Microbiologia - Batteri e virus

Microbiologia

La microbiologia è la scienza che studia i microrganismi e la loro attività (i microrganismi includono protozoi, la maggior parte di alghe e funghi, i batteri e i virus). Il mondo microbico è rimasto sconosciuto sino all’invenzione del microscopio nel 17^o secolo. Nel 1676 Anton Van Leeuwenhoek fu il primo a osservare i microrganismi grazie alla costruzione di microscopi semplici a singola lente. Fu in grado di descrivere le strutture dei semi, degli embrioni delle piante e di piccoli invertebrati; può essere considerato il fondatore dell’istologia animale e vegetale.

Per quanto riguarda la scoperta dell’eziologia delle malattie infettive, nel 1836 Bassi dimostrò che un fungo era il responsabile di una malattia che colpiva il baco da seta; in seguito Lister introdusse l’antisepsi chirurgica sterilizzando abiti/tessuti con acido carbonico, riducendo drasticamente la mortalità per sepsi. La dimostrazione sperimentale che i batteri possono agire quali agenti di malattie infettive venne dagli studi sul carbonchio ematico. Koch riuscì a trasmettere in serie la malattia da un animale a un altro e a coltivare il batterio del carbonchio usando siero di sangue a temperatura ambiente.

Studio dei microrganismi

I microbi sono piccoli organismi, invisibili a occhio nudo, che esistono come singole cellule o come piccoli aggregati di cellule. Una singola cellula microbica, a differenza delle cellule animali e vegetali, è capace di realizzare i suoi processi vitali indipendentemente da altre cellule sia di tipo diverso che dello stesso tipo. Esistono 5 gruppi di microbi: protozoi, funghi, alghe, batteri e virus. La maggior parte di questi microrganismi è unicellulare, mentre alcuni sono pluricellulari.

Prendendo in considerazione il tipo di organizzazione cellulare si può effettuare un’ulteriore suddivisione tra cellule procariote ed eucariote.

I procarioti e gli eucarioti

I procarioti includono batteri e cianobatteri, le dimensioni tipiche vanno dai 0.5 ai 5 µm di diametro. Non hanno nucleo, il materiale genetico è contenuto in una singola molecola nuda di acido nucleico libera nel citoplasma cellulare.

Gli eucarioti includono protozoi, funghi, piante e animali, le dimensioni tipiche vanno dai 5 ai 100 µm di diametro. Gli eucarioti hanno un vero nucleo, una struttura delimitata da una membrana al cui interno è racchiuso il materiale genetico.

Le cellule procariote sono in genere più piccole delle cellule eucariote. Più piccola è una cellula, più grande è il rapporto superficie/volume. Un rapporto s/v ampio significa che le sostanze nutritive possono raggiungere più rapidamente e facilmente l’interno della cellula, cosa che nelle cellule eucariote viene compensata dalle funzioni dei vari organelli.

Funzioni batteriche dei procarioti

I batteri differiscono per:

• Morfologia (forma, dimensioni e disposizione delle singole cellule)
• Caratteristiche di colorazione
• Caratteristiche metaboliche
• Caratteristiche antigeniche
• Caratteristiche genetiche

Esiste una limitata variabilità di forme batteriche:

• Cocchi, di forma sferica (Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus)
• Bacilli, di forma bastoncellare (Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Clostridium tetani, Bacillus anthracis)
• Spirilli, di forma a spirale. Si dividono in spirilli, struttura rigida, e spirochete, struttura flessibile (Leptospira, Vibro cholerae, Treponema pallidum)

Alcuni microrganismi sono filamentosi (mycelio) o pleomorfi (micoplasmi), cioè multiformi per mancanza di una foggia ben definita. Per quanto riguarda l’attività dei microrganismi, senza di essi ogni forma di vita presente sulla terra sparirebbe; essi infatti sono in grado di decomporre ogni materiale organico, garantendo il flusso degli elementi nutritivi nella catena alimentare. Alcuni batteri contribuiscono inoltre alla fertilità del suolo attraverso un processo noto come azoto-fissazione.

Anche la dieta dei ruminanti dipende da microrganismi, i ruminanti infatti sono incapaci di digerire la cellulosa, l’amido e la pectina, ma possono sfruttare tali sostanze grazie ai batteri celluloso-digestori che vivono nel loro rumine. Inoltre alcuni dei nostri cibi, come i formaggi, altri prodotti lattiero-caseari e alcune bevande alcoliche, sono ottenuti mediante l’azione di microrganismi.

