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Microbiologia - brucella

Appunti di Microbiologia del professor Galdiero sulla brucella: coccobacilli gram negativi, aerobi obbligati, distinzione tra le salmonella e le brucelle, le specie, i fattori di patogenicità, i recettori di superficie, catalasi, l’acidificazione del fagosoma.

Esame di Microbiologia docente Prof. M. Galdiero

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essere sia improvviso perchè si può avere all’improvviso linfoadenopatia localizzata a poche stazioni

linfonodali, ma può essere anche (come nella maggior parte dei casi) subdolo e graduale perchè i

sintomi compaiono in un numero di giorni che appunto può andare da 5 a 30 giorni. E nella maggior

parte dei casi la diagnosi non viene effettuata subito. La diagnosi clinica viene effettuata subito, ma la

diagnosi di laboratorio è lunga, soprattutto quella relativa alla coltivazione. Quando la brucellosi viene

diagnosticata dopo 20-30 giorni potremo anche essere di fronte a quelle che viene definita brucellosi

focale, ovvero un’infezione non più limitata alla presenza di brucelle nel sangue ma un’infezione che

può aver colpito diversi distretti anatomici e in particolare quelli che più frequentemente vengono colpiti

sono osteo-articolare, genito-urinario e nervoso. La risposta immunitaria dell’ospite ovviamente, quando

si parla di risposta immunitaria naturale legata all’attivazione dei fagociti mononucleati, ma all’interno

di questi le brucelle riescono a sopravvivere, all’attivazione delle cellule NK e comunque alla risposta

infiammatoria in senso generico, dove per risposta infiammatoria, dove per risposta infiammatoria noi

intendiamo il rilascio di molecole quali citochine, tra cui il TNF, l’interferone che formano il network

della risposta immunitaria, in maniera tale che il messaggio venga riportate a quelle cellule quali

linfociti che saranno responsabili della risposta immunitaria specifica. Però inizialmente la risposta

naturale è poco efficace perché abbiamo detto che in realtà le brucelle riescono a sopravvivere

all’interno dei fagociti, e allora quello che è difficile da fare è proprio la diagnosi di laboratorio che in

questo caso più che nelle altre infezioni non può prescindere dall’anamnesi e dall’esame clinico

soprattutto dall’anamnesi cioè da eventuali categorie a rischio, quindi i lavoratori a rischio, dal sapere se

il paziente ha effettuato viaggi in zone endemiche e dall’ingestione di alimenti che non erano stati ben

pastorizzati. L’esame clinico nelle prime fasi è sempre relativo a questa febbre caratteristica con questi

malesseri generalizzati (la campania non è una zona endemica, i capi animali infetti vengono soppressi).

La diagnosi di laboratorio può essere diretta e indiretta. La diagnosi diretta ci permette di diagnosticare

direttamente l’infezione isolando il batterio e dire qual è l’eziologia dell’infezione.

La diagnosi indiretta invece ci permette di andare a diagnosticare indirettamente l’eziologia, quindi noi

non isoliamo direttamente dal paziente il batterio, ma andiamo a rilevare la presenza di anticorpi nel

serio dell’ospite diretti contro il batterio, andando a studiare quali anticorpi ritroviamo nel siero del

paziente (per esempio se troviamo IgM o IgG) possiamo anche capire se l’infezione è recente

(troveremo solo IgM) o meno (troveremo solo IgG). Per la diagnosi di laboratorio abbiamo quindi

quella diretta ovvero la ricerca del batterio che deve avvenire nella fase setticemica (ed è importante

diagnosticarla subito) attraverso il campione di sangue, ma poiché successivamente i fagociti s spostano

nei linfonodi e nel midollo osseo e contemporaneamente a un prelievo di sangue si può procedere a un

prelievo del midollo (ma questo solo nella fase cronica, alla quale ovviamente dobbiamo cercare di non

arrivare). Nella fase setticemica viene ricercata nel sangue attraverso un esame colturale del sangue che

viene detto emocoltura. Ovviamente vi è un terreno particolare che è bifasico che è detto terreno di

