Microbiologia

Microbiologia

Cos'è una cellula?

Unità fondamentale, strutturale e funzionale di un organismo.

Procarioti

Non c'è nucleo, il materiale genetico è intersperso nel citoplasma e normalmente organizzato in un unico cromosoma circolare, salvo eccezioni. C'è un certo grado di condensazione, ma senza nucleosomi.

Accoppiamento diretto tra trascrizione e traduzione. Il tutto è contenuto in un involucro costituito da uno strato più interno, la membrana citoplasmatica, uno strato intermedio, la parete, e uno strato più esterno, la capsula.

La parete può essere costituita da uno strato di peptidoglicano a cui si può aggiungere un ulteriore strato. La capsula serve per far aderire la cellula a uno strato, non è sempre presente. I pili sono le strutture utilizzate nel processo d’adesione, mentre il pilo sessuale permette scambi di materiale genetico. Il flagello è implicato nel movimento.

I procarioti sono più piccoli (1-5 micrometri) degli eucarioti, ma hanno anche alcune caratteristiche comuni: metabolismo, insorgenza di mutazioni e selezione.

La cellula non è in equilibrio né con se stessa, né con l’ambiente. Per mantenersi e riprodursi è necessaria energia, materia e informazione.

I procarioti si dividono in batteri e Archea (Woese 1990). Perlopiù unicellulari, ma non mancano organizzazioni pluricellulari. È possibile che tutti gli attuali organismi derivino da Luca (Last Universal Common Ancestor); i raggruppamenti tengono conto della storia evolutiva. Mitocondri e cloroplasti sono classificati come batteri: si suppone un’endosimbiosi con una cellula eucariote.

Batteri

È il gruppo più numeroso (gli Archea vivono in condizioni estreme e spesso non si riesce a ricreare queste situazioni in laboratorio, sono quindi meno conosciuti). Al momento si sta sottovalutando la loro variabilità. Includono i procarioti più importanti dal punto di vista medico; poche specie vivono in ambienti estremi. Nessuna specie produce metano, prerogativa di Archea. Includono tutte le specie procacciate note per far fotosintesi, sia ossigenica (cianobatteri) sia anossigenica (batteri verdi e rossi). Ci sono anche importanti differenze molecolari.

La microbiologia consapevole ha avuto inizio dopo l’invenzione del microscopio ottico. Pasteur studiò le fermentazioni e le malattie causate da batteri. Un altro pioniere fu Robert Koch, che riuscì a coltivare l’agente causale dell’antrace (Bacillus anthracis) e a descriverne il ciclo di vita. Scoprì inoltre l’agente eziologico della tubercolosi (Mycobacterium tuberculosis) e sviluppò l’estratto antigienico che poteva dimostrare l’avvenuta infezione di un organismo ospite, la tubercolina.

I batteri hanno dimensioni che vanno dall’1 ai 5 micrometri (nanobatteri 0,2 micrometri). Alcuni raggiungono quasi il mm. I cocchi sono sferici (bastoncello, spirillo, spirochete, prostecati, filamenti e ife). I progettati hanno un peduncolo che permette di aderire al substrato (prosteca).

Lo streptococco forma lunghe catene: le cellule non si dividono subito dopo la duplicazione. La forma dell’aggregato è fondamentale per identificare la tipologia del batterio.

Una cellula viene depositata e comincia a dividersi. Da luogo a una colonia visibile a occhio nudo, composta da cloni. I raggruppamenti più complicati sono quelli di Streptomyces.

Composizione chimica elementare

Se si vuole ottenere una colonia pura, mettiamo in un terreno sterile una parte di colonia con un’ansa in titanio o plastica. Incubiamo la beuta in un bagno d’aria o d’acqua (per E. coli a 37 gradi centigradi si ottiene la massima velocità di crescita), agitiamo in modo tale da favorire gli scambi con l’atmosfera. Dopo una notte troveremo una sospensione di cellule molto densa, perché tutti gli E. coli hanno cominciato a dividersi, dal momento che hanno potuto approvvigionarsi con le componenti del terreno. Possiamo raccogliere le cellule per centrifugazione e pesare il sedimento. 10¹² batteri peseranno all’incirca un grammo (peso umido), se si toglie acqua si ottengono all’incirca 0,2-0,3 g (peso secco). 0,2-0,3 grammi di materia presente nel terreno di coltura sono stati trasformati in cellule batteriche. Vengono così individuati i componenti fondamentali per la crescita.

Costituenti integrali delle macromolecole: carbonio (50%), ossigeno (20%), azoto (14%), idrogeno (8%), fosforo (3%), zolfo (1%) —> macroelements.