Comunque il settore più promettente è l’ingegneria genetica, che consente di utilizzare i microrganismi, opportunamente programmati a livello genetico, per la produzione di molecole biologiche ad alto valore terapeutico, quali particolari farmaci (insulina ricombinante).

Postulati di Koch

Nel 1876 Koch introdusse il concetto di eziologia. I suoi postulati vengono utilizzati per determinare il legame che esiste tra una malattia e il microrganismo che si sospetta ne sia la causa.

1. Il parassita si ritrova in tutti i casi di una determinata malattia, facendo ritenere che esso sia responsabile delle alterazioni patologiche e del decorso clinico della malattia.
2. Il parassita non si ritrova in altre malattie come parassita non patogeno. Dopo il suo isolamento dal malato e ripetuti passaggi in vitro, il parassita deve riprodurre la malattia se inoculato.
3. Il microrganismo deve essere reisolato dall’animale infettato sperimentalmente.

Ognuno di questi postulati ha eccezioni, quindi i postulati di Koch non sono da considerare come assoluti.

Classificazione dei microrganismi patogeni

Il potere patogeno viene espresso come danno provocato; i microrganismi patogeni sono stati classificati in sei diverse categorie a seconda del loro comportamento in funzione delle difese dell’ospite.

• Classe 1: Microrganismi dotati di scarso potere patogeno intrinseco, causano danno solo se le risposte immunitarie sono molto deboli. Sono di solito considerati opportunisti o commensali (Legionella pneumophila, Pneumocystis carinii).
• Classe 2: Provocano danno in organismi con immunità debole o normale ma non superano difese immunitarie forti, sono causa di malattie serie in individui normali e di patologie gravi in individui con difese immunitarie insufficienti (Streptococcus pneumoniae).
• Classe 2 (tossigeni): Sottoinsieme della classe 2, producono tossine che non stimolano la reazione del sistema immunitario.
• Classe 3: Provocano danni in presenza di normali difese immunitarie, e danni maggiori in corrispondenza di entrambi gli estremi dello stato immunitario.
• Classe 4: Microrganismi con una bassa virulenza capaci di aggredire solo ospiti con immunità compromessa, possono tuttavia provocare una reazione infiammatoria ai due estremi dello stato immunitario (Aspergillus fumigatus).
• Classe 5: Patogeni capaci comunque di causare danno, ma se la risposta è eccessiva o inappropriata si istaura un danno protratto o addirittura cronico. In individui con risorse immunitarie insufficienti queste infezioni possono essere molto gravi ma si risolvono senza danni permanenti ai tessuti, individui con un particolare background genetico sono a rischio di sequele come la sindrome di Reiter (Shigella campylobacter).
• Classe 6: Microrganismi che provocano danno solo attraverso una reazione infiammatoria dell’ospite. È una classe quasi virtuale creata per includere malattie che si ritengono causate da infiammazioni microbiche non meglio identificate.

Utilità dei batteri

I batteri possono essere:

• Utili: Sono presenti nei processi digestivi e nei prodotti lattiero-caseari, impediscono ad altri batteri pericolosi di svilupparsi.
• Deterioranti: Sono i batteri della putrefazione, si moltiplicano con umidità, calore, variazione del PH e tempi di conservazione troppo lunghi.
• Pericolosi: Sono batteri patogeni, che causano infezioni o intossicazioni, direttamente o attraverso la produzione di sostanze tossiche.

Le intossicazioni alimentari si verificano quando l’alimento contiene una tossina che può permanere anche dopo la morte del batterio. Le infezioni alimentari avvengono quando i batteri patogeni contenuti nell’alimento colonizzano l’intestino causando lesioni ai tessuti. Le tossinfezioni alimentari sono una combinazione delle prime due forme, in cui il batterio patogeno, dopo l’assunzione, continua il suo sviluppo nell’intestino scatenando la sintomatologia.

Struttura dei batteri

Esaminando la superficie esterna della cellula batterica, la prima struttura che si rileva è lo strato mucoso esterno che talvolta è così spesso e organizzato da dare origine a una vera e propria capsula. Al di sotto della capsula si incontra la parete cellulare, attraverso la quale possono proiettarsi verso l’esterno diverse appendici quali i flagelli e le fimbrie. Sotto la parete cellulare troviamo la membrana citoplasmatica che racchiude il citoplasma.

