi unicellulari e rappresentano organismi più piccoli in grado di auto duplicarsi. Le dimensioni della cellula batterica sono piuttosto ridotte (1 μ circa) anche se variano da specie a specie. La loro forma può variare: cocchi con forma sferica; bacilli con forma cilindrica; cocco bacilli sono forma variabile da tonda ad ovoidale ad allungata; vibrioni bastoncelli ricurvi che ricordano una virgola; spirilli ricurvi su più piani.

La cellula batterica è costituita da strutture obbligatorie e da strutture facoltative. Le strutture obbligatorie sono:

• Nucleoide: l’apparato nucleare costituito da un solo cromosoma chiuso ad anello, è formato da un DNA a doppia elica e non delimitato da membrana nucleare. La posizione del nucleoide nella cellula è centrale ma, non essendo legato al reticolo endoplasmatico, fluttua nel citoplasma e si sposta a seconda della fase di duplicazione.
• Citoplasma: presenti varie sostanze dal glicogeno, come materia di riserva; lipidi, il cui accumulo avviene in granuli avvolti in una membrana semplice; polisaccaridi; all’interno anche vere e proprie entità: ribosomi che, a causa dell’assenza del reticolo endoplasmatico, tendono ad addossarsi sulla membrana citoplasmatica perché a livello della stessa sono presenti tutti gli enzimi respiratori e le fonti energetiche; plasmidi sono frammenti di DNA extracomosomici, liberi nel citoplasma.
• Membrana citoplasmatica: ha la funzione di separare il materiale citoplasmatico dall’ambiente esterno. Simile alla membrana degli eucarioti, è fondamentalmente costitutiva da un doppio stato lipidico dello spessore di circa 75 Å nel quale sono immerse proteine aventi diverse funzioni. I lipidi presenti sulla membrana sono: fosfolipidici, aminoacidi e acidi grassi mentre le proteine possono attraversare l’intera membrana. Riassumendo le funzioni sono: ritenzione del contenuto, barriera osmotica, trasporto di metaboliti all’interno e all’esterno attraverso i pori, secrezione di sostanza chimiche e enzimi.
• Mesosomi: sono invaginazioni della membrana citoplasmatica, che assumono configurazioni diverse. Si ritrovano solo nei batteri gram positivi. Nei gram positivi è la membrana che forma dei prolungamenti, i mesosomi apportano direttamente energia al nucleotide. Nei batteri gram negativi il nucleotide è più grande e più rilasciato, quindi la distanza della membrana è minore. Rispetto alla membrana citoplasmatica, la struttura varia leggermente: sono meno ricchi di enzimi e le percentuali di proteine e fosfolipidi sono diverse. I mesosomi svolgono diversi ruoli: intervengono nelle fasi della replicazione, trasportano i due DNA nei poli opposti, intervengono sul dividersi della cellula con la formazione del setto trasverso, formazione delle spore.
• Parete cellulare: si trova a diretto contatto e circonda la membrana citoplasmatica. Un batterio privo di parete si parla di protoplasto (gram positivi) mentre sferoplasto (gram negativo) se rimangono parti della parete. Entrambi devono trovarsi in un ambiente isotonico per sopravvivere. Le funzioni sono: protezione meccanica, protezione chimica, conferimento della forma, trasporto, funzione immunitaria, funzione virulenza, responsabili della colorazione di gram.

Parete gram positivi è costituita da peptidoglicano, acido lipoteicoico e acido teicoico. Il peptidoglicano è altamente polare e fornisce quindi al batterio una spessa superficie idrofila. Il peptidoglicano è composto da lunghe catene di 2 aminozuccheri NAG e NAM. Il NAM è unito al NAG per mezzo di un legame 1-6 β glucosidico. Il NAM a sua volta è attaccato a 5 aminoacidi. Uno di questi è la lisina che a sua volta lega altri aminoacidi, diversi a seconda della specie batterica che a sua volta si lega a D-alanina. L’acido teicoico si trova spesso legati al peptidoglicano fino a costituire il 50% della parete, ma non sono indispensabili ai fini di rigidità. Sembra abbia una rilevata importanza dal punto di vista immunitario.

