Microbiologia

Morfologia batterica

Le dimensioni batteriche variano da 0.2 a 2 micrometri. Gli organismi sono unicellulari, quindi c'è una varietà limitata di forme; le forme più comuni sono quella sferoidale e quella bastoncellare, che prendono rispettivamente il nome di cocco e bacillo. A seconda dei tipi di piani di divisione e del numero, avremo diplococchi, streptococchi, coccobacillo, streptobacillo, spirocheta e vibrillo.

Struttura batterica

Questi organismi presentano una membrana plasmatica, un rivestimento più esterno e una parete mureinica o sacculo formato principalmente dal peptidoglicano. Alcune proteine batteriche sono simili alle proteine citoscheletriche eucariote:

• FtsZ, simile alla tubulina, forma il setto al momento della separazione della parete cellulare.
• MreB, simile all'actina, definisce il diametro cellulare.
• CreS, simile ai filamenti intermedi, è responsabile della curvatura cellulare.
• Pili: strutture di adesione presenti sulla superficie di alcuni batteri.
• Nucleoide: regione dove è localizzato il DNA (non incluso in una membrana).
• Membrana plasmatica: racchiude il citoplasma.
• Parete cellulare: struttura rigida all’esterno della membrana plasmatica.
• Capsula: strato gelatinoso presente sulla superficie di alcuni procarioti.
• Flagelli: organelli di locomozione.

Funzioni della membrana plasmatica

La membrana plasmatica separa la cellula dall'esterno, proteggendola da eventuali attacchi patogeni e rendendola selettiva alla permeazione di determinate sostanze. È inoltre la sede di processi metabolici, con cui si crea un gradiente alla base della forza proton-motrice (respirazione, fotosintesi, biosintesi), e della trasduzione del segnale mediante la presenza di recettori che gli permettono di rispondere allo stimolo esterno. Come gli eucarioti, la membrana procariota è formata da un doppio strato di fosfolipidi, ma da una grande varietà di proteine proprio perché la cellula procariota è priva di organelli citoplasmatici.

È costituita principalmente da fosfolipidi in cui la testa polare è rappresentata dal D-glicerolo-3-fosfato e la coda da due molecole di acidi grassi non ramificati esterificati al C-1 e al C-2. Al fosfato esterificato in C-3 si possono legare dei gruppi funzionali come l'etanolammina (più presente nei Gram+) e la serina (più presente nei Gram-). La struttura generale è stabilizzata da interazioni idrofobe e da cationi bivalenti come Mg e Ca che interagiscono con le cariche negative dei gruppi fosfato del fosfolipidi. Gli acidi grassi nei fosfolipidi sono in maggioranza saturi. Il rapporto saturo/insaturo controlla la fluidità di membrana; sintetizzando un maggior numero di acidi grassi insaturi, la viscosità diminuisce e la membrana diventa più fluida, questo in risposta a stimoli ambientali come l'abbassamento della temperatura.

Composizione delle membrane procariotiche

Molti batteri presentano delle desaturasi intrinseche che lavorano sugli acidi grassi molto rapidamente. Del tutto assente nelle membrane procariote è il colesterolo (fig a); gli steroli si trovano solo nei micoplasmi, intracellulari obbligati, che non possiedono parete e sono dotati di una membrana citoplasmatica più rigida. Particolari tipi di lipidi che troviamo nei Bacteria sono gli opanoidi (fig b), simili agli steroli, svolgono funzione inversa rispetto agli acidi grassi; tendono a rendere la membrana più viscosa e quindi meno flessibile.

Per quanto riguarda le proteine, E.coli ne presenta almeno 200 diverse tra cui:

• Proteine integrali di membrana, insolubili, sono anfipatiche; la regione idrofila è rivolta verso l'esterno della cellula mentre la parte idrofoba è inclusa nella matrice lipidica.
• Proteine periferiche, sono associate alla membrana tramite interazioni non covalenti con le proteine integrali oppure ancorate al foglietto lipidico tramite un dominio transmembrana.
• Lipoproteine, ancorate tramite una modificazione post-traduzionale.

Mesosomi

I mesosomi sono invaginazioni della membrana interna che formano vescicole, tubuli o lamelle; presenti maggiormente nei Gram-positivi. Sembrano spesso associati ai setti nei processi di scissione binaria o direttamente ai cromosomi batterici, per questo è stato prospettato un loro ruolo nella replicazione o nella suddivisione delle cellule figlie. Molti batteri hanno vescicole o tasche che formano un rapporto superficie-volume favorevole a determinate condizioni.