Capsula/glicocalice

La matrice extracellulare è composta di polisaccaridi o polipeptidi, o da una combinazione di entrambi per formare un rivestimento viscoso che varia di spessore per ogni specie batterica. Se è strutturata e aderisce con forza alla parete batterica, viene chiamata capsula. Se è disorganizzata e blandamente adesa è chiamata glicocalice. Questi strati esterni proteggono la parete cellulare dall’azione di agenti antibatterici ma soprattutto favoriscono l’adesione e quindi la colonizzazione dei microrganismi patogeni, inoltre proteggono il batterio dall’ingestione/distruzione operata dalle cellule fagocitarie dell’ospite. La differenza tra ceppi innocui e ceppi patogeni è la presenza o assenza della capsula, che consente ai ceppi patogeni di sfuggire alle difese locali.

Parete cellulare

La parete cellulare dei batteri è la struttura che circonda immediatamente la membrana citoplasmatica e preserva la forma della cellula batterica. La funzione più importante della parete cellulare è quella di proteggere fisicamente la cellula. Questa struttura è composta da sostanze presenti solo nel mondo microbico, se inoculata induce sintomi di malattia, rappresenta il bersaglio di alcuni farmaci e infine condiziona il comportamento della cellula batterica alla colorazione di Gram. La struttura è rappresentata da una macromolecola chiamata peptidoglicano, costituita da due amino zuccheri (N-acetilglucosamina e acido N-acetilmuraminico).

Membrana citoplasmatica

La membrana citoplasmatica dei batteri presenta una struttura bilaminare e un modello a mosaico fluido in cui le molecole fosfolipidiche e proteiche si muovono liberamente all’interno della membrana. È una barriera semipermeabile e possiede un centro lipidico che controlla la diffusione all’interno e all’esterno della cellula.

Citoplasma

Il citoplasma è costituito per l’80% di acqua. Nel cytosol troviamo acidi nucleici, enzimi, aminoacidi, carboidrati, lipidi, ioni organici e numerosi composti proteici che rappresentano le inclusioni citoplasmatiche.

Ribosomi

Particelle composte da RNA e proteine, siti di assemblaggio delle proteine.

Cromosomi

Il DNA della cellula, in genere un’unica molecola circolare.

Gram positivi e Gram negativi

La parete cellulare dei batteri Gram positivi (G+) è costituita da circa 20 strati sovrapposti di peptidoglicano, tenuti insieme da ponti aminoacidici. La matrice cellulare contiene acidi teicoici che rappresentano la più importante componente antigenica di superficie (antigene ciò che stimola una risposta immunitaria nell’ospite).

La parete cellulare dei batteri Gram negativi (G-) contiene uno strato di peptidoglicano che costituisce il 10% di tutta la struttura parietale. Inoltre i G- possiedono un’ulteriore struttura che ricopre lo strato di peptidoglicano nota come pseudocapsula; la pseudocapsula si differenzia in due strati e possiede una struttura trilaminare. Più precisamente questa regione si identifica con un doppio strato fosfolipidico in cui ci sono proteine, lipoproteine e lipopolisaccaridi. Le proteine della matrice, dette porine, sono responsabili della permeabilità dello strato esterno in quanto si dispongono nello strato lipidico in modo da formare pori.

Colorazione di Gram

È possibile separare i batteri in base alla loro capacità di assumere/trattenere determinati coloranti. La procedura prevede le seguenti fasi:

• Stesura, essiccamento e fissazione del materiale.
• Colorazione con violetto di genziana fenicato di Nicolloper per 2.3 minuti.
• Trattamento con liquido di Lugol per 2 minuti.
• Decolorazione con alcool-acetone per 1 minuto.
• Lavaggio con acqua.
• Colorazione di contrasto con fucsina diluita o casina al 5% per 1 minuto.
• Lavaggio e asciugamento.

Alla fine del trattamento i microrganismi Gram positivi risultano colorati in violetto e quelli Gram negativi in rosso.

Colorazione di Ziehl-Neelsen, o acido resistenza

L’acido resistenza è una proprietà dei micobatteri. Una volta colorati non si decolorano con soluzioni alcool-acide (rossi) che sono al contrario in grado di decolorare tutti gli altri batteri (blu).

Lipopolisaccaridi

I lipopolisaccaridi sono composti da:

• Una catena terminale polisaccaridica responsabile della specificità antigenica dei batteri.
• Un core polisaccaridico a composizione costante in tutti i batteri.
• Una porzione denominata lipide A, responsabile dell’attività tossica tipica dei G-, infatti i lipopolisaccaridi si identificano con le endotossine.

