Microbiologia

Microbiologia

Introduzione

La microbiologia è quella branca della biologia deputata allo studio dei microrganismi. I microrganismi sono organismi unicellulari; in particolare durante il corso ci occuperemo di batteri, protozoi (alghe) e miceti (funghi e muffe). La microbiologia, dalla recente scoperta dei virus, si occupa anche dello studio di questi ultimi, nonostante essi siano parassiti endocellulari e non propriamente cellule: sono molecole non dotate di vita, incapaci di riprodursi se non dopo aver infettato un’altra cellula.

Lo studio del funzionamento e dei meccanismi di riproduzione del mondo microbico è utile sotto diversi punti di vista; cura di malattie (microbiologia medica), utilizzi alimentari, risanamento dell’ambiente, biotecnologie (es. insulina, vaccini), bioterrorismo sono alcuni esempi di utilizzo dei microrganismi.

L’insulina rappresenta un farmaco che deriva da una modificazione genetica (OGM): è stato introdotto nei batteri il gene dell’insulina umana, per aumentarne la produzione. Si parla di insulina ricombinante. Questo discorso vale anche per i vaccini come quello contro l’epatite B e il papilloma virus; vengono prodotti dei batteri all’interno dei quali viene aggiunto il gene di una proteina virale: il sistema immunitario riconosce la proteina che viene iniettata con il vaccino e nel caso venga infettato da un virus, riesce a difendersi.

La cellula è un organismo vivente, il più semplice in assoluto, che trae nutrimento dall’ambiente in cui si trova, ambiente in cui rilascia sostanze di scarto. Se l’ambiente è favorevole si può replicare e, nel corso del tempo, può andare incontro a meccanismi evolutivi in grado di avvantaggiarla nella sopravvivenza. Alcune cellule hanno la capacità di spostarsi, di dare origine a diverse strutture cellulari (ad es. spore) e di comunicare tra di loro in modo da adeguarsi agli stimoli e alle variazioni dell’ambiente esterno.

Le comunità microbiche, che consistono nell’insieme di microrganismi, sono ovunque e interagiscono con tutti gli ecosistemi. L’87% dei microrganismi conosciuti è benefico o almeno innocuo per l’uomo. I microrganismi opportunisti (10% del totale) normalmente non danno particolari problemi all’individuo sano, risiedono in stato di latenza; certi disturbi possono però portare i microrganismi opportunisti a recare danno all’uomo. Solo il 3% dei microrganismi conosciuti sono patogeni: contraendo questi microrganismi si manifesterà la patologia.

Radici storiche

Negli ultimi cento anni i progressi nel campo della microbiologia sono stati enormi ma la sua nascita può essere fatta risalire alla fine del 1600 con l’invenzione del primo microscopio da parte di Robert Hooke. Verso la fine del secolo Antonie van Leeuwenhoek osserva così i primi animacula e inizia a classificare questi microrganismi. È alla fine dell’ottocento però che si inizia a comprendere come i microrganismi funzionano e, di conseguenza, come possono essere combattuti.

Edward Jenner nota, durante un’epidemia di vaiolo, che le mungitrici che avevano contratto il vaiolo bovino non erano soggette a vaiolo umano: iniettò del vaiolo bovino in un bambino di otto anni e osservò che non contraeva vaiolo umano.

Sara Mazzone

Fu però Pasteur a comprendere appieno il principio alla base dell’evento osservato da Jenner; Pasteur inventò il vaccino dell’antrace, del colera e della rabbia rendendo inattivi i bacilli dei vaccini e iniettandoli negli esseri umani. Inoltre egli inventò il processo di pastorizzazione, che consiste nello scaldare ad esempio il vino per uccidere i microrganismi e fermare la fermentazione, impedendo così al vino di acidificarsi.

Robert Koch fu lo scienziato che scoprì che ad un determinato batterio è riconducibile una particolare patologia (teoria germinativa); coltivò e osservò campioni di materiale prelevato da soggetti malati e da soggetti sani e si rese conto che l’agente patogeno era presente solo nel campione dei soggetti malati. Inoculando le colonie batteriche coltivate in laboratorio nel corpo di un animale sano fu quindi possibile osservare lo sviluppo della patologia anche nel soggetto sano.

Koch formulò quattro postulati:

• Il presunto agente responsabile della malattia in esame deve essere presente in tutti i casi riscontrati di quella malattia, ma deve essere assente nelle persone sane.
• Deve essere possibile isolare il microrganismo dall'ospite malato e farlo crescere in coltura pura.
• Ogni volta che una coltura pura del microrganismo viene iniettata in un ospite sano, si riproduce la malattia.
• Il microrganismo deve poter essere isolato nuovamente dall'ospite infettato sperimentalmente (il microrganismo presente nell’animale ora infetto deve essere uguale a quello precedentemente malato).

