Microbiologia

TRASFERIMENTO GENICO ORIZZONTALE

Modelli principali di scambio genetico: coniugazione, trasduzione, trasformazione. In questi meccanismi lo

scambio è unidirezionale (polarizzato) e avviene tra un batterio donatore (che possiede il plasmide coniugativo

F, chiamata cellula F+) e uno ricevente; questo trasferimento genico è detto orizzontale o laterale perché è

unidirezionale.

CONIUGAZIONE

La coniugazione non è un meccanismo riproduttivo ma un meccanismo sessuale perché comporta lo scambio

di informazione genetica tra individui diversi. I batteri prendono contatto grazie al pilo; la sintesi dell’apparato

che serve per la sintesi del pilo appartiene al sistema di esportazione di tipo IV; questo è deputato al trasporto

di proteine, però può per errore trasportare anche DNA (come nella coniugazione).

Nella coniugazione il pilo si retrae per far avvicinare le due cellule; quando queste si trovano direttamente a

contatto parte il segnale che fa sì che un singolo filamento passi. Il pilo poi si retrae e si degrada. Il DNA non

passa attraverso il pilo, questo serve come organello di adesione tra le cellule, e il DNA passa nella superficie di

contatto tra queste.

I geni del pilo sono localizzati sul plasmide F (molecola circolare a doppio filamento), in un’ ampia regione di

oltre 30 Kb che comprende i geni tra:

-geni per sintesi e assemblaggio del pilo

-geni per la regolazione

-geni per la stabilità dell’aggregato

-geni per il trasporto del DNA

-geni coinvolti nel fenomeno dell’esclusione di superficie: fa sì che una cellula dotata di plasmide F non possa

coniugare con una cellula dotata anch’essa di plasmide F

Il trasferimento coniugativo del DNA coinvolge due serie di geni:

-coinvolti nel trasferimento del DNA e nella replicazione (geni mob)

-per la formazione del pilo e del canale di contatto tra le due cellule (geni tra)

Il gene traA codifica la pilina, proteina che compone il pilo sessuale; traQ e traX codificano proteine coinvolte

nell’acetilazione della pilina.

Il recettore del pilo è probabilmente un complesso presente sulla cellula, costituito da LPS e la proteina OmpA;

quando una cellula contiene il plasmide F il recettore viene mascherato e la cellula col pilo (F+) non può

prendere contatto con un’altra provvista di F, perché le proteine TraS e TraT impediscono al pilo della cellula F+

di prendere contatto con l’altra cellula F+ (fenomeno di esclusione di superficie).

Le proteine TraG e TraN sono responsabili del mantenimento del contatto tra le cellule in fase di coniugazione

anche dopo la disgregazione del pilo; la proteina TraD crea il ponte citoplasmatico tra le cellule successive.

TraD mette in contatto il sistema di esportazione di tipo IV col relassosoma; il relassosoma è il sito di taglio e

trasferimento del DNA.

1. contatto tra la punta del pilo F del donatore e il ricevente; il pilo depolarizza e si accorcia fino a quando le

membrane delle due cellule si uniscono e formano un poro coniugativo

2. trasferimento del DNA: il rilassosoma è un apparato con attività di nucleasi e elicasi, incide un’elica del

plasmide F al sito nic di oriT, rilassando il superavvolgimento; TraK, un’elicasi, avvolge a monte del sito di taglio

il DNA, provocando una distorsione a livello della regione di taglio. TraI e TraY svolgono l’elica e effettuano il

taglio; dopo il legame del rilassosoma al poro coniugativo inizia la replicazione del DNA secondo il modello del

cerchio rotante, in cui il filamento intatto serve da stampo per la sintesi

del filamento complementare nella cellula donatrice; il filamento T

legato alla rilassasi è spinto nel ricevente dove è convertito in dsDNA

mediante la sintesi dell’elica complementare.

La replicazione del filamento trasferito inizia da un primer di RNA che si

forma per la trascrizione di ssf e psiD, che sono i primi geni a essere

trasferiti nella cellula:

-ssf: single strand binding protein, lega il DNA di F proteggendo il DNA

a singolo filamento

-psiD: silenzia il sistema RecABCD (sistema SOS) che percepisce un

segnale di DNA a singola elica della cellula.

L’ultimo tratto a essere trasferito nella cellula contiene i geni tra. Al termine della replicazione la elicasi/rilassasi

tagliano il DNA separando il DNA dei plasmidi tra le due cellule.

Quindi la cellula ricevente acquista una copia di F, mentre la donatrice ne mantiene un’altra, e ciascuna delle

due molecole di dsDNA è costituita da un filamento parentale e uno neosintetizzato.

3. separazione delle due cellule (poco conosciuto).

Mobilizzazione

I plasmidi di grandi dimensioni sono coniugativi; quelli di piccole dimensioni possono essere mobilizzabili, sono

plasmidi non coniugativi perchè non contengono tutti i geni per il trasferimento, ma contengono geni che

permettono di tagliare il proprio DNA quando percepiscono l’avvicinamento di una cellula; questi sfruttano il

sistema di coniugazione di un plasmide compatibile presente nella cellula ospite. Alcuni plasmidi mobilizzabili

hanno una propria nucleasi in grado di tagliare il DNA nel sito di oriT per dare l’avvio alla coniugazione, altri

hanno un sito oriT identico a quello di F, riconoscibile da nucleasi codificate da plasmidi coniugativi.