La presenza di antigeni O, diversi da batterio a batterio, consente di identificare le diverse specie o varietà con prove sierologiche (tipizzazione sierologica).

Lisozima

Enzima che attacca il peptidoglicano, contiene auto lisine per creare fratture controllate ed inserire nuovo materiale; si ritrova nelle secrezioni animali come saliva, mucose e latte.

Flagelli

I flagelli sono lunghi filamenti proteici, costituiti di flagellina; per ogni tipo batterico i flagelli possono essere singoli o multipli, e la loro localizzazione può essere utilizzata a fini tassonomici:

• La presenza di un singolo flagello a un polo caratterizza i monotrichi.
• Più flagelli a un solo polo caratterizzano i lofotrichi.
• Flagelli singoli o ammassi all’uno o all’altro polo gli anfitrichi.
• Flagelli distribuiti su tutta la superficie microbica i peritrichi.

I flagelli batterici sono responsabili della motilità della cellula. La direzione del movimento dipende spesso da fenomeni “chemiotattici”, cioè dalla capacità della cellula di muoversi verso sostanze chimiche attraenti, oppure in direzione opposta a quelle repellenti (chemiotassi). In assenza di stimoli provenienti dall’ambiente, la direzione di movimento si inverte periodicamente (pochi secondi), dando origine ad uno spostamento caratteristico con improvvisi cambiamenti di direzione.

Fimbrie e pili

La maggior parte dei batteri Gram negativi possiede attorno alla cellula i pili, strutture costituite essenzialmente da proteine, con spiccate proprietà antigeniche, infatti i ceppi che le possiedono possono essere facilmente identificati mediante reazioni immunologiche. Se ne distinguono due tipi:

• I pili sessuali, che intervengono nel trasferimento di materiale genetico da un batterio a un altro.
• I pili comuni, fimbrie, molto più numerosi, che conferiscono ai batteri specifiche proprietà di adesione (adesine) ai tessuti dell’ospite; come fattore di adesività le punte delle fimbrie contengono proteine, le lectine, che legano specifici zuccheri.

Pertanto i pili, analogamente alla capsula e al glicocalice, contribuiscono all’instaurarsi dell’infezione, consentendo ai batteri di fissarsi saldamente alle cellule.

Adesine

Le adesine sono proteine della parete batterica che si legano a specifici recettori presenti sulla superficie delle cellule ospiti. Permettono al batterio di aderire alla cellula, colonizzarla e resistere alla rimozione fisica.

Biofilm

È una pellicola di matrice polimerica autoprodotta e cellule batteriche. Serve a proteggere i batteri dagli enzimi e da cambiamenti di PH. Funziona inoltre da adesina e può contribuire alla virulenza attraverso la protezione del batterio contro la reazione immunitaria.

La spora

In condizioni estreme i batteri possono sopravvivere in forme dormienti con metabolismo minimo; per ovviare alla mancanza di nutrimento possono secernere tossine, o produrre strutture per la quiescenza, come le spore (solo bacilli G+). La spora ha un grado elevato di resistenza verso l’azione sterilizzante di molti agenti chimici/fisici e verso l’invecchiamento, i batteri sporigeni possono quindi trasformarsi in tali strutture “dormienti” che non manifestano alcun metabolismo. La spora si forma all’interno di una singola cellula batterica, attraverso un processo chiamato sporulazione, quando le condizioni ambientali diventano sfavorevoli; se le condizioni ambientali tornano favorevoli la spora si riattiva attraverso un processo noto come germinazione. La spora contiene una copia completa del cromosoma, proteine, ribosomi, calcio e numerosi strati di rivestimento che sono la parete del core, cortex, tuniche sporali ed endosporio. In base alla dimensione e alla localizzazione della spora nel corpo batterico, abbiamo i battridi, quando la spora è equatoriale o sub-terminale e dello stesso diametro del batterio, i clostridi, quando la spora è equatoriale o sub-terminale ma di diametro superiore a quello del batterio, e i plettidi, quando la spora è terminale e di diametro superiore a quello del batterio. I germi sporigeni hanno di norma una morfologia bastoncellare e appartengono ai generi Bacillus e Clostridium.

Coltivazione dei batteri in laboratorio

In laboratorio devono essere ricreate le condizioni microbiche più adatte alla singola specie microbica in modo da poter ottenere la crescita microbica ottimale, i fattori che condizionano la crescita batterica possono essere nutritivi e/o ambientali.