Koch introdusse il concetto di coltura pura, realizzato attraverso le piastre di Petri; esse possiedono dei fattori nutritivi che permettono la proliferazione dei batteri e la formazione delle colonie. Per queste scoperte, egli nel 1905 vinse il premio Nobel.

Gli organismi viventi sono divisibili in cinque gruppi: batteri, protisti, funghi, piante e animali. Recentemente una nuova tassonomia basata sull’analisi delle sequenze di RNA divide gli organismi viventi in tre gruppi fondamentali: batteri, archaea e eukarya. I microrganismi sono sia eucarioti che procarioti. I microrganismi eucarioti sono le alghe, i protozoi e i miceti. I microrganismi procarioti sono i batteri.

Vi sono numerose differenze tra cellula eucariota e cellula procariote: la cellula procariota non ha né nucleo né membrana nucleare; non ha gli organelli caratteristici della cellula eucariota (ribosomi, mitocondri, reticolo endoplasmatico, apparato di Golgi); il DNA si trova libero nel citoplasma, in una struttura detta nucleoide, ed è molto più piccolo rispetto a quello della cellula eucariota. I ribosomi sono diversi rispetto a quelli della cellula eucariota, sia come dimensioni (tra 10^-6 e 10^-8) che come indice di sedimentazione; la membrana cellulare, pur essendo simile, non presenta steroli nel caso della cellula procariota.

I batteri sono diversi tra loro. In base alla morfologia possono essere suddivisi in cocchi (circolari), bacilli o bastoncelli (cilindrica, più allungata), coccobacilli, virioni (ricurvi), spirilli (ondulati), spirochete (elicoidali, arrotolati su se stessi). In alcuni i casi i batteri possono essere presenti da soli (raramente), uniti in coppie (diplococchi) o aggregati in lunghe catene (streptococchi), nel caso in cui la divisione tra i vari batteri non sia stata completa. Se invece la ripartizione avviene su assi diversi i batteri possono formare tetradi dalle cui divisioni si formeranno grappoli come quelli distintivi delle colonie di stafilococchi. Anche i bacilli sono rinvenibili singolarmente o sotto forma di diplobacilli o di catenelle di bacilli.

Sara Mazzone

I batteri possono anche essere divisi in base all’aspetto assunto dalle loro colonie una volta coltivati sulle lastre di Petri: puntiformi, circolari, filamentose o di diversi colori.

Strutture batteriche

Le strutture batteriche si dividono in:

• Strutture essenziali: presenti in tutti i batteri e fondamentali per vivere. Essi sono: il nucleoide, i ribosomi, la membrana citoplasmatica, il lisosoma e la parete.
• Strutture accessorie: sono presenti solo in alcuni batteri. Essi sono: capsula, pile, fimbrie e ciglia (usati per il movimento o per l’adesione a particolari cellule) e plasmidi (piccoli DNA circolari attraverso i quali i batteri scambiano le informazioni).

Citoplasma: costituito prevalentemente da acqua, contiene proteine e sostanze nutrienti utili alla sopravvivenza della cellula. È la sede di tutti i processi biosintetici.

Nucleoide: è il materiale genetico batterico, costituito da un’unica molecola di DNA, circolare e a doppia elica; si trova disperso nel citoplasma (non è contenuto in un nucleo e quindi non sono presenti né nucleoli né membrana nucleare).

Plasmidi: sono strutture accessorie; alcuni batteri presentano del DNA extracromosomiale: non è il vero DNA batterico, ma è un DNA circolare di ridotte dimensioni che codifica pochissimi geni e può essere trasmesso da un batterio all’altro. Si replicano autonomamente e conferiscono caratteristiche aggiuntive ai batteri. I plasmidi sono un elemento caratteristico dei batteri essendo il mezzo attraverso il quale i batteri si scambiano i geni che ne aumentano la sopravvivenza (es. fattori di resistenza agli antibiotici).

