Microbiologia

RESTRIZIONE E MODIFICAZIONE

E. coli K restringe la crescita del batteriofago X proveniente da E. coli C. Coli C non

resitringe la crescita di lambda proveniente da Coli K.

Il DNA di Coli K-12 è modificato grazie a una metiltranferasi specifica che metila residui

adenosinici che fanno parte di brevi sequenze specifiche (Modificazione). Durante la

replicazione l’elica neosintetizzata non è metilata e i siti specifici risultano liberi.

E. coli K12 possiede una endonucleasi che riconosce gli stessi siti della metiltransferasi: se

non sono metilati l’enzima taglia il DNA, che verrà poi completamente degradato da

nucleasi (Restrizione).

I geni di questi enzimi si trovano a livello plasmidico. I sistemi di tipo I e III sono

biochimicamente complessi e non tagliano il DNA al sito di riconoscimento. Il tipo II è

costituito da due enzimi distinti, che lavorano indipendentemente: endonucleasi di

restrizione, metiltransferasi di modificazione. Gli enzimi di restrizione creano estremi che

sono un buon substrato per la DNA lipasi che li congiunge covalentemente.

REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA

Il genoma contiene regioni che portano segnali per l’espressione di proteine o RNA,

regioni codificanti e non codificanti. È necessario segregare il patrimonio genetico. Da un

punto di vista regolato ci possono essere diversi livelli: trascrizionale o traduzionale (post-

trascrizionale), può essere regolata anche dalla stabilità del messaggero (degradazione).

Una proteina può essere anch’essa regolata coinvolgendo la sua stabilità o cambiandone

l’attività attraverso modificazione covalente o effetto allosterico (il legame dell’effettore

allosterico all’enzima porta a un’inibizione della sua attività).

Nei procarioti troviamo operoni, gruppi di geni cotrascritti. Ci sono sequenze chiamate

terminatori trascrizioni che segnano la fine della trascrizione.

Apparato trascrizionale dei procarioti:

- RNA polimerasi (sensibile a Rifampicina nei batteri, non negli Archea). Nei batteri è

costituita da quattro subunità: alfa, beta, beta’ e sigma. Alfa ha dominio N-terminale che

si lega a BetaBeta’ e collegato da un linker alla C terminale che lega il DNA. Sigma

riconosce in modo specifico il promotore (-35, -10 a monte del sito d’inizio); assiste

anche all’apertura della doppia elica, che segna l’inizio della trascrizione. Alfa2BetaBeta’

è chiamato enzima CORE (in grado di polimerizzare) con sigma associato prende il

nome di oloenzima. In Archea si trovano subunità alfa, beta e beta’ simili a quelle dei

batteri ed eucarioti, sigma invece è diversa.

- Inizio: il complesso CORE è in equilibrio con il DNA e sembra totalmente indifferente

alla presenza del promotore. Se si aggiunge la sigma aumenta tantissimo l’affinità tra

RNA polimerasi e promotore. Una volta iniziata la trascrizione, sigma si stacca ed è solo

la CORE proseguire con la polimerizzazione. In E. coli esistono tanti fattori sigma: il

sigma70 è il principale, gli altri riconoscono sequenze diverse (sigma32 heat shock,

sigma54 utilizzazione dell’azoto, sigma38 fase stazionaria o altri stress, sigma24 stress

vari, sigma28 biosintesi dei flagelli). Sigmuloni: gruppi di geni che vengono trascritti da

uno stesso fattore sigma.

- Terminazione: durante l’allungamento alcune sequenze fanno entrare in stallo la

polimerasi. Se la trascrizione non riprende si parla di terminazione. Ci sono terminati

intrinseci, sequenze ripetute invertite che assumano strutture a forcina ricche in G-C.

Quando la RNA polimerasi incontra queste sequenze si blocca. L’interazione della

polimerasi con la forcina provoca il rilascio dal DNA stampo dell’enzima. La

terminazione Rho dipendente richiede la presenza di una proteina Rho che interagisce

con una sequenze specifica del trascritto. Su muove verso la polimerasi e riesce a

raggiungerla quando fa una pausa, promuovendone il distacco. Se si ha carenza di

amminoacidi Rho viene impiegata per fermare la trascrizione.

OPERONE TRIPTOFANO

Tra il sito operatore e i geni si trova un sito L (leader), che regola la sintesi di triptofano. Il

repressore che si lega all’operatore ha affinità per il triptofano: se ne è presente poco la

sintesi è attivata, in caso contrario repressa. I mutanti del repressore lo sintetizzano anche

in sua presenza. Attenuazione: terminazione prematura della trascrizione (solo quando

Trp +); la regione L contiene un piccolo gene, TrpL e un sito attenuatore che possiede un

terminatore intrinseco di trascrizione. Queste strutture promuovono il distacco della

polimerasi, la struttura di terminazione è preceduta da un loop di pausa, dato dalla

formazione di struttura secondaria nella regione 1 e nella 2 del sito L. Quando le regioni 2

e 3 formano un loop di antiterminazione, la RNA polimerasi è stimolata a procedere verso

i geni dell’operone. La formazione dei loop è dipendente dalla concentrazione di

triptofano; la diversa posizione del ribosoma sulla catena a seconda o meno della presenza

di Trp, porta alla formazione dei loop. Il ribosoma in stallo va a proteggere la regione 1 (sui

codoni Trp Trp, Trp assente): loop di antiterminazione (2-3); se il ribosoma avanza

(presenza di Trp) va a coprire la regione 2 e verrà forzata la produzione del loop di

terminazione (1-2). Il loop di pausa si forma prima dell’arrivo del ribosoma.