Castaneda. E’ bifasico perchè voi conoscete o terreni solidi o terreni liquidi, questo ha una fase

agarizzata nella parte bassa, e nella parte più alta vi è questa fase liquida quindi è una agar verticale

immerso in terreno liquido (TS). Allora viene effettuato il prelievo di sangue ovviamente disinfettando

il flacone dove il sangue deve essere conservato. Nei neonati vengono prelevati 1-3 ml, nei bambini da 5

a 10ml, negli adulti fino a 10 ml. Il sangue prelevato viene messo in questi terreni e viene portato in

laboratorio. Può essere conservato per 2 ore a temperatura ambiente o a 4° e portato in laboratorio dove

può essere analizzato fino a un massimo di 24 ore. Dovrebbe essere prelevato durante l’attacco febbrile

e più volte nell’arco della giornata. Perchè quando la temperatura aumenta troviamo molti batteri.

Possibilmente anche un’ora prima dell’attacco febbrile, e questo può avvenire solo dopo aver controllato

il paziente per un giorno ed è diventato possibile prevedere l’attacco. E’ un terreno TS che viene

incubato in presenza del 10% di anidride carbonica perchè è vero che le brucelle sono aerobi obbligate

ma abbiamo detto che la B. Abortus è un microaerofilo e che quindi richiede la presenza del 5-10% di

anidride carbonica, allora per essere certi che nel prelievo eventualmente andremo a far crescere anche

la B.Abortus, effettuiamo il prelievo in presenza del 5-10% di anidride carbonica. Ed osserviamo questo

prelievo ogni 4-5giorni fino a 30 giorni (perchè l’incubazione può essere da 5 a 30 giorni). Se vi è

intorbidamento, che indica moltiplicazione batterica (se il prelievo è stato effettuato correttamente senza

contaminazione), poi può essere effettuata una subcultura su terreno solido per capire di quale batterio s

tratta perchè le identificazioni morfologiche e biochimiche devono essere effettuate su colonie, quindi

su terreno solido. I terreni solidi che vengono utilizzati maggiormente sono: il terreno agar cioccolato,

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oppure il terreno TSA (Tripticase say agar) che viene addizionato di siero al 5% e di antibiotici e/o

coloranti batteriostatici che hanno la funzione di inibire la crescita di altri microrganismi così da operare

su colonie pure. Per le brucelle più esigenti questo terreno viene addizionato di sostanze nutritive come

per esempio amminoacidi e di fattori di accrescimento quali Mg, tiamina (vitamina B9, niacina, biotina).

Questi terreni solitamente tra i coloranti batteriostatici contengono in particolare il cristalvioletto perchè

inibisce i microrganismi gram positivi e gram negativi più esigenti. Su questi terreni la brucella appare

con delle colonie caratteristiche lisce, rotondeggianti e bluastre (per la presenza di cristalvioletto) perchè

avete studiato che esistono due forme, la fase S e la fase R. La fase S è quella in cui il batterio è più

virulento. Il passaggio dalla fase S a quella R prevede la perdita di un qualche componente di superficie.

In questo caso è una parte dell’antigene O del lipopolisaccaride. La colonia quindi appare ridotta.

Comunque tutte le brucelle che voi trovate in vivo, se virulente, appaiono con colonie lisce, ovviamente

se siete di fronte a colonie di aspetto rugoso, potete capire che si tratta di ceppi modificati di brucella, di

ceppi meno virulenti. Lo sviluppo di brucelle sui terreni solidi ci permetterà di identificare le

caratteristiche morfologiche delle brucelle perchè da un semplice vetrino di gram capiremo che si tratta

di coccobacilli gram negativi, ma ci permetterà di andare a studiare alcune caratteristiche biochimiche

come la capacità che hanno di idrolizzare l’urea, la capacità che hanno alcune di queste brucelle di

produrre idrogeno solforato e la capacità che hanno di resistere ai coloranti, che permetteranno insieme

a delle prove di agglutinazione con sieri specifici di andare a stabilire e identificare i vari biovar. I criteri

che permettono la differenziazione fenotipica delle brucelle sono lo studio della morfologia delle

colonie, che appaiono lisce quando si tratta di B.Melitensis, Abortis e Suis (responsabili delle infezioni