Membrana plasmatica degli Archea

Organismi estremofili con genoma aploide presentano particolarità che rendono la membrana una struttura rigida e impermeabile:

• Chiralità del glicerolo, fosfato esterificato con il glicerolo in C-1 e dà vita all'L-glicerolo.
• Tipo di catena alifatica, lipidi sostituiti da fitanile (20 atomi di C) o difetanile (40 atomi di C).
• Legame estere o etere in C-2 o C-3.

Parete batterica

La parete batterica assume forme e funzioni diverse nei differenti gruppi. I batteri Gram negativi possiedono una membrana esterna, doppio strato fosfolipidico e una membrana plasmatica più interna. Lo spazio tra le due membrane si chiama periplasma e contiene uno strato molto sottile, il peptidoglicano (o mureina). I batteri Gram positivi sono privi di membrana esterna e la loro parete è composta da uno spesso strato di peptidoglicano.

Il sacculo, struttura cellulare che avvolge la cellula e conferisce rigidità, è costituito essenzialmente da peptidoglicano. Il peptidoglicano ha una struttura reticolare formata da catene glicaniche costituite da due aminozuccheri alternati, L'N-acetil glucosamina (NAG) e l'acido N-acetil-muramico (NAM). Al NAM è legato un tetrapeptide con cui le catene glicaniche si connettono tra loro. Gli antibiotici più potenti inibiscono la sintesi del peptidoglicano; il lisozima invece è un enzima che degrada il peptidoglicano idrolizzando il legame β-1,4 tra gli amminozuccheri del peptidoglicano.

Un batterio a cui viene eliminata la parete prende il nome di protoplasto; questo in una soluzione ipotonica si rigonfia per ingresso del solvente fino a lisare, in soluzione ipertonica invece perde acqua, in soluzione isotonica è in equilibrio con l’esterno e assume una forma sferica. Questi esperimenti evidenziano il ruolo della parete di conferire forma e rigidità e di contrastare la pressione osmotica intracellulare.

Il peptidoglicano

Il monomero è il glicano tetrapeptide, un disaccaride legato a un tetrapeptide; questo è costituito dall’acido N-acetil-muramico (NAM) e l’N-acetil glucosammina (NAG), legati da legami β-1,4 glicosidici; questi si uniscono a formare catene, la cui lunghezza varia con la specie (da poche decine a qualche centinaio) e non è correlata con lo spessore dello strato che poi ne risulterà; nella stessa specie dipende comunque dallo stadio della crescita. NAM e NAG si differenziano per la presenza nel NAM di un residuo di acido D-lattico legato con legame etere al C3 del glucosio, cui è legato un tetrapeptide formato da amminoacidi D e L che alternati aumentano la resistenza; tra gli amminoacidi si formano anche legami H che rendono la struttura più compatta.

La composizione del tetrapeptide varia, quella più frequente è formata dalla sequenza: L-alanina, acido D-glutamico, acido meso-diaminopimelico (DAP), D-alanina. Nei Gram-positivi l’acido meso-diaminopimelico è sostituito da una L-lisina; l’acido meso-diaminopimelico si trova solamente nei batteri e a volte nelle cellule vegetali, mai in quelle animali.

Legame peptidico

• Legame crociato 3-4 diretto: soprattutto nei Gram negativi; il legame peptidico avviene tra il diaminoacido (amminoacido con 2 gruppi amminici) in posizione 3 e il gruppo carbossilico della D-Alanina in posizione 4 di una catena adiacente.
• Ponte interpeptidico: in alcuni Gram-positivi; il legame si instaura fra l'aa in posizione 3 (solitamente la L-Lys) e la D-Ala in 4 mediante l’interposizione di uno o più aa, e aumenta la rigidità; negli stafilococchi il ponte è formato da 5 glicine. Questo ponte si forma nei Gram positivi per il 70% delle catene e nei Gram negativi per il 30-40%; per questo motivo il peptidoglicano dei Gram negativi è meno compatto, oltre a essere meno stratificato.

Alcuni residui possono essere aggiunti dopo nel peptidoglicano, e sono stabili o transienti a seconda della concentrazione esterna. La flora batterica intestinale: bisogna tener conto di dove i batteri vivono, a che stress sono sottoposti e a che stress sono sottoposti rispetto all’ospite; gli ospiti si rendono conto della presenza dei batteri quando questi sono in determinate posizioni, tali da rompere l’equilibrio; nell’intestino noi ce li abbiamo dalla nascita, e non rompono alcun equilibrio. I patogeni dell’intestino si prendono col cibo, arrivano allo stomaco (che può essere anche a pH=2); questi batteri possono modificare i polisaccaridi per sopravvivere, sul peptidoglicano non si sa molto.

Nel batterio non c’è l’usura dei telomeri, la morte avviene solo per causa esogena, non ha un programma insito di morte. I procarioti hanno un genoma aploide che però contiene geni ridondanti per le funzioni fondamentali, quindi la mutazione di un gene non provoca necessariamente la perdita di quella funzione.