Parete gram negativi possiedono all’esterno dello strato peptidoglicano una membrana esterna ancorata stabilmente al peptidoglicano. La membrana esterna ha una struttura biochimica simile a quella citoplasmatica, quindi due foglietti lipoproteici, che forniscono ai batteri un’ulteriore barriera permeabile per numerosi composti caricati elettricamente, come antibiotici e altri farmaci. Le strutture contenenti nella membrana esterna sono: la lipoproteina, le porine e il lipopolisaccaride. Lipoproteina ha la funzione di collegare la ME al peptidoglicano. Porine sono dei complessi proteici che funzionano come canali preferenziali per il passaggio di piccole molecole cariche elettricamente. Lipopolisaccaride è situato nel foglietto esterno della ME e rappresenta l’antigene O e contiene una porzione tossica ovvero il lipide A che ha funzione di endotossina. LPS è costituito da 3 porzioni principali: la parte più esterna costituita dal antigene O che si tratta di un polisaccaride complesso, costituito da zuccheri semplici riuniti a pacchetti e ripetuti N-volte; la parte intermedia risiede il core e nella parte più interna il lipide A che è completamente integrato con la ME ed è costituito da acidi grassi a 12-18 atomi di C.

Le strutture facoltative sono le seguenti:

• Capsula: la composizione chimica cambia da specie a specie perlopiù si tratta di polisaccaridi semplici. Nell’ambiente vegetali la capsula è fatta di cellulosa. La capsula rappresenta un fattore di virulenza ovvero possono provocare malattie.
• Glicocalice: questa formazione è in grado di aderire tenacemente a cellule e anche a strutture inanimate. Questi batteri sono in grado di costruire glicocalice rappresentano un grande problema: formano un biofilm tenace e impermeabile dai farmaci e spesso si deve ricorrere alla rimozione delle strutture animate.
• Flagelli e ciglia: la loro lunghezza è di circa 20 micron. Il flagello è costituito da flagellina. Ha origine citoplasmatica: i monomeri vengono costruiti dall’interno verso l’esterno e le flagellino sono diverse da specie a specie. Esso è formato da 3 parti: il filamento che protrude all’esterno della cellula; l’uncino che connette il filamento al corpo basale; il corpo basale che è una struttura complessa, differente nei due gram che si trova nel citoplasma ancorata alla membrana citoplasmatica ed alla parete. Nella parete gram + c’è un sistema a doppio disco e nei gram – invece vi sono due doppi dischi. L’ATP crea un modo oscillatorio nel punto di partenza del flagello, il moto si ripercuote sul doppio disco della parete.
• Pili: non conferiscono mobilità, si tratta di strutture tipiche dei gram -, di origine non citoplasmatica ma di natura proteica e costituite dalla pilina e permettono al batterio di aderire alle cellule. Alcuni pili sono di tipo F ovvero cavi al proprio interno e permettono una volta che si sono uniti due batteri, il trasferimento genico da una cellula all’altra: in pratica funge da ponte per il passaggio del DNA e consente il fenomeno della coniugazione batterica.
• Fimbrie: le appendici filamentose presenti sulla superficie batterica, più esili dei pili e mai cave; la loro lunghezza non supera 5-6 micron ed il loro diametro è ridotto. Hanno un ruolo fondamentale nel fenomeno dell’aderenza in quanto presentano un contenuto di adesine nettamente superiore a quello dei pili e si trovano quasi esclusivamente nei gram -.

Differenza tra gram+ e gram- consiste nella colorazione che possono assumere. La diversa colorazione discrimina due diverse capacità: una di trattenere il colorante (gram +), l’altra di perdere questo colorante (gram-). Hanno caratteristiche diverse e hanno diverse reazioni agli antibiotici.

Cap4

Principali vie metaboliche, biosintesi delle strutture peculiari batteriche

Inteso come insieme di tutti processi svolti dalla cellula è, in questo senso, comprensivo tanto del catabolismo, ovvero le reazioni di degradazione di molecole complesse molecole più semplice con il rilascio di energia, quanto nell'anabolismo, ovvero le reazioni di sintesi di molecole più complesse partire da composti semplici con consumo di energia. La cellula, dunque, attraverso i processi analcolici sovrintende alla crescita, alla replicazione e alla riparazione delle strutture cellulari; attraverso il catabolismo si fornisce dell'energia necessaria per lo svolgimento dei processi vitali.

Nei sistemi biologici la produzione di energia è strettamente legata alla reazione di ossido-riduzione, reazioni che coinvolgono elettroni forniti da un donatore e ricevuti da un accertatore. Chimicamente un'ossidazione viene definita come la rimozione di uno o più elettroni provenienti da una sostanza, mentre una riduzione viene definita come l'aggiunta di uno o più elettroni ad una sostanza. L'energia rilasciata come risultato delle reazioni Redox deve essere immagazzinata conservata per poter poi essere utilizzata per le funzioni cellulari. Questo avviene attraverso la formazione di legami fosfato. Il più importante composto di fosfato rappresentato dal ATP. Siano riconosciuti due meccanismi destinati alla conservazione dell'energia: la respirazione e la fermentazione. I due sistemi differiscono nel meccanismo in base al quale l’ATP viene sintetizzato in termini di reazioni Redox: la respirazione cellulare sono presenti l'ossigeno molecolare o un altro accettore di elettroni esterno come accettatore terminale. La respirazione può, a seconda delle condizioni ambientali, essere aerobica o anaerobica.