nell’uomo) e rugose in B.Canis e B.Suis perchè infatti sono meno virulente. Sulle colonie possiamo

effettuare la prova biochimica delle ossidasi perchè abbiamo detto che sono aerobi obbligati e hanno il

citocromo c, possiamo effettuare il test dell’ureasi, possiamo analizzare la capacità di produrre idrogeno

solforato così possiamo distinguere se l’infezione è da Melitensis, Abortus o Suis e in particolare le

prove che maggiormente vengono utilizzate sono quelle che riguardano la capacità di crescere in

presenza di coloranti quali la tionina, il verde malachite e la fucsina basica. Il test di resistenza ai

coloranti può essere effettuato diluendo direttamente i coloranti nell’agar, nella piastra di agar che noi

prepariamo. Per esempio, qui vedete a sinistra una piastra in cui è stata aggiunta fucsina, a destra invece

c’è una piastra in cui è stata aggiunta tionina. Parallelamente seminiamo i vari campioni che abbiamo a

disposizione, ovvero le colonie che abbiamo ottenuto precedentemente su questo terreno specifico, su

TSA o sull’agar brucella. Per esempio, in questo caso, delle varie colonie che abbiamo seminato

soltanto questa (indica sulla diaposita) è riuscita a sopravvivere in presenza di fucsina e tionina. Quindi

andando a riguardare la tabella, l’unica specie appartenente al genere brucella che sopravvive a fucsina e

tiroxina (infettiva per l’uomo) è la B.Melitensis. Per quanto riguarda le altre, la B. Suis non cresce su

fucsina ma cresce su tionina, la B.Abortus il contrario. Quindi la colonia che noi avevamo isolato

facendo l’emocoltura sul paziente è sicuramente di B.Melitensis. Oltre alla diluizione, la prova può

essere effettuata anche usando delle striscette imbevute di colorante e messe direttamente sopra l’agar.

In questo caso, per esempio, abbiamo utilizzato 2 striscette, quella a sinistra impregnata di tionina,

quella a destra, di fucsina, quindi la subcultura che partiva dall’emocoltura che noi abbiamo effettuato

qua sopra ci ha mostrato delle colonie che erano capaci ancora di crescere in presenza di tionina ma

venivano inibite dalla fucsina, e allora questa era sicuramente la B.Suis. Ovviamente la tipizzazione dei

biovar può essere fatta o con queste prove biochimiche o anche mediante delle prove di agglutinazione

basate su interazioni antigene-anticorpo, quindi così potremo analizzare le caratteristiche antigeniche. Se

noi preleviamo una colonia che abbiamo isolato su terreno specifico mediante subcultura e vogliamo

capire di quale delle 3 brucelle s tratti, possiamo farlo evidenziando le caratteristiche antigeniche

utilizzando de sieri, presenti in laboratorio, che contengono anticorpi anti-M e anticorpi anti-A.

Prendiamo la colonia, la stemperiamo in 1pò di soluzione fisiologica, e mettiamo una goccia di siero

anti-M e una goccia di siero anti-A. Se la colonia aveva in superficie l’antigene M, si formerà il

complesso con l’anticorpo anti-M e si avrà l’agglutinazione, altrimenti non si formerà. Se noi abbiamo

stemperato la colonia in 2 vetrini, in uno abbiamo aggiunto l’anticorpo anti-A e nell’altro l’anticorpo

anti-M e questa colonia ha dato agglutinazione nel siero anti-M e non nell’anti-A quindi siamo certi che

è una colonia di B.Melitensis. Per l’Abortus sarebbe stato il contrario, per entrambe le agglutinazioni,

sarebbe stato il caso della B.Abortus. C’è un altro tipo di prova che può essere effettuato, che viene

definito come classificazione di Huddlesone e che analizza l’attività litica di alcuni fagi. In realtà i fagi

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DETTAGLI
Esame: Microbiologia
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in medicina e chirurgia (ordinamento U.E. - durata 6 anni) (CASERTA, NAPOLI)
SSD:

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher valeria0186 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Microbiologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Seconda Università di Napoli SUN - Unina2 o del prof Galdiero Massimiliano.

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