Presenti in forma ionica: potassio (1%), magnesio (0.5%), calcio (0.5%), ferro (0.2%)… —> microelements.

I gruppi che utilizzano la CO₂ come fonte di carbonio vengono chiamati autotrofi, quelli che usano i composti organici sono eterotrofi. I batteri possono fare entrambe le cose a seconda delle necessità. NH₂, NO₂, N₃ sono le principali fonti di azoto. I batteri sono azotofissatori, sono in grado di stabilire endosimbiosi con le piante.

Le proteine sono le macromolecole più presenti, seguite da RNA, carboidrati, lipidi, DNA… Il brodo del terreno di coltura è molto ricco di composti organici e aminoacidi. Se manca una sola richiesta il batterio non cresce. La composizione chimica dei procarioti è del tutto simile a quella degli eucarioti, con alcuni dettagli molecolari che riguardano la parete dei batteri e la membrana degli Archea.

Involucro

Batteri: membrana citoplasmatica sormontata da membrana esterna, è tipica di batteri chiamati Gram-negativi. Tra le due c’è uno strato del polimero peptidoglicano, nello spazio cosiddetto periplasmatico. Il peptidoglicano ha la funzione di conferire rigidità all’involucro. La parete comprende spazio periplasmatico e membrana esterna, l’involucro è tutto l’insieme.

Membrana citoplasmatica più strato di peptidoglicano senza membrana esterna è tipica dei Gram-positivi. Lo strato di peptidoglicano è più alto, ma ha la stessa funzione dei Gram-negativi. La parete è tutto ciò che sta sopra la superficie esterna della membrana citoplasmatica.

La membrana citoplasmatica non ha differenze ed è molto simile a quella degli eucarioti: doppio strato fosfolipidico con all’interno proteine (integrali, periferiche o trans-membrana). Il fosfolipide ha una doppia catena di acidi grassi legati all’enantiomero D del glicerolo (legame estere), dove si trova un residuo di PO₄^2- al quale si legano vari sostituenti. La fluidità del doppio strato è influenzata da sostituenti in R, dalla lunghezza della saturazione dell’acido grasso e dagli altri lipidi di membrana: nei batteri sono presenti opanoidi, steroli policiclici che hanno un alto grado di somiglianza con il colesterolo (anche gli eucarioti contengono steroli, irrigidiscono la membrana).

Archea

I lipidi hanno una struttura particolare. Abbiamo sempre un doppio strato, ma non troviamo acidi grassi, ma catene isoprenoidi ramificate (metili). Sono legate al glicerolo attraverso un legame etere (enantiomero L).

Ci sono due possibilità di organizzazione:

• La disposizione è identica a quella dei batteri.
• Gli Archea vivono in condizioni estreme: le catene isoprenoidi sono collegate covalentemente tra loro per conferire più stabilità e formare un unico strato.

In origine è possibile che forme racemiche miste coesistessero: eucarioti, arche e batteri hanno dovuto optare per una direzione univoca (oppure eucarioti e batteri si sono diversificati in maniera indipendente da Archea).

Le funzioni della membrana citoplasmatica sono:

• Isolare l’ambiente extracellulare (barriera di permeabilità)
• Mettere in contatto con l’ambiente e controllare gli scambi
• Accumulare energia chimica, elettrica e osmotica (forza protonmotrice)
• Trasformare l’energia in forza protonmotrice (catena respiratoria, fotosintesi)
• Trasformare la forza protonmotrice in energia chimica (ATP), meccanica (flagelli) o osmotica.
• Biosintetizzare lipidi e polimeri della parete.
• Percepire le variazioni ambientali e trasmettere segnali ai sistemi metabolici, genetici etc.
• Secernere prodotti extracellulari, è la sede della biosintesi di costituenti delle strutture extracitoplasmatiche

A ciascuna molecola possiamo associare un indice di permeabilità della membrana (acqua = 1). Esistono due tipi di trasporto attraverso la membrana:

• Passivo: diffusione semplice o facilitata, secondo gradiente.
• Attivo: primario se c’è uso diretto di ATP, secondario se si usa un gradiente elettrochimico già instaurato (simporto e antiporto). Si parla di traslocazione se c’è modifica chimica del substrato. Contro gradiente.

I trasportatori ABC idrolizzano ATP: hanno una subunità transmembrana che funge da canale. La molecola viene trasportata solo se la terza subunità (citoplasmatica) è quella che si incarica dell’idrolisi. La prima subunità riconosce in modo specifico la molecola da trasportare.