Integrazione del fattore o plasmide F nel cromosoma (guarda 342): cellula Hfr

In una cellula F+ il DNA di F si può integrare nel cromosoma batterico, formando un batterio Hfr (high

frequency of recombination); questo può avvenire per ricombinazione omologa tra una delle sequenze IS, che

fanno parte della famiglia dei trasposoni; queste sono presenti sia sul plasmide sia sul cromosoma in molteplici

copie, e permettono la ricombinazione in tutti i siti dove sono queste sequenze per singolo crossing over. La

cellula F+ trasferisce solo parte dei geni plasmidici perché l’origine di trasferimento oriT è in posizione centrale

rispetto alle sequenze IS.

Il pezzo di plasmide nel 90% dei casi è degradato perché non riesce a circolarizzare, altre volte si ricombina con

doppio crossing over.

In Hfr il fattore F rimane stabilmente integrato, ma può anche escidersi dal suo sito mediante un meccanismo

inverso a quello di integrazione; l’escissione può portare con sé una delle regioni fiancheggianti il sito di

integrazione, a formare il plasmide F’ (che quindi contiene frammenti di cromosoma). Questi quando vengono

trasferiti da una cellula all’altra creano dei merodiploidi parziali.

Se incrocio una cellula Hfr con una F-, ottengo ancora un Hfr e un F- perché il genoma di F passa solo in piccola

parte nella cellula ricevente, ma non trova omologia e quindi non ricombina con nessun gene cromosomico.

Osservando le frequenze di ricombinanti si può determinare l’ordine dei geni: a seconda del tempo impiegato

da una cellula F+ a trasferire il plasmide, si può costruire una mappa genetica in cui i geni sono distanziati a

seconda del tempo necessario per farli entrare. Le frequenze di ricombinazione dei geni più lontani

diminuiscono in funzione della distanza dall’origine a causa di rotture dell’apparato di coniugazione.

L’operone lac è presente in duplice copia nel genoma della cellula recipiente, questo ha permesso di eseguire

gli esperimenti per capire la struttura dell’operone lac.

TRASDUZIONE

I virus per moltiplicarsi devono reclutare una cellula ospite; hanno un genoma rivestito da un capside costituito

da una o poche molecole diverse ripetute molte volte.

I fagi sono virus delle cellule batteriche che non penetrano mai nel citoplasma batterico, ma iniettano il loro

DNA lasciando la componente di rivestimento all’esterno del batterio. Quando infettano il batterio si

susseguono più fasi:

-eclissi: dopo l’adsorbimento c’è la scomparsa delle particelle virali infettive dovuto alla spoliazione (rimozione

del capside delle particelle virali)

-periodo latente: replicazione dell’acido nucleico e sintesi delle proteine virali

-maturazione: genoma e proteine virali vengono assemblate in virioni maturi, se le cellule vengono rotte si può

rilevare un virus maturo

-rilascio: può avvenire con o senza lisi della cellula ospite.

I virus dopo aver iniettato il proprio genoma nell’ospite possono adottare due strategie di sopravvivenza:

-ciclo litico: sintetizzano acidi nucleici e proteine che vanno a costituire nuovi virioni, i quali uscendo lisano la

cellula ospite

-ciclo lisogenico: il genoma virale si inserisce in quello batterico (dei virus diventa provirus, batteriofagi diventa

profagi) mantenendo molti dei suoi geni disattivati; quando la cellula si duplica viene trasmesso anche il DNA

virale alle cellule figlie formando così in un breve periodo una vasta colonia di genomi virali senza che avvenga

la lisi. Il genoma del provirus reprime la maggior parte dei suoi geni, che vengono riattivati in caso di danni alla

cellula ospite, dando il via ad un ciclo litico.

T4 ha solo un ciclo litico, lisa immediatamente le cellule infettate.

Trasduzione specializzata: batteriofagi lambdoidi, Mu in coli, SPβ in B. subtilis

Il modello maggiormente studiato è quello del batteriofago lambda; λ usa una porina presente sulla cellula

batterica come recettore. Quando inietta il proprio DNA nella cellula, questo circolarizza perché ha estremità

coesive -> in questo modo il proprio DNA a single strand non è attaccato dal sistema RecBCD del batterio.

Quando il genoma di λ si integra con quello batterico, il fago effettua un ciclo lisogenico (questo vale solo per

λ).

Il profago (genoma di un fago integrato in quello batterico) di λ è inserito sul cromosoma di E. coli in un sito

compreso tra i marcatori gal e bio; il profago si excide con ricombinazione sito-specifica tra le due estremità del

profago stesso; a volte però la ricombinazione può avvenire in modo illegittimo tra un punto esterno al

profago (sul genoma batterico) e uno interno; in questo modo la molecola escissa perde una porzione di

genoma del fago e acquista marcatori batterici che possono così essere trasdotti. Si formano così particelle di λ

trasducenti portatrici dell’operone bio o gal.

Ciclo lisogenico: è attivato il repressore C1 che spegne i geni necessari per la via litica, quindi non avviene

replicazione; il fago si integra in un sito specifico grazie a una sequenza, atb che riconosce una sequenza sul

batterio che media una ricombinazione sito specifica. A seguito di segnali particolari come raggi UV, il

repressore C1 si degrada e il fago si excide usando gli stessi siti usati per l’integrazione, e inizia il ciclo litico;

l’excisione può avvenire in modo impreciso, e il fago può portarsi dietro anche una parte del genoma batterico

-> il DNA è troppo grande e non entra tutto nella testa, e una parte del genoma rimane fuori. Il fago avendo