Ribosomi: servono per la traduzione delle proteine, ovvero della traduzione dell’RNA messaggero. Sono diversi da quelli presenti nelle cellule eucariote e sono detti 70S (sedimentano a una velocità di 70 Svedberg); sono composti da due subunità, una 30S e una 50S, che si complessano nel momento in cui deve avvenire la traduzione dell’RNA. È bene ricordare che i ribosomi batterici differiscono da quelli delle cellule eucariotiche perché ciò permette di usarli come target di alcuni farmaci, che sono in grado di inibirli (inibendo così la replicazione batterica) senza inibire la funzionalità della cellula eucariotica. I ribosomi servono per la sintesi delle proteine e sono formati da due subunità che nel momento della sintesi si legano e permettono la traduzione.

Membrana citoplasmatica: simile a quella eucariotica, è formata da un doppio strato di fosfolipidi con le teste idrofile rivolte verso l’esterno e le code idrofobiche rivolte verso l’interno. La grossa differenza tra la membrana citoplasmatica batterica e quella eucariota è l’assenza di steroli, in quanto i batteri non sono in grado di sintetizzarli. Presenta proteine periferiche, proteine integrali di membrana e glicoproteine; le proteine transmembrana permettono il trasporto di ioni e nutrienti come nelle cellule eucariote: si può avere un trasporto semplice caratterizzato dal solo passaggio di ioni, oppure attraverso una modificazione della sostanza trasportata oppure ancora un trasporto permesso dal dispendio di ATP. Il trasporto può essere sia unidirezionale che bidirezionale. La membrana citoplasmatica è cruciale per la conservazione dell’energia; permette infatti la conservazione della differenza di potenziale, all’origine della forza motrice. Una caratteristica propria della membrana citoplasmatica della cellula procariote è la presenza di mesosomi, invaginazioni che “mimano” la funzione respiratoria che nelle cellule eucariote avviene nei mitocondri.

Mesosomi: invaginazioni della membrana citoplasmatica che hanno le stesse funzioni dei mitocondri nelle cellule eucarioti.

Parete cellulare: è una delle strutture più caratteristiche della cellula batterica, a cui conferisce forma e rigidità; impedisce la lisi osmotica. Si trova soprattutto nei procarioti e in alcuni eucarioti (ad es. i funghi). Oltre a dare forma al batterio e alla cellula, protegge da agenti esterni e permette la resistenza alla pressione osmotica. Esternamente è costituita da una molecola, il peptidoglicano, composta da zuccheri (N-acetilglucosamina e acido N-acetilmuramico) e peptidi.

Batteri Gram positivi e Gram negativi

A seconda delle caratteristiche della parete cellulare, i batteri si dividono in Gram positivi e Gram negativi.

Gram positivi

Presentano una struttura molto compatta, infatti hanno uno spesso strato di peptidoglicano, mentre i secondi sono caratterizzati da lacune nella parete, possiedono un sottile strato di peptidoglicano e hanno una struttura detta membrana.

Il peptidoglicano è una struttura formata da due zuccheri: N-acetilglucosamina e acido N-acetilmuramico. Essi si legano formando lunghe strutture lineari che a loro volta sono legate tra loro da legami peptidici, ossia da proteine; si forma così una struttura molto rigida.

Il legame peptidico che unisce le palizzate di N-acetilglucosamina e di acido N-acetilmuramico è detto legame di transpeptidazione e avviene a carico dell’enzima transpeptidasi. Le penicilline agiscono sul legame di transpeptidazione, lisandolo, allo scopo di demolire i batteri e renderne impossibile la replicazione. La parete batterica si trova esternamente rispetto alla membrana citoplasmatica.

La parete dei Gram+ è costituita esternamente da molti strati di peptidoglicano, che le conferisce la forma; è quindi una parete spessa e compatta su cui si trovano proteine, che possono essere semplicemente associate alla superficie esterna (acidi teicoici) oppure attraversarla da parte a parte (acidi lipoteicoici). Gli acidi teicoici hanno la funzione di attrarre cationi e possono fungere da antigeni di superficie; gli acidi lipoteicoici, invece, ancorano la parete cellulare alla membrana citoplasmatica.

Gram negativi

I batteri Gram- presentano una struttura completamente differente; nonostante vi sia comunque uno strato di peptidoglicano, questo è molto più sottile rispetto a quello dei Gram+ ed è separato dall’ambiente esterno da una struttura (comunque facente parte della parete cellulare) detta membrana esterna.

Nel caso dei Gram- la parete non è ancorata alla membrana citoplasmatica da proteine; vi sono infatti degli spazi tra la membrana citoplasmatica e lo strato di peptidoglicano e tra quest’ultimo e la membrana esterna. Tali spazi rispondono al nome di periplasma (spazio periplasmico); questo è presente sia sopra che sotto il peptidoglicano per separarlo dalla membrana citoplasmatica e da quella esterna. La membrana esterna è costituita da un doppio foglietto (come quello fosfolipidico) che presenta uno strato di fosfolipidi rivolto verso l’interno e uno di lipopolisaccaridi (struttura caratteristica ed esclusiva dei Gram-) rivolto verso l’esterno. La membrana esterna presenta anche proteine che permettono il passaggio di nutrienti tra la cellula e l’esterno.