Nella fermentazione il processo redox avviene in assenza di accettatori terminali di elettroni utilizzabili ma l'ossidazione viene accoppiata alla riduzione di un composto generato dal substrato. La respirazione aerobica per ogni molecola di glucosio, dall'insieme di reazioni dalla bruco lisi, formazione di acetil-CoA e il ciclo di krebs si ha una resa energetica di 38 molecole di ATP. Nella respirazione anaerobica la resa energetica è notevolmente più bassa rispetto alla respirazione aerobica, ai tempi di realizzazione sono raddoppiati. Nella fermentazione l’ATP è prodotto mediante un processo detto bruco lisi ovvero un insieme di reazioni dove una molecola di glucosio viene scissa in due molecole di acido piruvico con una resa di due molecole di ATP. In termini di resa energetica e processi fermentativi, rispetto ai respiratori, sono meno redditizi: partendo da una molecola di glucosio, sia alla produzione finale di 2 ATP contro i 38 della respirazione aerobica. Riassumendo nella fermentazione si parte da una molecola di glucosio che viene ridotta a glucolisi e a sua volta diventa acido piruvico. Nella fotosintesi invece è un processo tipico del mondo vegetale nel quale si realizza la conversione dell'energia luminosa in energia chimica utilizzata poi per la riduzione di CO₂. L'energia luminosa è catturata grazie la presenza di pigmenti organizzati in fotosistemi.

Cap17

Esigenze nutrizionali, coltivazione dei microrganismi: aerobi, anaerobi, eterotrofi ed autotrofi

Per crescere, un organismo ha bisogno di tutti gli elementi utili per la biosintesi materiale organico e di ioni organici fondamentali come componenti cellulari e come attivatori enzimatici. I microrganismi differiscono tra loro per la grande varietà di esigenze nutrizionali di fonti di energia metaboliche. I tre principali meccanismi attraverso i quali viene generata l'energia metabolica sono: la fermentazione, la respirazione e la fotosintesi.

Nutrizione: gli organismi autotrofi, come le piante, sfruttano la luce solare come fonte di energia e l'anidride carbonica come sorgente di carbonio. Questi organismi non richiedono composti organici per poter crescere. Gli eterotrofi necessitano di carbonio organico assimilabile per la crescita alla sintesi dei loro cambiamenti. L'azoto invece può essere fornita sotto diverse forme ed i microrganismi hanno una diversa capacità di seminarlo. L'azoto può essere trovata in natura in forma organica e inorganica. Lo zolfo è richiesto dai microrganismi in quanto ha un ruolo strutturale. Numerosi minerali sono richiesti dalla funzione degli enzimi. Fornendo alle sostanze nutritive, molti microrganismi possono sintetizzare tutti costituenti delle macromolecole: purine, pirimidine, aminoacidi, pentosi e altri monosaccaridi, acidi grassi.

Terreni di coltura, fattori fisici

Terreni di coltura: i terreni di coltura possono essere definiti con mezzi artificiali sterili contenenti la giusta concentrazione di tutti gli elementi nutritivi per la crescita batterica, oltre ad un adeguato grado di umidità ed un corretto Ph. I terreni di coltura per i batteri, possono essere suddivisi in base differenti criteri.

• In base allo stato fisico: terreni liquidi che hanno una consistenza liquida. I terreni liquidi sono adatti a microrganismi anaerobi o aerobici facoltativi e gli aerobici obbligati, sebbene questi richiedono che il substrato sia in recipiente poco profondi, che si è agitato o che sia fornito di aria; terreni solidi i substrati liquidi possono essere resi solidi o semi-solidi per l'aggiunta di gelatina Agar e gellano.
• In base alla costituzione chimica: nei terreni minimi elementi essenziali sono aggiunti come sali inorganici in concentrazione nota; in questi terreni possono moltiplicarsi soli batteri chemioautotrofi. I terreni complessi: substrati contenenti varie sostanze naturali che unicamente non ben definita il quali derivano dai tradizionali brodi batteriologici con il vantaggio del minor costo di allestimento di una maggiore rispondenza, in genere, alle necessità dei batteri patogeni al momento dell'isolamento in coltura.
• In base alle funzioni: terreni selettivi: adatti alla moltiplicazione di una determinata specie batterica o di un numero ristretto di microorganismi, favorendo la crescita di altri. Terreni di arricchimento: sono anche essi terreni selettivi liquidi. La presenza di particolari sostanze o di particolari condizioni fisiche favoriscono la crescita di batteri più esigenti dal punto di vista nutrizionale, mentre allunga la fase di latenza delle specie competitive. Terreni differenziali: contengono particolari indicatori che...