Biosintesi del peptidoglicano

Avviene in 3 diversi compartimenti:

1. Citoplasma: biosintesi dei precursori; questi sono due aminozuccheri, NAM e NAG legati all’UDP a formare UDP-NAG e UDP-NAM, e il pentapeptide che verrà legato al residuo lattico del NAM; gli amminoacidi L del pentapeptide derivano dalle vie metaboliche cellulari, anche l’acido meso-diaminopimelico che è l’ultimo intermedio del pathway biosintetico dell’L-lisina. Gli ultimi 2 aa del pentapeptide sono 2 D-ala, che vengono aggiunte come dimero. Infine il pentapeptide viene assemblato come UDP-NAM-pentapeptide.

   L’UDP-NAG è sintetizzato a partire dal fruttosio-6-fosfato e UTP. L’UDP-NAM è sintetizzato da UDP-NAG in presenza di fosfoenolpiruvato (PEP), la reazione è catalizzata da MurA e MurB: il PEP è trasferito al gruppo OH dell’UDP-NAG sul 3’ da MurA, formando un intermedio che viene trasformato da MurB a UDP-NAM. La MurA viene inattivata dalla fosfomicina. La sintesi del pentapeptide legato al NAM avviene grazie alle ligasi Mur:

   • MurC catalizza la formazione del legame dell’alanina al residuo carbossilico dell’UDP-NAM;
   • MurD aggiunge l’acido glutammico in seconda posizione;
   • MurE aa in terza posizione;
   • MurF aggiunge il dipeptide D-ala-D-ala.

   Quindi il precursore del glican tetrapeptide è sintetizzato come glican pentapeptide, e l’ala sul 5 viene poi rimossa durante la formazione del legame transpeptidico. I precursori del peptidoglicano dopo essere stati sintetizzati vengono trasportati all’esterno della membrana plasmatica, nel periplasma.

2. Membrana citoplasmatica: sintesi dell’unità monomerica del glicano legata a un trasportatore lipidico, e il suo ribaltamento sulla faccia esterna della membrana.
   • I precursori sono trasportati all’esterno della membrana grazie a un trasportatore lipidico, il bactoprenolo, un alcol a 55 atomi di C: il NAM-pentapeptide si lega al bactoprenolo formando il lipide I; il bactoprenolo è dotato di capacità energizzanti (viene fosforilato e defosforilato). Questo è un bersaglio degli antibiotici.
   • Al lipide I si lega una molecola di NAG a formare il lipide II.
   • Il monomero di glicano situato sul lato citoplasmatico della membrana viene trasportato sulla faccia periplasmatica.
   • Le transglicosilasi catalizzano la formazione dei legami glicosidici tra il nuovo monomero di glicano pentapeptide e il filamento di glicano nascente; il bactoprenolo viene fosforilato e ribaltato sulla faccia interna della membrana per essere usato per un nuovo ciclo di sintesi. Il bersaglio della penicillina è la formazione del legame tra zuccheri e peptidi.

   Nei Gram positivi si pensa che la sintesi avvenga tagliando un monomero e aggiungendone uno nuovo; nei Gram negativi (modello delle Inn Young, three for one) si rompe un monomero in superficie ogni tre monomeri legati in fondo. Questo avviene quando il batterio cresce, prima che si formi il setto.

   • Si forma il legame peptidico tra la catena pentapeptidica e il tetrapeptide, reazione catalizzata dalle transpeptidasi: avviene un legame crociato tra la penultima D-ala del pentapeptide e il gruppo amminico libero della lisina (o dell’acido meso-diaminopimelico), e viene rilasciata la D-ala terminale del pentapeptide. Il legame D-ala-D-ala quando viene rotto fornisce energia (infatti nel periplasma non ci sono molecole energetiche). Quello eliminato è riciclato.

   Le transpeptidasi hanno una forte affinità per gli antibiotici β-lattamici (come penicillina) a causa della loro somiglianza strutturale col dipeptide D-ala-D-ala; per questo vengono chiamati PBP (Penicillin-Binding-Protein). Il materiale in eccesso viene smontato negli elementi di base e riusato; alcuni elementi possono sfuggire, viene perso dal 5 all’8-9% della metà del totale; questo serve per fare detection, cioè viene sentito dall’ospite: l’ospite sente il peptidoglicano, anche nei Gram negativi in cui è interno, grazie ai pezzi del batterio che il batterio rilascia.