Il lipopolisaccaride può essere diviso in tre zone fondamentali:

• Lipide A: forma lo strato del foglietto fosfolipidico della membrana esterna; è la parte tossica del lipopolisaccaride, quella che conferisce al polisaccaride la funzione di endotossina: nell’organismo umano dà sintomi generalizzati di malessere quali febbre e brividi.
• Core polisaccaridico: uguale in tutti i Gram-.
• Polisaccaride O specifico: verso l’esterno (formato da zuccheri come il core). È diverso per ogni lipopolisaccaride.

Sara Mazzone

La caratteristica fondamentale che distingue i Gram+ dai Gram-, oltre alla parete cellulare, è che i Gram+ sono alcol-resistenti (resistenti all’azione dell’alcol). I batteri Gram+ e Gram- (tra cui va annoverata l’Escherichia Coli) sono riconoscibili attraverso la colorazione di Gram; è una colorazione differenziale in quanto differenzia due famiglie di batteri diversi usando coloranti diversi.

Sia i Gram+ che i Gram- sono sensibili al colorante cristal violetto che viene fissato usando una soluzione detta mordente; la soluzione di decolorazione (solitamente un alcool) usata successivamente farà perdere colore ai Gram- e lascerà intatta la colorazione dei Gram+ perché lo spessissimo strato di peptidoglicano impedisce l’ingresso dell’etanolo (alcol) nel batterio. I Gram- vengono poi colorati di rosa utilizzando il colorante safranina (mentre i Gram+ rimarranno violetti perché sono resistenti all’alcol, non lo fanno entrare e non permettono quindi all’alcol di togliere il colore).

Oltre ai Gram+ e ai Gram- esistono batteri che non presentano la parete cellulare. Sono conosciuti come micobatteri, sono una piccola parte dell’insieme dei batteri e rappresentano, ad esempio, l’agente eziologico della tubercolosi. Hanno uno spesso involucro esterno composto non da peptidoglicano ma soprattutto da cere, da acidi micolici glicolipidi e da glicoproteine. Essendo la membrana molto spessa, il passaggio dei nutrienti avviene in maniera difficoltosa, rendendo lo sviluppo di questi batteri particolarmente lento. Non potendo essere clusterizzati sfruttando il peptidoglicano, assente in questo caso, i micobatteri vengono sottoposti ad una diversa colorazione, detta di Ziehl Neelsen. La caratteristica sfruttata è l’acidoresistenza dell’involucro esterno dei micobatteri, conferita dalla presenza di cere. Sono batteri difficilmente colorabili e vanno trattati a caldo, per sciogliere le cere, prima di essere colorati. Vengono poi colorati di rosa usando la fucsina e in seguito il colore viene disciolto con acido solforico; gli unici batteri a rimanere colorati saranno i micobatteri per via della resistenza all’acido.

Flagelli

Le flagelli sono strutture accessorie deputate alla locomozione; sono filamenti che si distaccano dalla parete batterica e sono anche sensori dell’ambiente esterno: grazie ai flagelli i batteri rilevano il posizionamento delle sostanze nutritive e si dirigono velocemente verso di esse. I flagelli variano a seconda della specie batterica. Batteri con un solo flagello sono detti monotrichi, batteri con un flagello per estremità sono detti anfitrichi, batteri con un gruppo di flagelli localizzati in un punto sono detti lofotrichi, batteri con flagelli presenti su tutta la superficie sono detti peritrichi.

Il flagello si inserisce all’interno della membrana plasmatica e alla membrana cellulare tramite proteine. La struttura basale (conferisce la funzione motrice) del flagello è inserita all’interno della parete batterica e della membrana citoplasmatica; i flagelli sono formati da una struttura ad uncino e da un lungo filamento, detto appunto flagello. Il flagello è composto da molte molecole di flagellino, che costituiscono la struttura flagellare. A seconda della disposizione dei flagelli (che girano su se stessi), il movimento dei batteri varia: i peritrichi orientano i flagelli nella direzione opposta al posizionamento dei nutrienti e si muovono in linea retta e più lentamente rispetto agli altri; i batteri polari (con i flagelli localizzati in alcuni punti) invece si muovono più velocemente e a scatti.