Nel caso del glucosio e altri zuccheri si parla di traslocazione: il PO₄^2- è donato da PEP, passa attraverso una serie di trasportatori. L’enzima IIb passa poi PO₄ alla proteina canale (enzima IIc) che lo trasferisce al glucosio, che diventa glucosio 6-fosfato. È anche un sistema di trasduzione del segnale, perché indica la presenza di zuccheri. In E. Coli (ma non solo) il trasporto di glucosio può influenzare i movimenti del lattosio: se il livello di glucosio è basso, aumenta il livello di AMPc. Nei Gram-negativi (che hanno membrana esterna) gli zuccheri passano attraverso sistemi di uptake, che ne facilitano l’ingresso e li portano a ridosso della membrana interna, dove utilizzano trasportatori ABC.

Parete

Sopra la parete possono esserci anche altri strati (appendici come pili o flagelli…). Ne esistono di diverse tipologie a seconda del gruppo.

È presente in quasi tutti i procarioti. Gli Archea hanno a volte altri rivestimenti di tipo proteico, detti strati S. La struttura diversa della parete dei batteri provoca una diversità nella colorazione: il crystal violetto colora sia Gram-negativi che Gram-positivi; si aggiunge iodina con obiettivo di fissare la colorazione.

L’etanolo viene utilizzato per decolorare: i Gram-negativi sono bianchi, i Gram-positivi ancora crystal violetto. I Gram-negativi diventano rosa dopo trattamento con safranina, i Gram positivi rimangono uguali.

Se le cellule vengono trattate con lisozima, si indeboliscono (fuoriesce il citoplasma). Lo strato di peptidoglicano cerca di mantenere la sua forma e serve a contrastare la pressione osmotica intracellulare. Se si lavora con lisozima in condizioni ipotoniche, le cellule si lisano; in soluzione isotonica si formano sacculi di peptidoglicano.

N-acetil glucosammina (NAG) e N acetil-muramico (NAM) sono legati tra loro secondo un legame Beta 1-4 glicosidico. Al NAM è legato un tetrapetide (L-ala, gli, acido deamminopirrolico, D-alanina). Questi elementi costituiscono l’unità monomerica di peptidoglicano. La componente pesticida va a formare legami interpeptidici (tra DAP e D-alanina).

In Staphilococcus aureus, tra i due tetrapeptidi c’è una catena di cinque glicine, il ponte è più lungo. Si può immaginare che la differenza tra Gram positivo e Gram negativo sia dovuta al numero di strati, inferiore nei negativi. Si è visto però che il peptidoglicano forma nastri dovuti a superavvolgimento, che circondano la cellula. Nella parete dei Gram positivi sono state trovate altre molecole, gli acidi teicoici con porzioni lipofile che interagiscono con la membrana e la ancorano allo strato di peptidoglicano. Acidi teicuroni e polisaccaridi rafforzano la parete e hanno proprietà antigeniche.

Gli Archea non hanno peptidoglicano (pseudo peptidoglicano), altri hanno pareti fatte da proteine e/o altri polimeri. Nello pseudopeptidoglicano la prima componente è sempre NAG, ma l’altro aminozucchero è NAT.

NAG e NAT sono uniti dal legame alfa (1-3) e per questo motivo non viene riconosciuto né idrolizzato dal lisozima (non si formano i sacchi di peptidoglicano). Glu-Ala-Lys e Glu-Lys-Ala-Glu sono uniti tra loro da un ponte interpeptidico: le catene polimeriche sono formate da NAG-NAT collegate tramite ponti.

Nel caso dei Gram-negativi, una componente importante della parete è la membrana esterna.

Membrana esterna

È un’ulteriore ed efficiente barriera di permeabilità selettiva e aumenta la resistenza ad agenti estranei. Questa membrana ha una componente che è tossica per l’uomo ed altri animali, il lipide A. C’è un doppio strato lipidico: il più vicino allo spazio periplasmatico è formato da fosfolipidi identici a quelli della membrana interna; la differenza sta nello strato più esterno, costituito dagli LPS (lipopolisaccaridi), lipidi legati a polisaccaridi. La componente lipidica è il lipide A, che suscita la risposta infiammatoria (tossica); ad essa è legata la componente polisaccaridica.

Lipide A: due residui di glucosammina legati a catene di acidi grassi (con presenza significativa di gruppi fosfato). Uno dei due residui è legato a 2KDO, uno dei quali a sua volta è legato a un residuo di eptosio (Hep). Il complesso prende il nome di core interno. Il core esterno è più variabile e contiene zuccheri a 6 o 7 atomi di C. Al core saccaridico è legata la catena laterale O, costituita da unità tetra o pentataccaridiche ripetute che si estendono verso l’esterno della cellula.