Il legame del triptofano all’antranilato sintetasi porta a regolazione allosterica.

Una modificazione covalente molto utilizzata è la fosforilazione, che influenza l’attività di

un regolatore trascrizionale (sistemi a due componenti). Viene stimolata la formazione di

multimedia che hanno maggiore affinità per il DNA; si comportano o da attivatori o da

repressori a seconda della posizione rispetto a -10 e -35. Agiscono sempre in coppia con un

sensore, solitamente una chinasi in grado di percepire stimoli ambientali (seconda

componente), in grado di autofosforilarsi e di fosforilare l’attivatore/repressore. In alcuni

casi un’unica proteina fa sia da sensore che da regolatore trascrizionale. Sono molto

diffusi: approvvigionamento di nutrienti, metabolismo energetico, virulenza

(trasferimento plasmidi, produzione di tossine), vie di differenziamento.

La diversità morfologica non rispecchia la più grande diversità genetica. La diversità

biochimica, metabolica, fisiologica dei procarioti è grandissima e riflette le innumerevoli

strategie messe in atto per ottenere materia e energia.

Come si è originata la diversità? La teoria fissista è contraddetta dalla paleontologia ed è

stata rimpiazzata dalla teoria evoluzionistica (gli organismi cambiano, anche se

lentamente).

Il progenitore è comune (LUCA) e ha dato origine alla varietà attuale. Può essere

ricostruita una filogenesi; durante la crescita possono esserci mutazioni che provocano

cambiamenti fenotipici. In base alla filogenesi è possibile costruire una classificazione

naturale. È più difficile sviluppare un sistema naturale di classificazione per Procarioti

rispetto a piante e animali.

TASSONOMIA DETERMINATIVA

Anche i batteri sono stati ordinati in Taxa, di ordine gerarchico crescente. Non era possibile

applicare la definizione di specie utilizzata per piante e animali (organismi interfecondi,

prole fertile).

Specie procariotiche: insieme di ceppi (isolati) che presentano caratteristiche in comune

che li differenziano da altri ceppi, con grado elevato di somiglianza fenotipica. Un’altra

definizione: insieme di ceppi con similarità DNA/DNA >70% (% ibridazione).

Il nome della specie è finito da due termini in latino corsivo (nomenclatura binomia) che

indicano genere e specie. Possono avere un valore descrittivo e si possono riferire a

caratteri metabolici, morfologico-cromatici…

Caratteristiche generalmente utilizzate:

- Struttura parete (Colorazione Gram)

- % G-C nel genoma

- Temperatura ottimale e intervallo di crescita

- Capacità di trasportare endospore

- Tipo di accettore di elettroni per respirazione/fermentazione

- Capacità di fare fotosintesi

- Motilità

- Morfologia della cellula

- Fonti di C e N utilizzabili (zuccheri-ammonio, N2, nitrato..)

- Auxotrofie

- Composizione lipidi di membrana

- Antigeni di superficie

Isolamento batteri dall’intestino di un mammifero: ottengo una cultura pura: colorazione

Gram (negativo) —> morfologia cellulare, bastoncelli —> metabolismo, aerobio facoltativo

—> fermenta lattosio producendo acido e gas —> altri saggi biologici. Risulta essere E.

coli.

TASSONOMIA NUMERICA

Considerare un numero elevato di caratteri alternativi, caratterizzare i ceppi in base ai

caratteri considerati, confrontare i ceppi e stabilire concordanze e divergenze. Assomiglia a

una classificazione genetico-molecolare, ma a livello fenotipico. Le macromolecole

informazionali (DNA, RNA, proteine) sono adatte per ricostruire alberi filogenetici.

d = distanza evolutiva = (N caratteri diversi / Totale caratteri) x 100

Caratteristche di un marcatore genetico:

1. Il gene deve essere presente in tutti gli organismi presi in considerazione

2. Le copie del gene devono mostrare un livello appropriato di conservazione di

sequenza, tale per cui si possa postulare un’origine comune (OMOLOGIA)

3. Il gene deve essere stato ereditato in tutte le specie per trasmissione verticale e non

deve essere soggetto a trasferimento orizzontale

I più utilizzati sono i geni che codificano per la subunità piccola del ribosoma (ma anche

DNA polimerasi, purine e pirimidine, ciclo TCA, proteine Heat-shock, parete cellulare

biosintesi aa e cofattori…). Gli rRNA sono presenti in tutti gli organismi viventi; 16S/18S è

abbastanza piccolo, ma sufficientemente informativo: alcune regioni non tollerano

sostituzioni, sono quindi adatte per allineare sequenze diverse. Altre regioni cambiano

poco frequentemente, sono adatte per identificare diramazioni antiche (viceversa regioni

variabili identificano diramazioni recenti). La presenza di regioni conservate combinate

con tecniche di amplificazione del DNA permettono una rapida classificazione.

L’albero filogenetico universale è stato proposto da Carl Woese negli anni ’80 ed è basato

sul confronto delle sequenze firma dell’rRNA.

INTERAZIONI MICRO-MARCO ORGANISMO

Gli organismi animali sono ottimi ambienti per la sopravvivenza e la crescita di numerosi

organismi. Ad esempio: pelle, cavità orale, stomaco, intestino, tratto respiratorio e

gastrourinario.

I macrorganismi dipendono o giovano dalla presenza dei microrganismi; le interazioni

possono essere positive o negative (simbiosi e commensalismo positive, parassitismo

negativo). Le infezioni i