   Alcuni batteri come Bordatella pertussis (causa la pertosse) mancano di alcune funzioni del riciclo, e hanno fatto in modo che perdendo molti pezzi si difendano in quanto provocano una reazione infiammatoria molto intensa nella mucosa nasale funzionali al processo di patogenesi. Durante l’accrescimento la parete deve aumentare la propria estensione, questo avviene rompendo alcuni legami della rete di peptidoglicano e inserendo nuovi filamenti di glicano; il peptidoglicano è tagliato dalle autolisine.

3. Spazio esterno alla membrana: reazioni di polimerizzazione e transpeptidazione (formazione dei legami crociati) tra due aa delle catene peptidiche.

   Il lisozima è un enzima in grado di rompere il legame β1-4 tra il NAM e il NAG, ma non penetra nel peptidoglicano dei Gram negativi perché la membrana esterna lo protegge.

Modificazioni del peptidoglicano

Dopo la sintesi il peptidoglicano può essere modificato; le modificazioni possono essere permanenti o transienti (a seconda dell’ambiente e delle fasi di crescita). Queste servono ad aumentare la resistenza, soprattutto contro il lisozima che è un enzima ubiquitario. Le modificazioni possono essere:

• Acetilazione/deacetilazione: l’acetilazione del MurNAC è molto comune; deacetilazione: il peptidoglicano deacilato è attaccato di meno dai lisozimi perché è meno riconoscibile; secondo un’altra ipotesi la deacetilazione introduce cariche positive (perché diventa meno negativo) che danno maggiore resistenza a fattori come i peptidi antibatterici (come quelli presenti sulla pelle degli anfibi) prodotti da quasi tutti gli eucarioti superiori (noi ne produciamo tanti nell’intestino). Listeria monocytogenes è un batterio opportunista ha la deacilasi del peptidoglicano, quando interagisce con l’ospite cambia il peptidoglicano.
• Glicosilazione: poco comune.

Procarioti senza parete cellulare

Non tutti i procarioti presentano la parete cellulare:

• Mycoplasma (Batteri) che è un intracellulare obbligato non ha una parete ma solo una membrana modificata.
• Clamydia (Batteri) è un intracellulare obbligato che è sensibile agli antibiotici che agiscono sul peptidoglicano, ma nessuno ancora è riuscito a visualizzare questa struttura.
• Thermoplasma (Archea)
• Picrophilus (Archea)

Parete archea

La parete manca di acido muramico e D-aminoacidi. Sono positivi alla colorazione di Gram, ma questo non indica un rapporto funzionale come nella distinzione fra batteri Gram-positivi e negativi, è solo una conseguenza dello spessore della parete; hanno pareti molto spesse perché queste permettono loro di vivere in ambienti ostili. Negli Archea metanogeni (cioè che usano l’idrogeno molecolare liberato dalle fermentazioni), i gruppi Methanobacteriales, Methanopyrales mostrano nella parete una sostanza simile alla mureina chiamata pseudomureina o pseudopeptidoglicano; questo è costituito da un’alternanza del NAG e dell’acido N-acetiltasominuronico (NAT) legati da un legame β1,3. Questa organizzazione rende gli Archea più resistenti a vari stimoli ambientali e all’azione del lisozima.

Alcuni metanogeni, alofili e termofili estremi hanno una parete cellulare costituita da glicoproteine generalmente a simmetria esagonale; i carboidrati presenti sono esosio come glucosio, glucosammina, galattosio e mannosio, pentosi come ribosio e arabinosio. I batteri non hanno glicoproteine. La parete dell’alofilo estremo (che vive a alte concentrazioni saline) Halobacterium è costituita da glicoproteine, e sono presenti in abbondanza aa acidi (carichi negativamente) che servono per bilanciare l’alta concentrazione in Na+ dell’ambiente; questo richiede un 20-25% di NaCl per mantenere intatta la parete. Se la concentrazione scende al 15% le cellule cominciano a formare sferoplasti (cellule prive di parete) perché i componenti della parete sono instabili. A concentrazioni del 10% la cellula va incontro a lisi.

Archea senza parete

Esistono degli Archea privi di parete:

• Thermoplasma: chemiorganotrofo (usa materiali organici per respirare) cresce a pH2 e T 55°C in grado di utilizzare zolfo per la respirazione aerobia o anaerobia. Il genoma è molto piccolo come quello dei micoplasmi, 1.5 MB (1500 kb); il DNA è associato a proteine fortemente basiche che lo organizzano in strutture nucleosoma simili. Ha proteine istoniche che assomigliano a quelle degli Eucarioti.
• Thermoplasma acidophilum vive negli scarti dell’estrazione di carbone soggetti ad autocombustione; le cellule hanno un diametro da 0.2 a 5 µm.
• Thermoplasma volcanium si trova in aree calde ed acide in vari continenti; estremamente mobile ricco di flagelli.
• Ferroplasma: chemiolitotrofo, privo di parete cellulare; non è termofilo.