Il lipide A è formato da un dimero di glucosammina, collegato a un dimero KDO (chetodesossiottonato). Lipide A e core polisaccaridico sono molto conservati nelle varie specie.

La membrana esterna è un’efficiente barriera di permeabilità e resistenza agli agenti tossici. Il lipide A suscita un’azione antinfiammatoria: nel sangue ci sono proteine che legano LPS, c’è trasduzione del segnale con produzione di citochine e altre componenti del sistema immunitario. Un eccesso porta al danneggiamento dell’ospite (shock settico).

Il lipide A viene definito endotossina termostabile; le esotossine sono invece proteine secrete da batteri con attività tossica specifica e sono termolabili.

Le porine sono proteine canale incaricate di far passare molecole idrofile o ioni attraverso la membrana esterna. La LAMB in E. Coli aumenta il flusso del maltosio. Sono spesso organizzate in complessi trimerici.

La parete cellulare permette la divisione dei batteri in Gram-positivi e Gram-negativi. Si può parlare di monoderma (una sola membrana, Gram +) e diderma (Gram -).

I Gram + si dividono in Actinobacteria e Firmicutes: i firmicuti hanno una sottoclasse particolare, i Corynebacteriaceae, che presenta un diderma privo di LPS.

Nelle Spirochete (Gram -), solo alcune specie sono diderme, ma manca l’outer membrane. Ci sono quindi delle eccezioni nella classificazione. Una di queste è la parete dei micobatteri, che ha una costituzione che devia da entrambi i modelli: il peptidoglicano è legato attraverso polisaccaridi a uno strato lipidico ceroso di acidi micolici, che a loro volta si legano a glicolipidi fenolici (alcuni Gram +, altri Gram -).

Altri batteri non hanno parete, ma solo membrana citoplasmatica. Le clamidie sono un esempio, patogeni intracellulari obbligati.

Capsula polisaccaridica

Ha proprietà adesive: i batteri della cavità orale producono la capsula in funzione della presenza di nutrienti (es saccarosio) e aderiscono alla dentina. Fimbrie e Pili hanno funzione simile, quando i pili servono al trasferimento del materiale genetico vengono detti sessuali.

Flagello

Il flagello può essere unico o in gruppi (anche su poli opposti) e serve al movimento della cellula batterica. Può essere suddiviso in una porzione basale una esterna di forma elicoidale. Nei Gram - la porzione basale è formata da un complesso integrale di membrana esterna, il disco L, collegato al disco P, che si colloca nello strato di peptidoglicano. Il disco C è il motore del flagello, che si muove in seguito alla rotazione. È regolato soprattutto da fattori ambientali: la forza proton motrice è utilizzata come ‘benzina’ per far ruotare l’anello. Non viene usato direttamente ATP. La flagellina viene esportata verso la regione apicale, che è il punto di assemblaggio, attraverso lo stesso flagello in crescita.

Nei Gram + sono presenti due anelli, uno a livello della membrana cellulare e uno nello strato di peptidoglicano.

Grazie al flagello i batteri possono essere chemiotattici: si avvicinano ai nutrienti e si allontanano dai repellenti. In una soluzione priva di gradienti di nutriente, le cellule cambiano direzione più frequentemente con avanzamenti più brevi; in presenza del gradiente aumenta il tempo di rotazione del flagello: le cellule mostrano una chemiotassi positiva, per cui i capovolgimenti sono meno frequenti e gli avanzamenti più lunghi.

Riproduzione e biogenesi della membrana

I procarioti si riproducono per divisione binaria. Bisogna coordinare aumento di massa e duplicazione del genoma, si forma un setto tra le due cellule e i due cromosomi vengono ripartiti (legati all’involucro). La proteina Ftsz ha proprietà contrattili e uno dei suoi ruoli è formare un anello in corrispondenza del setto: contraendosi provocherà la formazione di una strozzatura che porterà alla divisione cellulare.

Biogenesi di membrana

Peptidoglicano: Avviene in tre diversi siti della cellula: citoplasma, membrana citoplasmatica e periplasma. La biosintesi dei precursori, gli aminozuccheri NAM e NAG, avviene nel citoplasma, la sintesi dell’unità monometrica a livello della membrana.

Inizia con la sintesi di NAG a partire dal fruttosio 6-fosfato:

• Fruttosio 6P —> Glucosammina 6P —> (isomerasi) Glucosammina 1P —>(acetilazione) N-acetilglucosammina 1P.

È attivata da un carrier.